Η χρήση της βιοπληροφορικής σε βιολογικά δεδομένα υψηλής απόδοσης είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη δημιουργία νέα γνώσης. Στην παρούσα εργασία αναλύεται ένα σύνολο δεδομένων που αφορά στα σημεία έναρξης της αντιγραφής (αφετηρίες) στο ζυμομύκητα Schizosaccharomyces pombe, όπως αναγνωρίστηκαν από πειράματα μικροσυστοιχιών που κάλυπταν όλο το μήκος του γονιδιώματος του οργανισμού (full genome). Οι αντιγραφή ξεκινάει από μεγάλο αριθμό αφετηριών οι οποίες βρίσκονται διάσπαρτες σε όλο το γονιδίωμα και μέχρι τώρα οι περισσότερες μελέτες των χαρακτηριστικών των αφετηρίων είχαν πραγματοποιηθεί για περιορισμένο αριθμό αυτών. Στην εργασία αυτή αναλύονται για πρώτη φορά τα χαρακτηριστικά του συνόλου των αφετηριών του S. pombe με σκοπό να διαπιστωθεί ποια χαρακτηριστικά καθορίζουν πότε μια περιοχή του γονιδιώματος μπορεί να δράσει ως αφετηρία αντιγραφής. Από την ανάλυση αυτή προκύπτει ότι: 1. Οι αφετηρίες έχουν υψηλότερο μέγιστο περιεχόμενο ΑΤ από άλλες γονιδιωματικές περιοχές. 2. Οι αφετηρίες εντοπίζονται κατά προτίμηση σε μεγάλες διαγονιδιακές περιοχές ανάμεσα σε αποκλίνουσες μεταγραφικές μονάδες. 3. Η ασυμμετρία κατανομής Α και Τ ενδέχεται να αποτελεί δείκτη των αφετηριών. 4. Η απόδοση έχει συσχέτιση με το περιεχόμενο ΑΤ. / Use of Bioinformatics in high-throughput biological data is a promising approach for creation of new knowledge. In this work we analyze a dataset that concerns origins of DNA replication initiation in the yeast Schizosaccharomyces pombe, that were identified through full genome microarray experiments. DNA replication starts from a large number of origins that span the entire genome and until recently most studies of origins of replication have been carried out only for a limited number of them. Here we analyze for the first time the properties of the entire dataset of origins of replication in S. pombe in order to find out which specific properties define which genomic location can function as an origin of replication. From this analysis we found that: 1. Origins of replication have higher maximum AT (adenine-thymine) content than other genomic locations. 2. Origins of replication are found preferentially in large genomic locations between divergent transcriptional units. 3. AT asymmetry might be a marker of origins of replication. 4. The origin of replication firing efficiency is correlated with AT content.

Η διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας προϋποθέτει τη σωστή διαδοχή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου. Σημαντικό μηχανισμό ελέγχου αποτελεί η αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA, η οποία εξασφαλίζει την πλήρη αντιγραφή του γονιδιώματος μία μόνο φορά κατά τη διάρκεια κάθε κυτταρικού κύκλου. Η διαδικασία αυτή λαμβάνει χώρα στο τέλος της μίτωσης και κατά τη φάση G1 και περιλαμβάνει τη συγκρότηση των προ-αντιγραφικών συμπλόκων στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Τα σύμπλοκα αυτά απαρτίζονται από τις πρωτεΐνες MCM2-7 οι οποίες έχουν ενεργότητα ελικάσης. Σημαντικό παράγοντα αδειοδότησης αποτελεί η πρωτεΐνη Cdt1, η οποία συσσωρεύεται κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και απαιτείται για τη στρατολόγηση των ελικασών MCM2-7 στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Στα μετάζωα, η πρωτεΐνη Geminin, η οποία εκφράζεται κατά τις φάσεις S, G2 και Μ, αποτελεί αναστολέα του παράγοντα Cdt1 και προσδένεται σε αυτόν παρεμποδίζοντας την αδειοδότηση της αντιγραφής. Αρκετές μελέτες έχουν καταδείξει ότι η εκτοπική υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 επάγει την επανέναρξη της αντιγραφής του DNA και τον υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος συμβάλλοντας στην ογκογένεση. Στο πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας μελετήθηκε η έκφραση του παράγοντα Cdt1 σε κλινικά δείγματα όγκων μαστού. Από την ανάλυση διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 υπερεκφράζεται στατιστικώς σημαντικά στην περιοχή του όγκου σε σύγκριση με τον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό, γεγονός που καταδεικνύει την πιθανή αξία του παράγοντα ως διαγνωστικού βιοδείκτη. Επιπλέον, η υπερέκφραση του συγκεκριμένου παράγοντα δείχθηκε ότι συσχετίζεται αντίστροφα με την παρουσία ή μη οιστρογονικών (ER) και προγεστερονικών υποδοχέων (PR). Επίσης, διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 και της έκφρασης του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 καθώς και του υποδοχέα HER2/neu. Οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι ο παράγοντας Cdt1 ενδέχεται να αποτελεί δείκτη άσχημης πρόγνωσης στον όγκο μαστού. Επιπλέον η ανάλυση κατέδειξε σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 σε όγκους θετικούς για τον υποδοχέα HER2/neu σε σύγκριση με τα περιστατικά που δεν εξέφραζαν τον υποδοχέα. Δεδομένου ότι στο 95% των περιπτώσεων όγκων μαστού όπου διαπιστώνεται υπερέκφραση του υποδοχέα HER2/neu, αυτή οφείλεται σε ενίσχυση του αντίστοιχου γονιδίου, διερευνήθηκε κατά πόσο η γονιδιακή ενίσχυση θα μπορούσε να αποτελεί λειτουργική επίπτωση της ογκογόνου δράσης του παράγοντα Cdt1 στον όγκο μαστού. Η υπερέκφραση των παραγόντων αδειοδότησης Cdt1 και Cdc6 στις καρκινικές κυτταρικές σειρές HeLa και MCF7 είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη ανθεκτικών αποικιών στη μεθοτρεξάτη. Έχει δειχθεί ότι η ανθεκτικότητα στο φάρμακο αυτό οφείλεται κατά κύριο λόγο στη γονιδιακή ενίσχυση του ενζύμου διυδροφολική αναγωγάση (DHFR). Συνεπώς, είναι πιθανό η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 να συμβάλλει στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας μελετήθηκε η κινητική συμπεριφορά των πρωτεϊνών MCM2-7 με μεθόδους λειτουργικής μικροσκοπίας. Αρχικά αναπτύχθηκε ένα σύστημα μελέτης το οποίο βασίζεται στις μεθόδους FRAP και FLIP και επιτρέπει τη μελέτη της δυναμικής συμπεριφοράς των πρωτεϊνών MCM και κατ’ επέκταση τη χωροχρονική ποσοτική εκτίμηση της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα. Η ανάλυση της κινητικής των πρωτεϊνών MCM2 και MCM4 7. Περίληψη - Abstract - 212 - αποκάλυψε σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την αντίστοιχη του παράγοντα Cdt1, καθώς οι πρωτεΐνες MCM παρουσιάζουν πιο σταθερή αλληλεπίδραση με τη χρωματίνη. Επίσης, διαπιστώθηκε σταδιακή πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη με την πρόοδο της φάσης G1, περαιτέρω πρόσδεση μορίων MCM στο τέλος της φάσης αυτής και σταδιακή αποδέσμευση αυτών από τη χρωματίνη καθώς εξελίσσεται η φάση S. Πειράματα FLIP αποκάλυψαν ότι η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών MCM με τη χρωματίνη λαμβάνει χώρα σε συγκεκριμένες υποπυρηνικές περιοχές. Οι περιοχές αυτές αυξάνονται σε αριθμό με την πρόοδο της φάσης G1 και ελαττώνονται με την εξέλιξη της φάσης S. Η παρατήρηση των υποπεριοχών αυτών κατά τη φάση S κατέδειξε ότι δεν συμπίπτουν με τις υποδομές της πρωτεΐνης PCNA, γεγονός που υποδεικνύει ότι οι πρωτεΐνες MCM2-7 δεν εντοπίζονται στις περιοχές σύνθεσης του DNA. Επιπλέον, διερευνήθηκε η πιθανή επίδραση της πρωτεΐνης Geminin στην κινητική συμπεριφορά των πρωτεϊνών MCM. Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin είχαν ως αποτέλεσμα τη μείωση του δεσμευμένου κλάσματος των πρωτεϊνών MCM2 και MCM4 κατά τη διάρκεια της φάσης G1, καθώς και την αποσταθεροποίηση των ήδη δεσμευμένων μορίων στο τέλος της φάσης αυτής. Επίσης, η απουσία της πρωτεΐνης Geminin είχε ως αποτέλεσμα την αδυναμία των κυττάρων να εισέλθουν στη φάση S. Συμπερασματικά, στο πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας καταδείχθηκε η πιθανή αξία του παράγοντα Cdt1 ως διαγνωστικού και προγνωστικού βιοδείκτη στον όγκο μαστού. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 πιθανώς συμβάλλει στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης, παρατήρηση που προτείνει ένα νέο μηχανισμό ογκογόνου δράσης του παράγοντα αυτού. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας διαπιστώθηκε ότι η κινητική των πρωτεϊνών MCM2 και MCM4 αλλάζει κατά τη διάρκεια των φάσεων G1 και S. Επίσης, η πρωτεΐνη Geminin δείχθηκε ότι απαιτείται για την πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη και για την πρόοδο των κυττάρων από τη φάση G1 στη φάση S, παρατήρηση που καταδεικνύει ένα πιθανό θετικό ρόλο της πρωτεΐνης Geminin στην αντιγραφή του DNA. / Tight regulation of the DNA replication initiation is crucial for the maintenance of genomic integrity. Faithful replication in time and space is ensured by a process called DNA licensing, which takes place in late mitosis and during G1 phase. Licensing involves the stepwise assembly of pre-replicative complexes at origins of replication. These complexes render DNA origins competent to initiate replication. Cdt1 is an essential regulator of DNA licensing that accumulates only in G1 phase of the cell cycle and is required for the recruitment of MCM2-7 helicases onto replication origins. In metazoans, Cdt1 is negatively regulated by a protein called Geminin, which is expressed from S to M phases. Geminin binds to Cdt1 preventing replication licensing. Several lines of evidence suggest that Cdt1 overexpression in cell lines and animals drives rereplication and contributes to genomic instability. In the first part of this thesis, Cdt1 expression levels were analyzed in breast cancer specimens. Cdt1 protein expression was correlated to clinicopathological parameters of the disease, proliferation index and HER2/neu status. Analysis revealed that Cdt1 was statistically significantly overexpressed in the invasive tumor areas compared to adjacent non-neoplastic tissue. Moreover, a significant inverse correlation was established between Cdt1 expression levels and oestrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PR) status. A significant positive correlation of Cdt1 expression with the proliferation index Ki67 was demonstrated. These observations imply that Cdt1 may constitute a useful prognostic and diagnostic biomarker for breast cancer. Additionally, Cdt1 expression levels were significantly higher in HER2/neu score 3+ tumors (known to show HER2/neu gene amplification by FISH in 95% of cases) compared to HER2/neu negative tumors (known to show HER2/neu gene amplification by FISH in only 0-7% of cases). This observation prompted us to investigate whether gene amplification is a direct consequence of Cdt1 overexperssion. To this end, Cdt1 and Cdc6 were overexpressed in HeLa and MCF7 cell lines. The overexperssion of these licensing factors resulted in the generation of methotrexate resistance colonies. Given that the major cause of resistance to methotrexate is the increased expression levels of the enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) due to gene amplification, it is probable that Cdt1 overexpression may lead to this type of genomic instability. In the second part of this thesis, live cell imaging techniques were used to assess dynamics of licensing within the cell nucleus. In particular, we established an in vivo licensing assay, which is based on FRAP and FLIP techniques and permits the investigation of the kinetics of MCM helicases within live human cells. FRAP analysis of GFP-MCM2 and GFP-MCM4 kinetics revealed that MCMs maintain stable association with chromatin during G1 phase in contrast to Cdt1, which exhibits transient interaction with chromatin throughout G1 phase. Moreover it was shown that MCMs are gradually bound to chromatin as G1 phase progresses, being maximally bound in late G1, before the onset of DNA replication and are displaced from chromatin during the course of S phase. Fluorescence-Loss-In-Photobleaching (FLIP) experiments indicated that MCM-chromatin association is not homogenous throughout the nucleus but shows subnuclear concentrations which differ as cells progress through G1 and are adjacent to sites of ongoing DNA synthesis in S phase cells. Moreover, it was shown that Geminin is required for MCM proteins being stably bound to chromatin as well as for proper progression of 7. Περίληψη - Abstract - 214 - cells from G1 to S phase. Taken together our results suggest additional levels of regulation of MCM chromatin association during G1 and S phases. Furthermore, Geminin appears to have a positive regulatory role in DNA replication.

Μηχανισμοί οι οποίοι εξασφαλίζουν τη σωστή διαδοχή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου συμβάλλουν στη διασφάλιση της γονιδιωματικής σταθερότητας των κυττάρων. Η αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA, η συγκρότηση επί των αφετηριών της αντιγραφής του DNA του προ-ανιγραφικού συμπλόκου, καθορίζει τη σωστή χρονικά και τοπικά έναρξη της αντιγραφής. Βασικό συστατικό αυτού του συμπλόκου είναι ο παράγοντας Cdt1. Η Geminin προσδένεται στο Cdt1, αναστέλοντας τη δράση του από την S μέχρι και την Μ φάση, παρεμποδίζοντας, έτσι, την αδειοδότηση της αντιγραφής. Παρά το οτι φυσική αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών έχει δειχθεί τόσο in vitro όσο και in vivo, προηγούμενες μελέτες δείχνουν οτι έκφραση των Cdt1 και Geminin εντοπίζεται σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Τα φυσιολογικά κύτταρα, ανάλογα με τα μηνύματα που δέχονται, είτε παραμένουν σε μιτωτικό κύκλο, είτε εξέρχονται από αυτόν προς φάση ηρεμίας (ή G0), διαφοροποίηση ή γήρανση. Αυστηρός συντονισμός των παραπάνω διαδικασιών είναι απαραίτητος προκειμένου να διασφαλιστεί η ομοιόσταση των πολύπλοκων δομών των ιστών των μεταζώων. Προηγούμενες μελέτες προτείνουν το σύστημα της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA ως έναν βασικό ρυθμιστή της εξόδου από τον κυτταρικό κύκλο και της επανεισόδου στη G1. Οι παράγοντες Cdt1 και Geminin ρυθμίζονται αρνητικά κατά την έξοδο των κυττάρων σε G0, ενώ έκφρασή τους χαρακτηρίζει διαιρούμενα κύτταρα. Σε αντίθεση με τις άλλες καταστάσεις εκτός κυτταρικού κύκλου, λίγα είναι γνωστά αναφορικά με τη ρύθμιση των Cdt1 και Geminin κατά την κυτταρική γήρανση. Στο πρώτο μέρος της διατριβής εστιαστήκαμε στη μελέτη του προτύπου έκφρασης των Cdt1 και Geminin κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου πρωτογενών ανθρώπινων ινοβλαστών, και στη σύγκρισή του με εκείνο των καρκινικών κυττάρων. Διαπιστώσαμε οτι τόσο η ενδοκυτταρική εντόπιση όσο και η ικανότητα των Cdt1 και Geminin να εκφράζονται σε συγκεκριμένες φάσεις του κυτταρικού κύκλου, δεν διαφοροποιούνται στους πρωτογενείς φυσιολογικούς ινοβλάστες σε σχέση με κύτταρα που προέρχονται από καρκινικό ιστό. Επιπλέον, δείξαμε οτι ο παράγοντας Cdt1 εκφράζεται αποκλειστικά σε BrdU-αρνητικά κύτταρα, σε αντίθεση με την Geminin, η οποία δείχνει να συσσωρεύεται σταδιακά μετά την έναρξη της S φάσης, ενώ δεν εντοπίστηκε συνέκφραση των δύο πρωτεϊνών στο χρονικό παράθυρο της G1/S μετάβασης. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας εστιαστήκαμε στη μελέτη της έκφρασης του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1 και του αρνητικού ρυθμιστή αυτού, Geminin, κατά την είσοδο των κυττάρων σε κυτταρική γήρανση και εξετάσαμε την πιθανή λειτουργική εμπλοκή τους στην εξέλιξη του φαινομένου. Δείξαμε οτι, ενώ οι παράγοντες Cdt1 και Geminin διατηρούν τη σωστή ενδοκυτταρική εντόπιση και το σωστό πρότυπο έκφρασης κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, υφίστανται αρνητική ρύθμιση σε κύτταρα που εισέρχονται σε κυτταρική γήρανση, τόσο αναπαραγωγική όσο και πρόωρη, επαγόμενη από οξειδωτικό στρες. Το γεγονός οτι η μείωση της έκφρασης της Geminin προηγήθηκε της εμφάνισης του γηρασμένου φαινοτύπου, μας ώθησε στην περαιτέρω διερεύνιση του λειτουργικού ρόλου της Geminin στην επαγωγή της κυτταρικής γήρανσης. Για το σκοπό αυτό, απορρυθμίσαμε τα επίπεδα έκφρασης της Geminin σε πρωτογενή φυσιολογικά κύτταρα ανθρώπου και ποντικού, αξιοποιώντας την τεχνολογία του RNAi και ρετροϊικά συστήματα υπερέκφρασης γονιδίων αντίστοιχα. Δείξαμε οτι η μείωση της έκφρασης της Geminin σε ανθρώπινους ινοβλάστες (χρησιμοποιώντας siRNAs αλλά και pSUPER πλασμιδιακούς φορείς αποσιώπησης γονιδίων που κατασκευάστηκαν ειδικά για την Geminin) επάγει αύξηση της κυτταρικής γήρανσης της καλλιέργειας. Επιπλέον, κύτταρα που στερούνταν της έκφρασης της Geminin ήταν πιο επιρρεπή σε γήρανση επαγόμενη από οξειδωτικό στρες, σε σχέση με τα κύτταρα-μάρτυρες. Ετεροζυγώτες για το γονίδιο της Geminin εμβρυικοί ινοβλάστες ποντικού εμφάνιζαν μεγαλύτερα ποσοστά κυτταρικής γήρανσης σε σχέση με τους αντίστοιχους ινοβλάστες αγρίου τύπου. Αντίθετα, αύξηση των επιπέδων της Geminin σε αγρίου τύπου εμβρυικούς ινοβλάστες ποντικού προκάλεσε μείωση της εμφανιζόμενης γήρανσης. Τέλος, η μείωση των επιπέδων έκφρασης του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1 σε ανθρώπινα κύτταρα ήταν, επίσης, σε θέση να επάγει ισχυρό φαινότυπο κυτταρικής γήρανσης. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματα μας αναδεικνύουν την κρισιμότητα του ισοζυγίου Cdt1:Geminin στα κύτταρα, και προτείνουμε οτι η διατάραξη της ισορροπίας αυτής είναι ικανή να επάγει κυτταρική γήρανση, μέσω διαδικασιών όπως η υπεραδειοδότηση ή η υποαδειοδότηση της αντιγραφής του DNA. / Genome integrity relies on the strict alternation of S and M phases of the cell cycle, so that one and only round of DNA replication takes place per cell cycle. This is achieved through replication licensing, which involves the formation of a multi-protein complex, the pre-replicative complex, onto origins of replication. Cdt1 is a crucial component of this complex and Geminin, a small protein shown to tightly bind Cdt1, inhibits its licensing function from S to M phase, when licensing is illegitimate. Although previous experimental evidence shows that Cdt1 and Geminin are expressed in different phases of the cell cycle, physical interaction between these two proteins has been demonstrated in vitro as well as in vivo. The fate of a normal cell is not perpetual division. Cells may exit the mitotic cell cycle to enter quiescence, to terminally differentiate or to senesce. These “out-of-cycle-states” must be strictly regulated in order to establish and maintain the hierarchical organization of complex tissues in metazoa. Replication licensing has been proposed to coordinate cell-cycle exit and re-entry in vitro and in metazoan tissues. Cdt1 and Geminin down-regulation during exit to quiescence supports the idea that their expression correlates with cell proliferation. In contrast to other out-of-cycle states, little is known about the regulation of Cdt1 and Geminin expression during cellular senescence. Senescence refers to the irreversible resting state of cells grown for succeeding passages in culture, as a response to DNA damage caused by telomeres erosion. Other stimuli, such as oxidative or oncogenic stress, may force mitotically competent cells to respond similarly, a phenomenon termed as Stress Induced Premature Senescence (SIPS). The first part of this work focused on the study of the expression patterns of Cdt1 and Geminin during the unperturbed cell cycle of primary human fibroblasts and compared to that of tumor-derived cell lines. The cell cycle specific expression and the intracellular localization of both proteins, as assessed at a single-cell level using indirect immunofluorescence and a new monoclonal antibody against Geminin, appear similar in primary fibroblasts compared to the cancer cells examined. Cdt1 is strictly expressed in BrdU-negative cells, whereas Geminin starts accumulating after S phase onset. The two proteins are, therefore, not co-expressed at the ”time-window” of G1/S transition of the cell cycle. We showed that Cdt1 levels, but not those of Geminin, are mainly regulated in a proteasome-dependent way during normal cell cycle of human primary and cancer cells. The second part of this work focused on the investigation of Cdt1 and Geminin during cellular senescence and their possible role in the establishment of the senescence phenotype. To this end, primary human fibroblasts were maintained in culture for succeeding passages in order to induce them to undergo replicative senescence. Alternatively, an H202-induced senescence protocol was applied to force cells to undergo premature senescence (Stress-Induced Premature Senescence/SIPS). We show that, although Cdt1 and Geminin retain their nuclear localization and are correctly expressed during specific phases of the cell cycle during both replicative and Η202-induced premature senescence, their expression levels are down-regulated. In SIPS-experiments, Geminin down-regulation is an early event during the establishment of the senescent-phenotype, as assessed by senescence-associated β-Galactosidase and BrdU incorporation assays. This prompted us to further examine Geminin’s functional significance in the establishment of cellular senescence. To achieve this, we interfered with Geminin expression levels in human and mouse cells. Using RNA interference techniques, we were able to show that Geminin depletion from human cells is able to induce a senescent-phenotype in a fraction of the treated culture. Similarly, Geminin-depleted human cells were more susceptible to Η202-induced premature senescence, compared to control cells. Heterozygotes for Geminin mouse embryonic fibroblasts were more prone to senescence compared to their control counterparts. In contrast, when Geminin was over-expressed in control mouse embryonic fibroblasts cultures, senescent phenotype was reduced. Finally, a strong senescent-phenotype was induced when the licensing regulator, Cdt1, was silenced within human cells. Taken together, we conclude that Cdt1:Geminin balance within cells is crucial, and when disturbed, is able to promote a senescent phenotype, possibly through a mechanism that involves over- or under-licensing of DNA replication.

Η αδειοδότηση της αντιγραφή του DNA συνίσταται στη συγκρότηση προαντιγραφικών συμπλόκων στη χρωματίνη, στα οποία μετέχουν οι πρωτεΐνες ORC, Cdt1, Cdc6 και MCM2-7. Η πρωτεΐνη Cdt1 αποικοδομείται μετά από βλάβη στο DNA και ενδέχεται να συνδέει το σύστημα αδειοδότησης και το σύστημα απόκρισης σε βλάβη στο DNA. Στη διδακτορική αυτή διατριβή μελετήθηκε η αλληλεπίδραση των συστημάτων αδειοδότησης και απόκρισης σε βλάβη στο DNA με μεθόδους λειτουργικής μικροσκοπίας σε ανθρώπινα κύτταρα, εστιάζοντας στους παράγοντες αδειοδότησης Cdt1 και MCM4. Ο παράγοντας Cdt1 μελετήθηκε μετά από καθολική και εντοπισμένη έκθεση ανθρώπινων κυττάρων σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Δείχθηκε ότι ακτινοβόληση με UV οδηγεί στην αποικοδόμηση του παράγοντα Cdt1 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Ο χρόνος αποικοδόμησης της πρωτεΐνης Cdt1 όμως διαφοροποιείται σημαντικά ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο και συγκεκριμένα παρουσιάζει καθυστέρηση στην κυτταρική σειρά καρκινώματος μαστού MCF7 σε σχέση με άλλες καρκινικές σειρές (HeLa, U2OS) και φυσιολογικούς ανθρώπινους ινοβλάστες. Μελέτη της πρωτεΐνης Cdt1 στο χώρο μετά από εντοπισμένη ακτινοβόληση μιας μικρής υποπεριοχής του πυρήνα έδειξε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης από υπεριώδη ακτινοβολία πριν από την αποικοδόμηση της. Παράλληλα, παρατηρήθηκε συσσώρευση στην περιοχή της βλάβης από UV των πρωτεϊνών PCNA, Cdt2 (συστατικό του Cul4-DDB1Cdt2 συστήματος ουβικουιτίνωσης, που είναι υπεύθυνο για την αποικοδόμηση του παράγοντα Cdt1), καθώς και της πρωτεΐνης p21 που στοχεύεται από το ίδιο σύστημα. Πειράματα επαναφοράς φθορισμού σε ζωντανά κύτταρα (Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP) έδειξαν ότι στις περιοχές εντοπισμένης ακτινοβόλησης με UV οι πρωτεΐνες Cdt1, Cdt2, PCNA και p21 εμφανίζουν τροποποιημένη κινητική συμπεριφορά. Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 ανέδειξαν έναν ανασταλτικό ρόλο για το Cdt1 στο μονοπάτι επιδιόρθωσης διπλών θραύσεων με ομόλογο ανασυνδυασμό κατά τη διάρκεια της G1 φάσης. Στο δεύτερο μέρος αυτής της εργασίας, εισάγαμε μια νέα in vivo μέθοδο μελέτης της αδειοδότησης που στηρίζεται στην εφαρμογή της FRAP τεχνικής σε MCF7 κύτταρα σταθερά διαμολυσμένα με την πρωτεΐνη MCM4 σημασμένη με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη GFP (GFP-MCM4). Η μέθοδος αυτή επιτρέπει τη μελέτη της κινητικής συμπεριφοράς της πρωτεΐνης MCM4 σε ζωντανά κύτταρα και σε πραγματικό χρόνο. Δείχθηκε ότι το σύστημα αναπαράγει τη λειτουργία της ενδογενούς MCM4 πρωτεΐνης και μπορεί να διακρίνει επιτυχώς μεταξύ αδειοδοτημένης και μη κατάστασης. Ακολούθως, το σύστημα χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί η επίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας στην αδειοδότηση της χρωματίνης για αντιγραφή. Διαπιστώθηκε ότι επίδραση με υπεριώδη ακτινοβολία οδηγεί σε μείωση του κλάσματος της MCM4 που είναι προσδεδεμένο στη χρωματίνη. Περαιτέρω μέλετη έδειξε ότι η μείωση αυτή παρουσιάζεται στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και περιορίζεται στην περιοχή της βλάβης, δείχνοντας ότι αποτελεί εντοπισμένη απόκριση του κυττάρου στην ύπαρξη βλάβης. Συμπερασματικά, η συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή ανέδειξε την αλληλεπίδραση των συστημάτων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA και της κυτταρικής απόκρισης σε βλάβη στο DNA και εισήγαγε μια νέα μέθοδο μελέτης της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA. Μελετήθηκαν οι παράγοντες του συστήματος αδειοδότησης Cdt1 και MCM4, οι οποίοι αποκρίνονται στη βλάβη στο DNA, με το Cdt1 να παίζει ρόλο στην επιλογή επιδιορθωτικού μηχανισμού μετά από πρόκληση βλάβης διπλών θραύσεων του DNA και την πρωτεΐνη MCM4 να εμφανίζει μειωμένη πρόσδεση στη χρωματίνη στην περιοχή της βλάβης μετά από ακτινοβόληση με UV. / Licensing DNA for replication involves the formation of pre-replicative complexes on chromatin, consisting of the proteins ORC, Cdt1, Cdc6 and MCM2-7. Cdt1 is degraded following DNA damage and this suggests a regulatory crosstalk between DNA licensing and DNA damage response (DDR) systems. Here the molecular interplay between these two systems was studied in human cell cultures. The kinetics of Cdt1 degradation in response to UV irradiation was shown to differ in different human cell lines, exhibiting a delay in MCF7 cells in comparison to HeLa, U2OS and human fibroblasts, which implies a difference in the DDR sensitivity of these cells. By studying the spatial regulation of Cdt1 in response to localized DNA damage, the accumulation of Cdt1 in UV irradiated sites prior to its degradation was recorded. Proteins participating in the degradation of Cdt1 through ubiquitin dependent proteolysis (PCNA and Cdt2), as well as protein p21 which is targeted by the same ubiquitin ligase following DNA damage, were also shown to accumulate at UV irradiated sites. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) experiments showed that Cdt1, Cdt2, PCNA and p21 exhibit altered kinetics at UV irradiated sites. Silencing of Cdt1 expression revealed an inhibitory role of Cdt1 in the repair of double strand breaks through homologous recombination during the G1 phase of the cell cycle. In the second part of this thesis, we introduced an in vivo licensing assay based on FRAP in MCF7 cells stably expressing MCM4 tagged with the Green Fluorescent Protein (GFP). This assay allows the study of the kinetic behaviour of MCM4 in live cells and in real time. A plasmid expressing GFP-MCM4 was constructed and MCF7 cells stably expressing this plasmid were produced. The GFP-MCM4 cell line was further characterized to ensure a correct cell cycle profile, GFP-MCM4 levels, subcellular localization, interactions with other MCM proteins and binding to chromatin. FRAP experiments on the stable GFP-MCM4 cells verified that the assay could successfully distinguish between licensed and unlicensed state. Using this assay, the effect of UV irradiation on MCM4 kinetics was studied. UV irradiation led to a decrease in the fraction of MCM4 binding to chromatin. This effect was more profound in middle G1 phase and was restricted to the site of UV irradiation. In conclusion, this thesis addressed the interaction of DNA licensing and DNA damage response systems and introduced an in vivo DNA licensing assay. Licensing proteins Cdt1 and MCM4 were shown to respond to DNA damage, with Cdt1 affecting the double strand break repair choice pathway and MCM4 exhibiting reduced chromatin binding following UV irradiation.