Σκοπός της μελέτης ήταν η ανάδειξη της νεοαγγειογένεσης και ο προσδιορισμός της έκφρασης των VEGF-A, FGF-2, COX-2, AR και BCL-2 στην καλοήθη υπερπλασία και το αδενοκαρκίνωμα του προστάτη. Το υλικό αφορούσε σε δείγματα προστατικού ιστού μονιμοποιημένα και εγκλεισμένα σε παραφίνη, από 24 περιστατικά καλοήθους υπερπλασίας και 139 περιστατικά προστατικού αδενοκαρκινώματος. Τα τελευταία χωρίστηκαν περαιτέρω σε 3 υποομάδες (Grade I, II και ΙΙΙ) ανάλογα με το βαθμό διαφοροποίησης του νεοπλάσματος κατά Gleason (2-4, 5-7 και 8-10 αντίστοιχα). Χρησιμοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική μέθοδος Βιοτίνης-Στρεπταβιδίνης-Υπεροξειδάσης, και εφαρμόστηκε ημιποσοτική μέθοδος για την εκτίμηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης. Τα ευρήματά μας ανέδειξαν σαφή αύξηση της νεοαγγείωσης (MVD) στο αδενοκαρκίνωμα του προστάτη σε σχέση με την καλοήθη υπερπλασία, η οποία εμφάνισε στατιστικώς σημαντική θετική σχέση με το βαθμό κακοήθειας των προστατικών νεοπλασμάτων (ANOVA p<0.001) και με την έκφραση των VEGF-A και COX-2 (ANOVA p<0.001). Αναδείχθηκε αντίστροφη συσχέτιση της πυρηνικής έκφρασης του ανδρογονικού υποδοχέα (AR) με το βαθμό διαφοροποίησης των νεοπλασμάτων (p<0.0001) και την έκφραση του VEGF-A στο προστατικό στρώμα (p<0.001 Spearman r = -0.312). Η έκφραση της BCL-2 παρουσιάστηκε αυξημένη στα προστατικά αδενοκαρκινώματα και σχετίστηκε με το βαθμό διαφοροποίησης των νεοπλασμάτων (p<0.001) και την έκφραση των VEGF-A και COX-2 (p<0.001). Η έκφραση του VEGF-A σε όλα τα περιστατικά αδενοκαρκινώματος του προστάτη εμφάνισε στατιστικώς σημαντική σχέση με το βαθμό διαφοροποίησης των νεοπλασμάτων (p<0.0001). Ωστόσο στα πτωχής διαφοροποίησης αδενοκαρκινώματα η μέση τιμή της έκφρασης του VEGF-A παρουσίασε πτώση. Αντίθετα, η σημασία της COX-2 στον προστατικό καρκίνο αναδείχθηκε με την έκφρασή της τόσο στην καλοήθη υπερπλασία όσο και στα αδενοκαρκινώματα του προστάτη. Η έκφραση παρουσίασε σημαντική σχέση με το βαθμό διαφοροποίησης των νεοπλασμάτων (p<0.01). Η σαφώς αυξημένη έκφραση της COX-2 σε σχέση με τη μείωση της έκφρασης του VEGF-A στα πτωχής διαφοροποίησης νεοπλάσματα πιθανόν υποδηλώνει την ύπαρξη ενός αγγειογενετικού διακόπτη στα νεοπλάσματα αυτά όπου η COX-2 φαίνεται να παίζει σημαντικότερο ρόλο από τον VEGF-A. Η σημαντική αυτή πληροφορία θα μπορούσε να βρει πιθανή θεραπευτική εφαρμογή, καθώς σε πτωχής διαφοροποίησης αδενοκαρκινώματα του προστάτη ίσως η θεραπεία με COX-2 εκλεκτικούς αναστολείς να είχε πολύ καλύτερα αποτελέσματα από τις αντι-αγγειογενετικές θεραπείες με αναστολείς του VEGF. / The aim of this study was to immunohistochemically evaluate the expression of VEGF-A, FGF-2, COX-2, AR and BCL-2 in benign prostatic hyperplasia (BPH) and prostate carcinoma in relation to microvessel density (MVD) and the Gleason grade of the neoplasms. A total of 139 cases of primary prostate carcinoma and 24 cases of benign hyperplasia were included in the study. Tumors were graded according to the Gleason grading system and further divided into 3 subgroups (GRADE I, II and III). The immunostaining was performed according to the Streptavidin-Biotin Complex Peroxidase method, in formalin fixed paraffin-embedded tissue. Mean micro vessel density (MVD) was strongly related to tumor grade, VEGF-A and COX-2 histoscore (ANOVA, p<0.001). The androgen receptor was localized in the nuclei of prostate epithelial cells in 97% of cases. The comparison of AR staining with tumor grade revealed an inverse relationship between these two parameters (ANOVA, p<0,0001). An interesting finding was the inverse relationship of stromal AR expression in relation to VEGF-A immunoreactivity. BCL-2 expression was correlated with tumor grade in prostate carcinoma cases (p<0.001) and was strongly correlated with COX-2 and VEGF-A expression (p<0.001). These findings suggest that BCL-2 may play a dual role in tumorigenesis, possibly through an angiogenetic axis. VEGF-A expression was detected in only 17% of BPH cases but all prostate cancer specimens demonstrated some degree of immunoreactivity. COX-2 immunopositivity was present in 54% of BPH specimens and in 99% of primary prostate carcinomas. The increased COX-2 expression correlated significantly with Gleason grade. In our study, high-grade neoplasms presented low to moderate VEGF staining intensity compared to COX-2 expression. These results suggest the activation of an angiogenic switch in poorly differentiated neoplasms, where COX-2 may play a crucial role compared to VEGF and the possible key role of COX-2 in poorly differentiated cancers. According to our findings, anti-VEGF therapy could prove to be more beneficial in patients with low-grade disease, while patients with high-grade prostate carcinoma are more likely to respond to selective COX-2 inhibitors. Immunohistochemical determination of VEGF-A and COX-2 content might prove a useful tool in the design of patient-tailored, anti-angiogenic treatments.

Σκοπός: Η μελέτη βιολογικών και θεραπευτικών συσχετισμών σε ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και ο δυνητικός ρόλος της απόπτωσης. Ασθενείς και Μέθοδοι: Η μελέτη περιέλαβε 35 παρασκευάσματα μερικών ηπατεκτομών από ισάριθμους ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, μη ινοπεταλιώδους τύπου, που αφαιρέθηκαν με ηπατεκτομή για θεραπευτικό σκοπό. Σε αυτούς τους όγκους εκτιμήθηκαν διάφορα μακροσκοπικά και μικροσκοπικά χαρακτηριστικά, διαβαθμίστηκαν και συσχετίστηκαν με το διάστημα ελεύθερο νόσου. Επιπρόσθετα, σε τομές παραφίνης εκτιμήθηκε η έκφραση του bcl-2 και του bax (ανοσοϊστοχημεία/mRNA in-situ υβριδισμός) και της πρωτεΐνης p53. Αποτελέσματα: Η αγγειακή διήθηση η οποία είναι ο ισχυρότερος προβλεπτικός παράγοντας υποτροπής της νόσου, σχετίζεται με το μέγεθος των όγκων, την ύπαρξη γιγαντοκυττάρων και νέκρωσης, τον επικρατούντα και το χειρότερο βαθμό διαφοροποίησης και τον αποπτωτικό/μιτωτικό δείκτη. Ο in-situ υβριδισμός ανέδειξε έκφραση του mRNA του bcl-2 σε 25 από τους 35 ασθενείς (70%). Η ανοσοϊστοχημική χρώση δεν ανέδειξε έκφραση της πρωτεΐνης του bcl-2 στα καρκινικά κύτταρα. Αντίθετα, το bax mRNA και η πρωτεΐνη bax έδειξαν παρόμοιο τρόπο έκφρασης και ανευρέθηκαν μέσα στα ηπατοκύτταρα και στα χολαγγεία. Η έκφραση του bax mRNA ήταν υψηλότερη σε όγκους καλής διαφοροποίησης. Η έκφραση του p53 ήταν μικρότερη στον μικροδοκιδώδη τύπο από το συμπαγή τύπο και ήταν υψηλότερη σε πτωχά διαφοροποιημένους όγκους από τους καλά ή μετρίως διαφοροποιημένους όγκους. Συμπεράσματα: Η ηπατική καρκινογένεση στον άνθρωπο είναι μια πολυπαραγοντική και πολυεστιακή διαδικασία. Η αγγειακή διήθηση σχετίζεται με τον αποπτωτικό/μιτωτικό δείκτη και υψηλότερος αποπτωτικός/μιτωτικό δείκτης σχετίζεται με καλύτερο ελεύθερο νόσου διάστημα. Επιπλέον, η πρωτεΐνη bcl-2 δεν εκφράζεται ενώ εκφράζεται το mRNA, το οποίο εισηγείται μετα-μεταφραστικό λάθος και δείχνει ότι το bcl-2 δεν παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. / Aim: The study of biologic and therapeutic correlations in patients with hepatocellular carcinomas and the potential role of apoptosis. Patients and Methods: The study included 35 partial hepatectomy specimens removed from equal number of patients with nonfibrolamellar hepatocellular carcinomas (HCCs) for therapeutic reasons. In these tumors several macroscopic and microscopic features were assessed, graded and correlated with disease free survival. In addition, in paraffin sections the expressions of bcl-2 and bax (protein immunohistochemistry / mRNA-in situ hybridization) and p53 protein were assessed. Results: Vascular invasion, which is the strongest predictor of disease recurrence, correlates significantly with tumor size, tumor giant cells and necrosis, the predominant and worst degree of differentiation, and the apoptosis/mitosis ratio. Immuno-histochemical staining failed to reveal any bcl-2 protein expression in tumor cells of HCC. In the contrary, bax MRNA and protein displayed somehow a similar pattern of expression. They were detected within hepatocytes, bile duct epithelial and cholangiolar epithelial cells. Ηigher bax mRNA expression was noted in grade I carcinomas. Expression of p53 protein was less in the microtrabecular type than in the solid type and it was higher in poorly differentiated tumors than in those that were well or moderately well differentiated. Conclusions: Liver carcinogenesis in humans is a multistep and multifocal process. Vascular invasion correlates with the apoptosis/mitosis ratio and a higher apoptosis/mitosis ratio correlates with improved disease free survival. In addition, bcl-2 gene is frequently present but its protein product is absent. This suggests a post-translational mechanism of bcl-2 protein degradation, indicating that bcl-2 does not play a substantial role in the progress of hepatocellular carcinoma.

Οι ασθενείς µε αποφρακτικό ίκτερο, ιδιαίτερα όταν εκτίθενται στο επιπρόσθετο stress ενός επεµβατικού διαγνωστικού ή θεραπευτικού χειρισµού, είναι επιρρεπείς στην ανάπτυξη σηπτικών επιπλοκών και νεφρικής δυσλειτουργίας που οδηγούν σε υψηλά ποσοστά νοσηρότητας και θνητότητας. Πειραµατικές και κλινικές µελέτες έχουν δείξει ότι ο αποφρακτικός ίκτερος προκαλεί δυσλειτουργία του βλεννογόνιου εντερικού φραγµού, οδηγώντας σε ενδοτοξιναιµία, η οποία φαίνεται να διαδραµατίζει κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη των επιπλοκών αυτών. Η απουσία χολής µεταβάλλει τη λειτουργία του εντερικού φραγµού χωρίς να διασπά τη συνέχεια του επιθηλίου. Οι µοριακοί µηχανισµοί που ενέχονται στο φαινόµενο αυτό δεν έχουν αποσαφηνιστεί. Η παρούσα διδακτορική διατριβή επιχειρεί να διερευνήσει την επίδραση του πειραµατικού αποφρακτικού ικτέρου στην έκφραση της αποφραξίνης, δοµικού συστατικού των αποφρακτικών ενώσεων, στον εντερικό βλεννογόνο, στην απόπτωση και στον πολλαπλασιασµό των επιθηλιακών κυττάρων στις κρύπτες και στα επίπεδα οξειδωτικού stress στο έντερο. Επιπλέον, σε µια προσπάθεια θεραπευτικής παρέµβασης, διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος των ρυθµιστικών εντερικών πεπτιδίων bombesin (BBS) και neurotensin (NT) στις ανωτέρω παραµέτρους, καθώς και στην ιστολογία και στα επίπεδα οξειδωτικού stress στο ήπαρ. Προηγούµενες µελέτες έχουν δείξει ότι τα πεπτίδια αυτά εξασκούν ένα ευρύ φάσµα δράσεων στον εντερο-ηπατικό άξονα και βελτιώνουν την ακεραιότητα του γαστρεντερικού βλεννογόνου έπειτα από την επίδραση διαφόρων βλαπτικών παραγόντων. Η απουσία χολής ενδοαυλικά, αποστερεί τον εντερικό βλεννογόνο από τις βακτηριοστατικές, αντι-ενδοτοξινικές και τροφικές της ιδιότητες, οδηγώντας σε αύξηση των βακτηριδίων και της ενδοτοξίνης ενδοαυλικά και σε εντερική ατροφία. Οι µεταβολές αυτές προάγουν τη µετακίνηση βακτηρίων και ενδοτοξινών στην πυλαία φλέβα και ακολούθως, µέσω µιας κατασταλµένης εκκαθαριστικής ικανότητας των κυττάρων Kupffer εξαιτίας της χολόστασης, στη συστηµατική κυκλοφορία. Η συστηµατική ενδοτοξιναιµία ενεργοποιεί τη συστηµατική φλεγµονώδη απάντηση, η οποία σχετίζεται µε τη δυσλειτουργία που αναπτύσσεται σε αποµακρυσµένα όργανα, ενώ συνεισφέρει και στην περαιτέρω επιδείνωση της λειτουργίας του εντερικού φραγµού και της ηπατικής βλάβης. Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης επιβεβαίωσαν την παρουσία πυλαίας και συστηµατικής ενδοτοξιναιµίας σε εξωηπατική απόφραξη των χοληφόρων. Η προκαλούµενη από τον αποφρακτικό ίκτερο ατροφία του εντερικού βλεννογόνου τεκµηριώθηκε µε µορφοµετρική ανάλυση και µε µετρήσεις του DNA και της πρωτεΐνης. Ένας πιθανός µηχανισµός προαγωγής της ατροφίας του εντερικού βλεννογόνου είναι η διαταραχή της ισορροπίας µεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασµού και κυτταρικού θανάτου στις κρύπτες, µε αύξηση της απόπτωσης και µείωση της µιτωτικής δραστηριότητας. Επίσης, ο αποφρακτικός ίκτερος οδήγησε σε αύξηση του οξειδωτικού stress στο έντερο, όπως τεκµηριώνεται από την αύξηση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων, της οξείδωσης των πρωτεϊνών, της οξειδωµένης γλουταθειόνης (GSSG), των ολικών µη πρωτεϊνικών µεικτών δισουλφιδίων (NPSSR), και των πρωτεϊνικών δισουλφιδίων (PSSP), ενώ µειώθηκε το αντιοξειδωτικό µόριο της ανηγµένης γλουταθειόνης (GSH). Η ενδοτοξιναιµία και οι αυξηµένες συγκεντρώσεις χολικών αλάτων αποτελούν σηµαντικούς διεγέρτες της παραγωγής δραστικών µεταβολιτών οξυγόνου. Η παρουσία οξειδωτικού stress στο έντερο συνεισφέρει στην προαγωγή της αποπτωτικής διεργασίας και στην αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασµού στις κρύπτες, οδηγώντας σε ατροφία του βλεννογόνου. Ένα άλλο πρωτότυπο εύρηµα αυτής της µελέτης είναι η διαταραχή του παρακυττάριου φραγµού του εντέρου στα πειραµατόζωα µε αποφρακτικό ίκτερο, η οποία τεκµηριώνεται µε την απώλεια της έκφρασης της αποφραξίνης περίπου στο 50% των επιθηλιακών κυττάρων στο κορυφαίο τµήµα της λάχνης. Συνεπώς, το άνοιγµα της παρακυττάριας οδού φαίνεται να είναι ένας σηµαντικός παράγων στη διαφυγή ενδοτοξίνης από τον εντερικό αυλό στην πυλαία κυκλοφορία. Η ενδοτοξιναιµία, η απελευθέρωση στη συστηµατική κυκλοφορία µεσολαβητών φλεγµονής και η παρουσία οξειδωτικού stress στο έντερο πιθανώς σχετίζονται µε τη µεταβολή της έκφρασης της αποφραξίνης στον εντερικό βλεννογόνο. Επιπλέον, στον αποφρακτικό ίκτερο ανεβρέθηκε µια διαβάθµιση της έκφρασης της αποφραξίνης κατά µήκος της λάχνης, µε µεγαλύτερη απώλεια της έκφρασής της στο άνω τριτηµόριο, µικρότερη στο µέσο και ακόµα µικρότερη στην κρύπτη. Μια πιθανή εξήγηση αυτής της διαβάθµισης της απώλειας της έκφρασης της αποφραξίνης είναι ότι, δεδοµένου ότι η ανανέωση του επιθηλίου γίνεται από την κρύπτη προς την κορυφή, τα κύτταρα της κορυφής της λάχνης έχουν εκτεθεί για περισσότερο χρονικό διάστηµα στις συνθήκες οξειδωτικού stress που επικρατούν στο έντερο. Τα ρυθµιστικά εντερικά πεπτίδια, BBS και ΝΤ, δρώντας είτε άµεσα, µέσω ειδικών υποδοχέων των επιθηλιακών κυττάρων του εντέρου, είτε έµµεσα, βελτιώνοντας τη µικροκυκλοφορία του εντέρου, αποκατέστησαν την έκφραση της αποφραξίνης στον εντερικό βλεννογόνο, µείωσαν σηµαντικά την απόπτωση και το οξειδωτικό stress και ανέστρεψαν την εντερική ατροφία. Η πρόληψη, από τα ρυθµιστικά πεπτίδια, των επαγόµενων από τον αποφρακτικό ίκτερο κυτταρικών και βιοχηµικών µεταβολών του εντερικού βλεννογόνου, οδήγησε σε σηµαντική µείωση της πυλαίας και συστηµατικής ενδοτοξιναιµίας. Επιπλέον, η BBS και η ΝΤ, εξασκώντας αντιοξειδωτική δράση και στο ήπαρ, προστατεύουν από δυο µείζονες παράγοντες ηπατικής βλάβης κατά τη χολόσταση, που είναι το οξειδωτικό stress και η ενδοτοξιναιµία, οδηγώντας σε βελτίωση των ιστολογικών αλλοιώσεων της αποφρακτικής χολαγγειοπάθειας. Συµπερασµατικά, τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης δείχνουν ότι η δυσλειτουργία του εντερικού φραγµού στον αποφρακτικό ίκτερο σχετίζεται µε την επαγωγή κυτταρικών και βιοχηµικών µεταβολών στον εντερικό βλεννογόνο, οι οποίες χαρακτηρίζονται από κατά τόπους απώλεια της έκφρασης της αποφραξίνης, πρόκληση οξειδωτικού stress και επαγωγή της απόπτωσης. Τα ρυθµιστικά εντερικά πεπτίδια BBS και ΝΤ προλαµβάνοντας τις µεταβολές αυτές του εντερικού βλεννογόνου µειώνουν σηµαντικά την πυλαία και συστηµατική ενδοτοξιναιµία. Επίσης, εξασκούν προστατευτική δράση εναντίον του οξειδωτικού stress στο ήπαρ και διαφυλάσσουν την αρχιτεκτονική του πυλαίου διαστήµατος. Η συνδυασµένη ευεργετική επίδραση των ρυθµιστικών πεπτιδίων, τόσο στη δυσλειτουργία του εντερικού φραγµού και την ενδοτοξιναιµία, που ευθύνονται για την ανάπτυξη σηπτικών επιπλοκών και βλάβης αποµακρυσµένων οργάνων, όσο και στο οξειδωτικό stress και την ιστολογία του ήπατος, εισηγούνται µια νέα θεραπευτική προσέγγιση στον αποφρακτικό ίκτερο. Όπωσδήποτε απαιτούνται περαιτέρω µελέτες για τη διευκρίνιση των µηχανισµών δράσης και πιθανών παρενεργειών της BBS και της ΝΤ πριν την εφαρµογή τους στην κλινική πράξη. / Patients with obstructive jaundice, especially when exposed to the additional stress of an invasive diagnostic or therapeutic procedure, are prone to septic complications and renal dysfunction contributing to high morbidity and mortality rates. Experimental and clinical studies have shown that obstructive jaundice compromises intestinal barrier function resulting in endotoxemia, which appears to play a key role in the development of these complications. Lack of bile alters intestinal epithelial barrier function without disrupting epithelial continuity. The molecular mechanisms implicated in this phenomenon are poorly understood. This study was undertaken to investigate the influence of experimental obstructive jaundice on the expression of the key tight junction-associated protein occludin in the intestinal epithelium, epithelial cell apoptosis and proliferation in crypts and intestinal oxidative stress. In addition, in an attempt for therapeutic intervention in obstructive jaundice, we have explored the potential positive effect of gut regulatory peptides bombesin (BBS) and neurotensin (NT) on the above-described parameters and on liver histology and oxidative stress. These factors exert a wide spectrum of actions on the gut-liver axis and they improve gastrointestinal mucosa integrity after various injurious insults. The results of our study showed that experimental obstructive jaundice results in portal and aortic endotoxaemia. In jaundiced rats, there was total loss of occludin expression in numerous enterocytes and this effect was most profound at the upper third of the villi, while a gradient of positivity existed from crypt to tip. Intestinal cell apoptosis in crypts was significantly increased, while mitotic activity was reduced. This imbalance of cell proliferation and death in crypts was accompanied by induction of mucosal atrophy, as evidenced by morphometrical analysis and decreased DNA and protein content. Moreover, obstructive jaundice induced intestinal oxidative stress demonstrated by increased lipid peroxidation, protein oxidation, GSSG, NPSSR, PSSP and reduction of GSH. Administration of BBS or NT significantly reduced portal and systemic endotoxaemia. These agents restored occludin expression in the intestinal epithelium to the control state, significantly reduced apoptosis and oxidative stress and reversed mucosal atrophy. Moreover, both agents significantly ameliorated liver injury, as demonstrated by improvement of obstructive cholangiopathy, reduction of hepatic oxidative stress and prevention of neutrophilic accumulation in portal tracts. Absence of intraluminal bile deprives the gut from its bacteriostatic, endotoxin-neutralizing and mucosal-trophic effect leading to increased intestinal bacterial and endotoxin load and mucosal atrophy. These alterations promote bacterial and endotoxin translocation into portal circulation and subsequently, through a decreased clearance capacity of Kupffer cells because of cholestasis, into systemic circulation. Systemic endotoxemia activates a systemic inflammatory response, which is associated with dysfunction of remote organs, while it further aggravates intestinal barrier dysfunction and cholestatic liver injury. Endotoxin and bile acids represent important sources of reactive oxygen species formation. We have demonstrated increased intestinal oxidative stress in obstructive jaundice, which possibly contributes to induction of apoptosis and inhibition of cell proliferation in intestinal crypts, leading to mucosal atrophy. Another novel finding of this study is that the intestinal paracellular barrier in jaundiced rats is disrupted, as evidenced by loss of expression of the key tight junction-associated protein occludin in approximately 50% of enterocytes at the upper third of the villi. Therefore, the opened paracellular route may significantly contribute to the escape of endotoxin from the intestinal lumen into portal circulation. Endotoxemia, systemic release of inflammatory mediators and intestinal oxidative stress are possibly associated with decreased occludin expression. A possible explanation for the gradient of occludin expression from crypt to tip is that the cells at the tip of the villi have been exposed for a longer duration to the oxidative intestinal environment of jaundiced rats since epithelial renewal takes place from crypt to tip. Gut regulatory peptides, BBS and NT, acting either directly, through specific receptors located in intestinal epithelial cells, or indirectly, through improvement of intestinal microcirculation, prevent the above-described cellular and biochemical alterations of the intestinal mucosa, leading to lower portal and systemic endotoxin concentrations. Moreover, exerting an antioxidant effect on the liver as well, they prevent two major factors in the promotion of cholestatic liver injury, oxidative stress and endotoxemia, leading to significant amelioration of obstructive cholangiopathy. In conclusion, the results of the present study show that obstructive jaundice-induced gut barrier dysfunction is associated with regional loss of occludin expression in the intestinal epithelium, increased intestinal oxidative stress and induction of apoptosis / inhibition of proliferation in crypts leading to intestinal atrophy. Gut regulatory peptides BBS and NT exerting beneficial effects on these cellular and biochemical alterations of the intestinal mucosa prevent portal and systemic endotoxaemia. Moreover, these factors exert a protective action on portal tract architecture and hepatic oxidative stress. The combined beneficial effects of regulatory peptides on intestinal barrier dysfunction and endotoxemia, which account for septic complications and dysfunction of remote organs, and on liver oxidative status and histology, provide a novel therapeutic approach for obstructive jaundice. However, further investigation to elucidate the details of the functional mechanisms and possible side effects of BBS and NT are needed before any clinical application.

Στην επίκτητη απλαστική αναιμία (ΑΑ) ο υποκυτταρικός μυελός και η πανκυτταροπενία στο περιφερικό αίμα είναι αποτέλεσμα βλάβης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι κύριο χαρακτηριστικό γνώρισμα της νόσου είναι η ποσοτική αλλά και ποιοτική διαταραχή της stem cell δεξαμενής. Κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα προτείνουν το σημαντικό ρόλο του ανοσοποιητικού συστήματος και ειδικά των Τ λεμφοκυττάρων στην ανάπτυξη της απλαστικής αναιμίας. Σήμερα, πλέον, είναι ευρύτερα αποδεκτό ότι η καταστολή του μυελού, που παρατηρείται στην ιδιοπαθή απλαστική αναιμία, είναι αποτέλεσμα της υπερπαραγωγής των μυελοκατασταλτικών κυτταροκινών IFN-γ και TNF-α από διεγερμένα CD8+ κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα, τα οποία συναντούμε τόσο στο περιφερικό αίμα όσο και στο μυελό ασθενών με απλαστική αναιμία. Οι κυτοκίνες αυτές παρουσιάζουν μάλλον προσθετική αντί συνεργική δράση, η οποία σχετίζεται με την IFN-γ-εξαρτώμενη αύξηση της έκφρασης του Fas στα CD34+ κύτταρα και από την IFN-γ-επαγώμενη έκκριση του TNF-α από τα μακροφάγα. Μελέτες έχουν δείξει ότι τόσο τα CD34+ όσο και τα BMMNC κύτταρα του μυελού των ασθενών με ΑΑ είναι περισσότερα αποπτωτικά σε σχέση με φυσιολογικούς μυελούς. Στόχος της διατριβής ήταν η περαιτέρω μελέτη των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανοσολογικής προέλευσης απλαστική αναιμία. Λόγω, όμως, του ότι η απλαστική αναιμία είναι μια σπάνια νόσος, η παρουσία ενός εύκολα αναπαραγώγιμου in vitro μοντέλου μυελικής απλασίας θα βοηθούσε περισσότερο στη μοριακή μελέτη αυτής. Στη μελέτη μας, η αναπαραγωγή του καταλληλότερου μοντέλου μυελικής απλασίας επιτεύχθηκε με την προσθήκη των μυελοκατασταλτικών κυτταροκινών IFN-γ και TNF-α σε φυσιολογικό σύστημα μακράς διάρκειας καλλιέργειας μυελού των οστών. Στο μοντέλο αυτό έγινε διερεύνηση των μοριακών μονοπατιών των σχετιζομένων με την Fas και TRAIL επαγόμενη απόπτωση. Παράλληλα, έγινε σύγκριση των δεδομένων από το in vitro μοντέλο με τα αποτελέσματα της παράλληλης μελέτης των αντίστοιχων μοριακών παραμέτρων σε κύτταρα μυελού ασθενών με απλαστική αναιμία. Στο IFN-γ/ΤNF-α μοντέλο παρατηρήθηκε σημαντική μείωση τόσο των πιο άωρων LTC-IC όσο και των πιο δεσμευμένων προγονικών κυττάρων, σε σχέση με τις καλλιέργειες-μάρτυρες. Επιπλέον, τα αποτελέσματα των πρωτογενών και δευτερογενών καλλιεργειών βραχείας διάρκειας σε μυελικά κύτταρα ασθενών με ενεργό νόσο, επιβεβαίωσαν το χαρακτηριστικό γνώρισμα της απλαστικής αναιμίας, δηλαδή, το μειωμένο αριθμό προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Η επώαση φρέσκων φυσιολογικών μυελικών κυττάρων, σε 5-6 εβδομάδων LTBMC σύστημα, με συνδυασμό των TNF-α/IFN-γ παραγόντων οδηγεί σε αύξηση της Fas mRNA έκφρασης στα CD34+ κύτταρα, κάτι που δεν παρατηρείται στα, αντίστοιχα, φρέσκα και στα 5-6 εβδομάδων κύτταρα-μάρτυρες. Το εύρημα αυτό σε συνδυασμό με τη χαμηλή mRNA έκφραση της caspase 3 καθώς και την απουσία έκφρασης των Bcl-2, Bax και της caspase 8 στον ίδιο πληθυσμό, προτείνουν το σημαντικό ρόλο του external μονοπατιού επαγωγής της απόπτωσης, όπως αυτό ρυθμίζεται από την δράση των μυελοκατασταλτικών κυτοκινών TNF-α/IFN-γ. Παράλληλα, η παρουσία χαμηλής Bcl-2 mRNA έκφρασης, στα CD34+ κύτταρα, τονίζει τη σημασία της αναλογίας προ-αποπτωτικών/αντι-αποπτωτικών σημάτων στη κυτταρική έκβαση. To σημαντικότερο, πάντως, εύρημα του TNF-α/IFN-γ μοντέλου είναι η συνεχής TRAIL mRNA έκφραση, στα CD34+ κύτταρα αυτού, κάτι το οποίο δεν έχει αναφερθεί, ως τώρα, στη βιβλιογραφία. Η μοριακή ανάλυση των μυελικών κυττάρων των ΑΑ ασθενών απεκάλυψε, εκτός της Fas mRNA έκφρασης στα BMMNC και/ή στα CD34+ κύτταρα, την αυξημένη TRAIL mRNA έκφραση στο CD34+ κυτταρικό πληθυσμό των ασθενών με ενεργό νόσο. Αντίθετα, στους ασθενείς σε ύφεση, απουσιάζει η έκφραση και των δύο γονιδίων στον ίδιο πληθυσμό. Ενώ, στα BMMNC η έκφραση του TRAIL mRNA παραμένει, ένα συνεχές εύρημα, ακόμη και στους ασθενείς σε ύφεση. Επιπρόσθετα, η μειωμένη έκφραση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων Bcl-xl και/ή Bcl-2 στα BMMNC όλων των ασθενών και του Bcl-xl στα CD34+ κύτταρα των ασθενών με ενεργό νόσο, δείχνει «ανίκανη» να αναστείλλει το μηχανισμό της απόπτωσης στους AA ασθενείς. Το γεγονός ότι η έκφραση του TRAIL mRNA είναι συνεχής στο CD34+ κυτταρικό πληθυσμό του TNF-α/IFN-γ μοντέλου και μόνο στα CD34+κύτταρα ΑΑ ασθενών με ενεργό νόσο, δείχνει τη σημαντικότητα του συγκεκριμένου μορίου στην απόπτωση των προγονικών κυττάρων στη μυελική απλασία. Συμπερασματικά, το μοντέλο μυελικής απλασίας που τελικά επιλέξαμε επιβεβαιώνει προηγούμενη γνώση της συμμετοχής των TNF-α και IFN-γ στη παθοφυσιολογία της απλαστικής αναιμίας. Παράλληλα, τα μοριακά δεδομένα, τόσο του μοντέλου όσο και των ασθενών με απλαστική αναιμία, ενισχύουν την εμπλοκή του Fas/FasL στη παθογένεση της νόσου και προτείνουν την πιθανή συμμετοχή του TRAIL/Apo2L στην όλη διαδικασία. / In aplastic anemia (AA) the hypocellular bone marrow and blood pancytopenia occur as a result of damage to hematopoietic stem cells . Previous studies have shown that a profound quantitative and qualitative defect in the stem cell compartment is a common feature in most patients with AA. Clinical and laboratory data suggest that the immune system, especially T lymphocytes, have an important role in the development of AA. It is well established that IFN-γ and TNF-α mediate hematopoietic stem cell suppression in aplastic anemia. These proinflammatory cytokines exhibit additive rather than synergistic effect, which may be mediated by the IFN-γ-dependent increase in Fas expression on CD34+ progenitor cells and by the IFN-γ-inducible secretion of TNF-α by macrophages. Bone marrow total mononuclear and progenitor cells from aplastic anemia patients are more apoptotic than cells from normal donors, indicating that apoptosis may be a major mechanism of stem cell loss in aplastic anemia. The aim of our study was to investigate the molecular mechanisms involved in the immune-mediated pathology of aplastic anemia. Since aplastic anemia is a rare disease the existence of an easily reproducible model of in vitro hematopoietic cell suppression can facilitate studies concerning the molecular pathways of this disease. In our study, we reproduced such a model with the addition of the myelosuppressive cytokines IFN-γ and TNF-α in a normal long term bone marrow culture system. In this model, we examined the Fas mediated pathway of apoptosis and especially the correlation between TRAIL expression and myelosuppression. We, also, studied these parameters in marrow cells from aplastic anemia patients. The IFN-γ and TNF-α inhibitory cytokines appeared to affect both immature LTC-ICs and more commited progenitor cells capable of lineage-specific colony formation (CFCs). In addition our progenitor cell assays results in patients, supported this unifying feature of reduced haematopoietic progenitor cells in aplastic anemia. TNF-α and IFN-γ treatment up-modulated Fas expression and induced apoptosis of 5-6 weeks cultured normal CD34+ cells, while normal freshly isolated and 5-6 weeks untreated cultured CD34+ cells showed no Fas mRNA expression. This finding, along with the low mRNA expression of caspase 3 and the absence of Bcl-2, Bax and caspase 8 expression, proposes the major role for activation of the extrinsic apoptosis pathway due to treatment of BMMNC with TNF-α and IFN-γ. In parallel, the existence of the low Bcl-xl mRNA expression in the same cell compartment points to the importance of the ratio of pro-apoptotic to anti-apoptotic signals, in cell fate. The most interesting finding is the constant TRAIL mRNA expression on CD34+ cells in TNF-α/IFN-γ treated LTBMC, something not mentioned before. Molecular analysis of patients’ marrow cells revealed, apart from Fas mRNA expression in BMMNC and/or CD34+ cells, TRAIL mRNA expression in CD34+ cell population in active disease. Ιn contrast, in patients in remission, both Fas and TRAIL mRNA expression does not exist. Instead, in BMMNC’s cell compartment TRAIL mRNA expression remains a constant finding even in patients in remission. Additionally, the decreased expression of anti-apoptotic bcl-xl and/or bcl-2 in all patients’ BMMNCs and bcl-xl expression in CD34+ cells from patients with active disease, seems unable to inhibit the mechanism of apoptosis in aplastic anemia patients. In our study, the fact that the expression of TRAIL was constant on CD34+ cells in TNF-α/IFN-γ treated LTBMC and only in CD34+ cells of patients with active disease, points out its significance in apoptosis of progenitor cells. In conclusion, our in vitro model of hematopoietic suppression confirmed previous knowledge for participation of TNF-α and IFN-γ in the pathophysiology of marrow failure in aplastic anemia. In parallel, the molecular data both from the in vitro model, as well as from patients with aplastic anemia, reinforce the implication of Fas/FasL pathway in the pathogenesis of this disease and propose a probable role for TRAIL/Apo2L in the process.

Τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) χαρακτηρίζονται από μη αποδοτική αιμοποίηση, αναστολή ωρίμανσης των προγονικών κυττάρων του μυελού και αυξημένη ενδομυελική απόπτωση. Η συσχέτιση του ΜΔΣ με την παρουσία αυξημένου οξειδωτικού στρες και οξειδωτικά τροποποιημένων πρωτεϊνών στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα του μυελού έχει προηγουμένως αναφερθεί. Πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα δηλώνουν τη δυνατότητα διάκρισης δύο υποπληθυσμών της μυελικής σειράς βάσει σκεδαστικών χαρακτηριστικών και της έκφρασης του CD45, CD45dim (Neutrophil granulocytic subpopulation-1, NGS1) και CD45high (Neutrophil granulocytic subpopulation-2, NGS2). Ο υποπληθυσμός CD45dim φέρει άωρα κύτταρα, που στην πλειοψηφία τους δεν ωριμάζουν έως τελικού σταδίου[1]. Ο πλήρης χαρακτηρισμός των πληθυσμών αυτών, καθώς επίσης, και η συμμετοχή τους στη μη αποδοτική αιμοποίηση των ΜΔΣ και στην εξέλιξη της νόσου είναι στοιχεία άγνωστα. Σκοπός της παρούσης εργασίας ήταν η διερεύνηση δεικτών απόπτωσης και οξειδωτικού φορτίου (ελεύθερες ρίζες οξυγόνου-ROS) στους υποπληθυσμούς της μυελικής σειράς CD45dim και CD45high. Μελετήθηκαν 17 δείγματα μυελού ασθενών με ΜΔΣ μετά από ανάλυση συνδυασμού 5 χρωμάτων με κυτταρομετρία ροής, για τους δείκτες CD11b/CD16, annexin-V/7-AAD και 2,7-dichlorodihydrofluo-rescein-diacetate(DCF). Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του κατάλληλου προγράμματος με μη παραμετρικά κριτήρια (Wilcoxon & Mann-Whitney). Το ποσοστό των αποπτωτικών 7-AAD/annexin-V+ κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένο στα CD45high/ CD11b+/CD16+ της μυελικής σειράς συγκριτικά με τα CD45dim/CD11b+/CD16- κύτταρα. Τα CD45dim και CD45high κύτταρα μυελού με τη χρήση του ειδικού ανιχνευτή των επιπέδων των ελεύθερων ριζών οξυγόνου DCF αναλύθηκαν σε ROSLow και ROSHigh πληθυσμούς. Η ανάλυση με τη χρήση των παραπάνω κριτηρίων έδειξε σημαντική αύξηση του ποσοστού των ROSHigh κυττάρων στα CD45high κύτταρα, συμπεραίνοντας έτσι ότι ο υποπληθυσμός CD45dim έχει χαμηλότερα επίπεδα ενδοκυττάριων ROS εν συγκρίσει με τον CD45high υποπληθυσμό. Ο CD45high υποπληθυσμός της μυελικής σειράς χαρακτηρίζεται από μεγαλύτερα ποσοστά έκφρασης αποπτωτικών δεικτών καθώς επίσης και από τη παρουσία αυξημένου οξειδωτικού φορτίου συγκριτικά με τα CD45dim κύτταρα. Η περεταίρω διερεύνηση του ρόλου των πληθυσμών αυτών στις διαδικασίες ανάπτυξης του ΜΔΣ και στην εξέλιξη της νόσου είναι υπό εξέλιξη. / --

Η ακτινοθεραπεία αποτελεί μέρος της θεραπείας πολλών αιματολογικών κακοηθών νοσημάτων επηρεάζοντας τον αριθμό και την λειτουργικότητα των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων CD34+ Το DNA των κυττάρων αποτελεί το βασικότερο και ίσως καλύτερα μελετημένο μόριο-στόχο της ακτινοβολίας. Ο μηχανισμός που προκαλεί βλάβη στο DNA είναι άμεσος αλλά και έμμεσος. Η άμεση επίδραση και βλάβη της ακτινοβολίας στο DNA αφορά στην απευθείας δράση της στο μόριο του DNA που είναι δυνατόν να οδηγήσει σε αντικατάσταση ή απώλειας μιας βάσης, αλλαγές στην τεταρτοταγή δομή του DNA και κατά συνέπεια στις αλληλεπιδράσεις του με άλλα μόρια του κυττάρου (cross links), σπασίματα της διπλής έλικας DSB (Double Strand Breaks) ή της μίας μόνο εκ των δύο αλυσίδων SSB (Single Strand Breaks), σημειακές μεταλλάξεις ή απώλεια τμήματος των χρωμοσωμάτων. Ο έμμεσος μηχανισμός δράσης της ακτινοβολίας στο DNA αφορά την δημιουργία ελευθέρων ριζών από την αλληλεπίδραση της ακτινοβολίας με τα μόρια του νερού, ενδοκυττάρια και εξωκυττάρια από τη μία αλλά και από την απευθείας βλάβη του μιτοχονδρίου που αποτελεί κύρια ενδοκυττάρια πηγή ελευθέρων ριζών. Οι παραγόμενες ελεύθερες ρίζες με τη σειρά τους προκαλούν απευθείας βλάβη στο μόριο του DNA, με αποτέλεσμα την πυροδότηση ενός φαυλού κύκλου ενδοκυττάριας παραγωγής ελευθέρων ριζών και πρόκλησης βλαβών στο μόριο του DNA. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της δράσης χαμηλών και υψηλότερων δόσεων ακτινοβολίας (1, 2 και 5Gy) σε προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα CD34+ προερχόμενα από αίμα ομφαλίου λώρου φυσιολογικών νεογνών, και ο πιθανός προστατευτικός μηχανισμός που ενεργοποιείται από την παρουσία του ινσουλινικού αυξητικού παράγοντα IGF-1. Η προκαλούμενη από την ακτινοβολία ενδοκυττάρια παραγωγή ενεργών μορφών οξυγόνου μελετήθηκε παρουσία ή απουσία του IGF-1, 30 λεπτά και 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση με χρήση κυτταρομετρίας ροής. Η έκφραση του αντιοξειδωτικού ενζύμου MnSOD εκτιμήθηκε ποσοτικά με την τεχνική της ανοσοαποτύπωσης και ποιοτικά μέσω ανοσοφθορισμού. Η προκαλούμενη από την ακτινοβολία απόπτωση και η δράση του υπό μελέτη αυξητικού παράγοντα εκτιμήθηκε με τις ακόλουθες τεχνικές: • Διπλή χρώση των κυττάρων με Αννεξίνη και Ιωδιούχο προπίδιο και ανάλυση με κυτταρομετρία ροής • Ανάλυση DNA σε γέλη αγαρόζης • Εκτίμηση σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης του λόγου των μορίων BCL-2 και BAX • Εκτίμηση της έκφρασης του μορίου κασπάση -9, με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού Εκτιμήθηκε επίσης ο πολλαπλασιασμός και η κλωνογόνος ικανότητα των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Η ενδοκυττάρια παραγωγή της ρίζας του υπεροξειδίου παρουσίασε αύξηση 30 λεπτά και 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση, και η παρουσία του IGF-1 ανέτρεψε το φαινόμενο αυτό, μειώνοντας και επιστρέφοντας τα ενδοκυττάρια επίπεδα του ανιόντος του υπεροξειδίου στα επίπεδα του δείγματος ελέγχου. Αμέσως μετά την ακτινοβόληση των κυττάρων τα ενδοκυττάρια επίπεδα του υπεροξειδίου του υδρογόνου ανευρέθηκαν υψηλά σε σύγκριση με τα αυθόρμητα ενδογενή επίπεδα μη ακτινοβολημένων κυττάρων για όλες τις δόσεις ακτινοβολίας, όμως στον όψιμο χρόνο μελέτης, των 24 ωρών, παρέμειναν σχεδόν σταθερά, παρουσιάζοντας τάση μείωσης, χωρίς όμως να σημειώνονται στατιστικά σημαντικές διαφορές. Είκοσι τέσσερεις ώρες μετά την ακτινοβόληση τα επίπεδα του αντιοξειδωτικού ενζύμου MnSOD αυξήθηκαν, και η παρουσία του IGF-1 οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση της έκφρασης του. Ο IGF-1 ανέστειλε την ενεργοποίηση του μιτοχονδριακού μηχανισμού απόπτωσης ρυθμίζοντας σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο την έκφραση των BCL-2, ΒΑΧ και του λόγου BCL-2/BAX, και μειώνοντας την έκφραση του προαποπτωτικού μορίου κασπάση-9. Θετική ήταν και η δράση του IGF-1 στον πολλαπλασιασμό και στην ικανότητα αποδοτικής αιμοποίησης των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, ενισχύοντας την ικανότητα πολλαπλασιασμού των ακτινοβολημένων κυττάρων αλλά και την κλωνογόνο ικανότητα τους ως προς τον σχηματισμό BFU-e και CFU-GM αποικιών. Συνοψίζοντας, μπορούμε να υποστηρίξουμε ότι ο IGF-1 συμμετέχει στη διατήρηση της οξειδοαναγωγικής ομοιόστασης του ενδοκυττάριου περιβάλλοντος των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων μειώνοντας τα ενδοκυττάρια επίπεδα των παραγόμενων ενεργών μορφών οξυγόνου. Μέσω θετικής ρύθμισης του αντιοξειδωτικού μηχανισμού MNSOD και συμμετέχοντας προστατευτικά στο μιτοχονδριακό καταρράκτη της απόπτωσης οδηγεί σε προστασία των ακτινοβολημένων αιμοποιητικών κυττάρων επιτρέποντας τους να διατηρήσουν την λειτουργικότητα τους και την ικανότητα αιμοποίησης. / Radiation exerts direct as well as indirect effects on DNA through the generation of reactive oxygen species (ROS). Irradiated hematopoietic progenitor cells (HPCs) experience DNA strand breaks, favoring genetic instability, due to ROS generation. Our aim was to study the effect of a range of radiation doses in HPCs and the possible protective mechanisms activated by insulin-like growth factor-1 (IGF-1). ROS generation was evaluated, in the presence or absence of IGF-1 in liquid cultures of human HPCs-CD34+ irradiated with 1-, 2- and 5-Gy X-rays, using a flow cytometry assay. Manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression was studied by western blot analysis and visualized by an immunofluorescence assay. Apoptosis was estimated using the following assays: Annexin-V assay, DNA degradation assay, BCL-2/BAX mRNA and protein levels and caspase-9 protein immunofluorescence visualization. Viability and clonogenic potential were studied in irradiated HPCs. The generation of superoxide anion radicals at an early and a late time point was increased. This linear increase was reversed by the IGF-1 presence, restoring O.- generation at the levels of the innate production as manifested in control non irradiated samples. The hydrogen peroxide generation was increased at early time point but at late time point was stable. IGF-1 presence further enhanced the radiation-induced increase of MnSOD at 24 h post irradiation. IGF 1 inhibited the mitochondria- mediated pathway of apoptosis by regulating the m-RNA and protein expression of BAX, BCL-2 and the BCL-2/BAX ratio and by decreasing caspase-9 protein expression. IGF-1 presence in culture media of irradiated cells restored the clonogenic capacity and the viability of HPCs as well. In conclusion, our data support that IGF-1 anticipates oxidative microenvironment of HPCs by reducing the oxidative stress in intracellular environment due to a range of doses of radiation. IGF-1 succeeds to eliminate free radicals by favoring scavenger’s mechanisms and by regulating elements responsible for the mitochondrial pathway of apoptosis, allowing the sustained clonogenic capacity of hematopoietic progenitor cells.

Το πολλαπλούν μυέλωμα είναι μια νεοπλασία η οποία, έως και σήμερα, παραμένει ανίατη. Στο ΠΜ, το ανοσοποιητικό σύστημα δε κατορθώνει να καταστρέψει τα κακοήθη πλασμοκύτταρα, ενώ υπάρχουν ενδείξεις ότι τα κύτταρα του όγκου παίζουν ενεργό ρόλο σε αυτό. Στην παρούσα διατριβή, ελέγξαμε ποικίλλες μυελωματικές σειρές σχετικά με την έκφραση των προ- και αντι-αποπτωτικών γονιδίων. Βρήκαμε ότι τα μυελωματικά κύτταρα εκφράζουν έναν μη φυσιολογικό φαινότυπο (fas high/bcl low). Μελετώντας τα κύτταρα του μυελού των οστών ενός ασθενούς με ΠΜ τύπου IgG/k σταδίου ΙΙΙΑ, διαπιστώσαμε ότι αυτά τα κύτταρα εξέφραζαν τα γονίδια granzyme B και perforin, τα οποία υπό κανονικές συνθήκες εκφράζονται μόνο από τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTLs) και τα φυσικά φονικά κύτταρα (ΝΚ). Προτείνουμε ότι πιθανόν το παραπάνω γεγονός αποτελεί έναν επιπλέον αμυντικό μηχανισμό των κυττάρων του όγκου εναντίον των CTLs και ΝΚ κυττάρων. Συγκεκριμένα υποθέτουμε ότι τα κύτταρα του όγκου προσελκύουν τα CTLs και τα ΝΚ κύτταρα και τα καταστρέφουν με τη διαδικασία της κυτταρόλυσης. Τα διφωσφονικά οξέα χρησιμοποιούνται ευρέως για τη θεραπεία του ΠΜ, ενώ η θαλιδομίδη χρησιμοποιείται σήμερα για τη θεραπεία πολλών τύπων ΠΜ. Μελετήσαμε την επίδραση της θαλιδομίδης, του ζολεδρονικού οξέος και το συνδυασμό τους στην επιβίωση των μυελωματικών κυττάρων. Βρήκαμε ένα συνεργιστικό αποτέλεσμα των δύο αυτών ουσιών. Όταν η θαλιδομίδη συγχοηγηθεί με το ζολεδρονικό οξύ σε ελάχιστους μη δραστικούς μηχανισμούς, μειώνει την τοξική επίδραση 50% του τελευταίου 3-4 φορές. / Multiple Myeloma (MM) is a plasma cell neoplasia which, to this day, remains incurable. In MM, the immune system fails to destroy the malignant plasmocytes, and evidence exists that the tumor plays an active part in this. In the present study, we tested various MM cell lines for the expression of pro- and anti-apoptotic genes. We found that MM cells express an abnormal phenotype, namely fas high/bcl low. By studying bone marrow cells from a patient suffering of MM IgG/k type stage IIIA, we found that those cells expressed granzyme B nad perforin, normally expressed by cytotoxic T cells (CTLs) and natural killer (NK) cells. We propose that this may constitute an additional acquired mechanism by the tumor cells to protect themselves against the host.

Το Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο (ΜΔΣ) αποτελεί μια ετερογενή ομάδα κλωνικών αιματολογικών διαταραχών με κοινό χαρακτηριστικό τη μη αποδοτική αιμοποίηση που οδηγεί σε ανθεκτικές κυτταροπενίες και συχνή εκτροπή προς Οξεία Λευχαιμία (ΟΛ). Η παράδοξη συνύπαρξη ενός πληθωρικού ή νορμοκυτταρικού μυελού των οστών και κυτταροπενιών στην περιφέρεια έχει αποδοθεί στην αυξημένη απόπτωση προγονικών και ώριμων αιμοποιητικών κυττάρων του μυελού των ασθενών αυτών. Παρ'όλ'αυτά, αιτιοπαθογενετική σχέση της υπέρμετρης απόπτωσης με την ανεπαρκή κλωνογόνο ικανότητα των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων του μυελοδυσπλαστικού μυελού δεν τεκμηριώνεται επαρκώς από τα υπάρχοντα ερευνητικά δεδομένα. Αντίθετα, αδιαμφισβήτητη είναι η συσχέτιση της κατάργησης των μηχανισμών του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου στο προχωρημένο ΜΔΣ με την εκτροπή της νόσου προς ΟΛ. Η αυξημένη έκφραση αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών όπως οι Bcl-2, Bcl-xL, IAPs, survivin έχει προταθεί ότι υποστηρίζει την πρόοδο της νόσου και την επακόλουθη λευχαιμική εξέλιξη. Οι Heat Shock Proteins αποτελούν θεμελιώδεις πρωτεΐνες, ως προς τις αποφάσεις των κυττάρων σχετικά με την επιβίωση ή το θάνατό τους. Η Hsp73, ένα σταθερά εκφραζόμενο μέλος, και οι Hsps 72 και 27, δύο ισχυρά επαγόμενες από ποικίλα στρεσσογόνα ερεθίσματα πρωτεΐνες, είναι τρεις από τις πιο σημαντικές Hsps εκδηλώνοντας πολυδιάστατη αντι-αποπτωτική δράση και παρέχοντας ισχυρή κυτταροπροστασία. Σε αρκετά είδη συμπαγών όγκων αλλά και αιματολογικών κακοηθειών έχει δειχθεί υπερέκφραση των Hsps, ενώ έχει προταθεί ακόμη και αιτιοπαθογενετική σχέση της διαταραχής της έκφρασης των πρωτεϊνών αυτών με την ογκογένεση. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η εκτίμηση του βαθμού της απόπτωσης στα προγονικά και ώριμα κύτταρα μυελού ασθενών με ΜΔΣ και η περαιτέρω διερεύνηση της ουσιαστικής συνεισφοράς του φαινομένου στην ανεπαρκή κλωνογόνο ικανότητα των προγονικών κυττάρων και, κατ' επέκταση, στη μη αποδοτική αιμοποίηση που χαρακτηρίζει το σύνδρομο. Εν συνεχεία, διερευνήθηκαν οι αποπτωτικές μεταβολές κατά την πρόοδο της νόσου οι οποίες συσχετίσθηκαν με την έκφραση των αντι-αποπτωτικών Heat Shock Proteins. Η έκφραση των Hsps 72, 27 & 73 μελετήθηκε υπό συνθήκες ηρεμίας (βασική έκφραση, ΒΕ), ενώ ελέγχθηκε η επαγωγιμότητα των Hsps 72 και 27 κατόπιν εφαρμογής θερμικού shock ή ο-αποπτωτικής διέγερσης με συνδυασμό κυτταροκινών (TNFα+IFNγ). Η προσδιοριζόμενη έκφραση των Hsps συσχετίσθηκε, κατόπιν, με την απόπτωση και το στάδιο της νόσου. Η παρούσα μελέτη επιβεβαιώνει την παρουσία αυξημένης απόπτωσης τόσο στα ώριμα CD34- όσο και στα προγονικά CD34+ κύτταρα του μυελού ασθενών με ΜΔΣ με αξιοσημείωτη ετερογένεια να διέπει τα αποτελέσματα ακόμη και μεταξύ ασθενών της ίδιας κατά FAB κατηγορίας νόσου. Τα επίπεδα ανιχνευόμενης απόπτωσης υπερείχαν σημαντικά στο μυελό των ασθενών με "πρώιμη" (RA και RARS) έναντι εκείνων με "προχωρημένη" (RAEB και RAEB-t) νόσο, ενισχύοντας τη θεωρία της κατάργησης των αποπτωτικών μηχανισμών κατά την πρόοδο της νόσου. Μετά από 24 ώρες υγρής καλλιέργειας, το ποσοστό των ανιχνευόμενων πρώιμων αποπτωτικών CD34+ κυττάρων μυελού ασθενών με ΜΔΣ μειώθηκε σημαντικά. Προκειμένου να διερευνηθεί η πραγματική συμβολή της απόπτωσης στη μη αποδοτική αιμοποίηση του ΜΔΣ in vitro, αποπτωτικά και μη αποπτωτικά προγονικά CD34+ φρέσκα κύτταρα μυελού διαχωρίστηκαν με τη μέθοδο του Κυτταροδιαχωρισμού ενεργοποιούμενου από φθορισμό και τοποθετήθηκαν σε βραχείας διάρκειας ημιστερεές καλλιέργειες, όπου ελέγχθηκε η σχετική κλωνογόνος ικανότητά τους. Τόσο τα αποπτωτικά όσο και τα μη αποπτωτικά CD34+ κύτταρα των ασθενών με ΜΔΣ επέδειξαν εξίσου ανεπαρκή ανάπτυξη in vitro, υποδεικνύοντας ότι η παρουσία απόπτωσης δεν επηρεάζει σημαντικά τη συμπεριφορά των κυττάρων στην καλλιέργεια. Η βασική ενδοκυττάρια έκφραση των αντιαποπτωτικών Hsps 27, 72 και 73 βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στο μυελό ασθενών με ΜΔΣ. Η υπερέκφραση των Hsps αφορούσε κυρίως τα ολικά μονοπύρηνα κύτταρα του μυελού των ασθενών, ενώ τα προγονικά CD34+ κύτταρα δεν επέδειξαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα των υπό μελέτη πρωτεϊνών. Επιπλέον, η εφαρμογή θερμικού shock οδήγησε επιτυχώς στην επαγωγή των Hsps 27 και 72 στο μυελό ασθενών και μαρτύρων, προσεγγίζοντας όμως υψηλότερα τελικά επίπεδα έκφρασης στο μυελό των ασθενών. Tόσο η βασική όσο και η εκ θερμικού stress επαγόμενη έκφραση της Hsp72 βρέθηκε σημαντικά ενισχυμένη στα μονοπύρηνα κύτταρα του μυελού ασθενών με "προχωρημένου τύπου" ΜΔΣ, ενώ σημαντικά θετική συσχέτιση τεκμηριώθηκε μεταξύ της έκφρασης ηρεμίας των τριών Hsps και του ποσοστού των βλαστών του μυελού των ασθενών. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ενδεχόμενο ρόλο της υπερέκφρασης των Hsps στην ευνοϊκή επιλογή και εξάπλωση των κλωνικών κυττάρων και, συνεπακόλουθα, στην πρόοδο της νόσου. Η συνδυασμένη επίδραση κυτταροκινών σε κύτταρα φυσιολογικών μυελών οδήγησε σε σημαντική μείωση της έκφρασης της Hsp72, ενώ στο 36% των ασθενών παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης της Hsp72. Τέλος, αρνητική ήταν η συσχέτιση της βασικής ή επαγόμενης έκφρασης των Hsps με την αυτόματη ή προκλητή απόπτωση σε ολικά ή προγονικά κύτταρα μυελού ασθενών με ΜΔΣ, επιβεβαιώνοντας τον κυτταροπροστατευτικό τους ρόλο. Συνοψίζοντας, τα ευρήματα της παρούσας μελέτης επιβεβαιώνουν την παρουσία αυξημένης απόπτωσης στο μυελό των ασθενών με ΜΔΣ, ιδιαίτερα πρώιμου τύπου. Τα πρώιμα αποπτωτικά προγονικά κύτταρα επιδεικνύουν δυνατότητα διαφυγής από τον κυτταρικό θάνατο και σχετική λειτουργική ανάνηψη κατά την απομάκρυνσή τους από το προαποπτωτικό μικροπεριβάλλον του μυελού. Εναλλακτικά, πρόκειται για κύτταρα που, εξ'αιτίας αποτυχίας του αποπτωτικού μηχανισμού να περατωθεί, υφίστανται "ατελή απόπτωση" και διασώζονται, φέροντα όμως δυνητικά ογκογόνες μεταλλάξεις. Η γενική αντίληψη, πάντως, που καθιστά την απόπτωση ως την αιτία της μη αποδοτικής αιμοποίησης του συνδρόμου κλονίζεται, καθώς αποπτωτικά και μη αποπτωτικά προγονικά κύτταρα διαθέτουν παρόμοια κλωνογόνο ικανότητα, in vitro; φαίνεται ότι επιπρόσθετες ενδογενείς ανωμαλίες περιορίζουν το κλωνογόνο δυναμικό αποπτωτικών και μη προγονικών κυττάρων. Η υπερέκφραση Hsps που τεκμηριώθηκε στο μυελό ασθενών με ΜΔΣ ενδεχομένως υποστηρίζει την διαδικασία κακοήθους εξαλλαγής μέσω της σιωπηρής συσσώρευσης μεταλλάξεων στα κύτταρα του κλώνου. Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα των αντι-αποπτωτικών αυτών πρωτεϊνών θα μπορούσε να ευθύνεται για την προτεινόμενη ατελή απόπτωση των κυττάρων του μυελοδυσπλαστικού μυελού. Όπως προκύπτει από τη σημαντική συσχέτιση της έκφρασης των Hsps τόσο με το ποσοστό βλαστών όσο και με το στάδιο της νόσου, τα υπερεκφράζοντα ώριμα με τα αντίστοιχα προγονικά τους παθολογικά κύτταρα, ενέχοντας πλεονέκτημα επιβίωσης έναντι των φυσιολογικών στο προ-αποπτωτικό μικροπεριβάλλον του δυσπλαστικού μυελού, φαίνεται ότι επιλέγονται και επικρατούν κατά την πρόοδο της νόσου. Σε ένα τέτοιο υπόστρωμα αντίστασης στην απόπτωση ένα επιγενετικό συμβάν που αναστέλλει τη διαφοροποίηση ενδέχεται να πυροδοτήσει τη λευχαιμική εκτροπή. / Myelodysplastic syndrome comprises a heterogeneous group of clonal stem cell disorders characterized by ineffective hematopoiesis leading to refractory cytopenias and frequent evolution to acute myeloid leukemia (AML). The existing inconsistency between normal or hypercellular bone marrow and peripheral blood cytopenias remains a paradox that has been attributed to excessive intramedullary apoptosis. However, a causative relationship of apoptosis to the progenitor’s defective clonogenic growth has not been sufficiently demonstrated. On the other hand, it is widely accepted that abrogation of apoptotic control in advanced MDS favours the expansion of the malignant clone and contributes to the frequently observed evolution to acute myeloid leukaemia (AML). Enhanced expression of antiapoptotic proteins Bcl-2, Bcl-xL, IAPs, survivin has been proposed to contribute to elimination of apoptosis, disease progression and subsequent leukemic evolution. Heat Shock Proteins (Hsps) are fundamental for cell life and death decisions and essential for the coordination between proliferation, differentiation and apoptosis. Hsp73, one of the constitutively expressed Hsps, and Hsps 72 and 27, two strongly inducible by several stress stimuli proteins, are three of the most important Hsps. These three Hsps regulate programmed cell death by interfering with multiple key-regulatory points of the apoptotic cascade, acting as apoptosis inhibitors and conferring strong cytoprotection. Hsps 72 and 27 are overexpressed in a number of human cancers and haematological malignancies, while a causative relationship of these proteins to oncogenesis has even been proposed. The aim of our study was to determine the degree of programmed cell death in progenitor and mature bone marrow cells of MDS patients. Moreover, apoptosis' actual contribution to defective clonogenic capacity of MDS progenitors and, subsequently, to ineffective hematopoiesis in MDS was assessed. Furthermore, apoptosis modifications during disease progression were detected and correlated to the expression of antiapoptotic Hsps. Hsps 72, 27 and 73 intracellular expression was studied under conditions of tranquillity in bone marrow and progenitor cells of MDS patients, while the inducibility of Hsps 27 and 72 was further tested after application of an environmental type of stress (heat shock) and pro-apoptotic stimulation under combined cytokine treatment (TNFα+IFNγ). Finally, we determined an existing link between Hsps' levels, apoptosis and disease progression. Apoptosis was significantly augmented in both progenitor and mature bone marrow cell fractions from MDS patients. Apoptosis determined in the bone marrow of patients with "early" MDS (RA and RARS) significantly exceeded cell death levels detected in those with "advanced" (RAEB and RAEB-t) disease, supporting the theory of apoptosis' abrogation as the disease evolves. We should remark, however, that even inside the same FAB-category, a great heterogeneity existed in results. After 24 hours of liquid culture the percentage of early apoptotic progenitors in MDS BM significantly decreased. In order to determine apoptosis' actual contribution to defective clonogenic capacity of MDS progenitors, “apoptotic” and “non-apoptotic” bone marrow CD34+ cells were sorted by FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) and their differential clonogenic capacity was assessed in a short-term semisolid culture system. There was no correlation between apoptosis’ existence and culture performance, since non-apoptotic as well as apoptotic CD34+ bone marrow cells both exhibited similar defective growth. Basal intracellular expression of antiapoptotic Hsps 27, 72 and 73 was found significantly elevated in bone marrow cells of MDS patients. Hsps overexpression mainly involved total BMMC, while higher protein levels were also detected within patients’ progenitor bone marrow cells, but the differences noted did not attain statistical significance. Moreover, HS treatment provoked the effective induction of Hsps 27 and 72 in both MDS and normal subjects leading to the achievement of even higher final protein levels in the patients’ marrow, despite the already enhanced basal expression. Both basal and HS-induced Hsp72 expression were significantly enhanced in BMMC of MDS patients with advanced disease, while a positive correlation between all three Hsps basal expression and blast percentage was established in the patients' marrow. These findings suggest a probable role of Hsps overexpression in the favored selection and expansion of clonal cells, further hematopoiesis depression and disease progression. Combined pro-apoptotic treatment of normal BM cells caused a significant downregulation of Hsp72. On the contrary, BM cells from MDS patients responded by elevating the expression of cytoprotective Hsp72 in about 36% of cases. Finally, in accordance to the well-demonstrated cytoprotective role of Hsps, an inverse correlation was noted between spontaneous or induced apoptosis and Hsps basal or induced expression. In conclusion, our findings support the previous observations of increased apoptosis in MDS marrow, especially in "early" disease. Interestingly, early apoptotic MDS progenitors exhibit the potential to escape from apoptosis and even recover functionally, as shown in CFU-assays, when separated from the bone marrow microenvironment, the main source of pro-apoptotic signalling. Alternatively, these cells, due to intrinsic defects in cell death activated pathways, may undergo incomplete apoptosis and get rescued possibly carrying, though, potentially transforming mutations. However, apoptosis does not seem to be the only cause of impaired clonogenic growth in MDS, as apoptotic and non-apoptotic progenitors exhibit similar patterns of growth, both defective compared to normal. Apparently, additional intrinsic abnormalities limit the clonogenic potential of apoptotic and non-apoptotic progenitors. Augmented Hsps expression established in MDS marrow may support the underlying transformation process through the suppression and silent gathering of mutations, probably promoting viability and growth of otherwise mutant cells. Moreover, increased levels of anti-apoptotic Hsps may account for the proposed incomplete apoptosis of MDS marrow cells. Hsps appear to provide resistance against spontaneous or induced apoptosis to the overexpressing cell population. Hsps' positive correlation to blast count and disease stage implies that the overexpressing mature cells along with their abnormal progenitors, encompassing a survival advantage over normal cells in the pro-apoptotic MDS marrow, get selected and expanded during disease progression. On such a background of non-susceptibility to apoptosis a secondary event blocking differentiation could lead to leukaemic transformation.

Η νόσος Parkinson είναι μία νόσος νευροεκφυλιστικής φύσεως, η οποία αναπτύσσεται προοδευτικά και χαρακτηρίζεται κλινικά από κινητική δυσλειτουργία. Τα αίτια της νόσου μέχρι σήμερα είναι άγνωστα. Η εκφύλιση της ντοπαμινεργικής μελαινοραβδωτής οδού στη νόσο Parkinson οδηγεί σε επακόλουθη ελάττωση του νευροδιαβιβιστή ντοπαμίνη στο ραβδωτό σώμα και σε διαταραχή της ισορροπίας της λειτουργίας του κυκλώματος των βασικών γαγγλίων, γεγονός που έχει ως συνέπεια την εμφάνιση των κινητικών συμπτωμάτων της νόσου. Ο μυς weaver αποτελεί ένα εξαιρετικό πειραματικό μοντέλο για τη διαλεύκανση των μηχανισμών που ευθύνονται για την προοδευτική εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων, η οποία λαμβάνει χώρα ενδογενώς και προοδευτικά. Στην παρούσα διατριβή εξετάστηκε ο πιθανός ρόλος του οξειδωτικού στρες και της απόπτωσης στη νευροεκφύλιση των μυών weaver. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκαν οι εγκεφαλικές περιοχές που εμπλέκονται άμεσα ή έμμεσα στη μελαινοραβδωτή νευροεκφύλιση καθώς και η παρεγκεφαλίδα. Επίσης, στις παραπάνω περιοχές, μελετήθηκε η έκφραση των αποπτωτικών/αντι-αποπτωτικών γονιδίων της οικογένειας bcl-2 καθώς και η έκφραση των προστατευτικών θερμοεπαγόμενων γονιδίων, Hsp27 και Hsp70. Οι παραπάνω μελέτες έγιναν σε φυσιολογικούς και weaver μύες 21 ημερών επειδή στο στάδιο αυτό η εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων έχει φτάσει στο 42% και οι ντοπαμινεργικοί δενδρίτες είναι ήδη μειωμένοι κατά 76%. Τα αποτελέσματα και τα συμπεράσματα της διατριβής συνοψίζονται στα παρακάτω: Οι weaver μύες παρουσίασαν σημαντική αύξηση του οξειδωτικό στρες στη παρεγκεφαλίδα και στο μεσεγκέφαλο που είναι οι εγκεφαλικές περιοχές στις οποίες συμβαίνει νευροεκφύλιση. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι το οξειδωτικό στρες πιθανόν να συμμετέχει στη νευροεκφύλιση των περιοχών αυτών. Επίσης η παρεγκεφαλίδα και ο μεσεγκέφαλος εμφάνισαν υψηλά επίπεδα κατακερματισμένου DNA. Σημαντικά επίπεδα κατακερματισμένου DNA εμφάνισαν και άλλες περιοχές του εγκεφάλου που εξετάστηκαν. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι η απόπτωση πιθανόν να συμμετέχει στη νευροεκφύλιση των περιοχών αυτών. Τόσο τα επίπεδα έκφρασης του αντιαποπτωτικού γονιδίου bcl2 όσο και τα επίπεδα έκφρασης των προστατευτικών και αντιαποπωτικών γονιδίων Hsp27 και Hsp70, βρέθηκαν αυξημένα στη παρεγκεφαλίδα των Weaver μυών υποδηλώνοντας ότι τα κύτταρα της παρεγκεφαλίδας επιστρατεύουν αμυντικούς μηχανισμούς έναντι του οξειδωτικού στρες και της απόπτωσης. / The Parkinson disease is a neurodegeneration disease that develops progressively and it is clinically characterized by motor disturbances. The degeneration of nigrostriatal dopaminergic innervations in Parkinson disease leads to subsequent decrease of dopamine neurotransmitter in corpus striatum and to disturbance of operational equilibrium of basal ganglia circuit. The result of this is the motor symptoms that the disease appears. The weaver mouse constitutes an excellent Parkinson model for understanding the mechanisms which are responsible for the progressive degeneration of the dopaminergic neurons. The roles of oxidative stress and apoptosis in the neurodegeneration of weaver mice were investigated. The brain regions that are involved directly or indirectly in nigrostriatal dopaminergic innervations as well as cerebellum were examined. In addition, the expression of the apoptotic/antiapoptotic genes of bcl-2 family as well as the expression of the protective heat shock protein genes, Hsp27 and Hsp70. were examined in the above brain regions. The results and conclusions of this work are summarized bellow: The weaver mice showed significant increase of the oxidative stress in cerebellum and midbrain which are the major regions where neurodigeneration takes place. These results suggest that oxidative stress is probably involved in the neurodigeneration of these regions. All brain regions of weaver mice examined showed significant increases in fragmented DNA with the higher fragmentation taking place in the cerebellum and in midbrain. These results suggest that apoptosis is may involved in the neurodegeneration of all these regions. The expression levels of the antiapoptotic gene bcl-2 as well as the expression of the protective heat shock protein genes, Hsp27 and Hsp70, were found to increase in the cerebellum of the weaver mice suggesting that the cerebellum cells recruit defense mechanisms against oxidative stress and apoptosis.

Οι υπερίτες του αζώτου (nitrogen mustards) συνιστούν μία αποτελεσματική ομάδα φαρμάκων που χρησιμοποιούνται στη χημειοθεραπεία του καρκίνου. Πρόσφατα ευρήματα της ερευνητικής μας ομάδας έδειξαν ότι οι υπερίτες του αζώτου μελφαλάνη (MEL), χλωραμπουκίλη (CAB) και ο δραστικός της μεταβολίτης, το PHE, επιδεικνύουν ισχυρή θραυσματογόνο δράση, αλλά επιπρόσθετα, εμφανίζουν ανευπλοειδογόνο δράση, διαταράσσοντας το χρωμοσωματικό αποχωρισμό μέσω τροποποιήσεων της δομής και λειτουργίας της μιτωτικής συσκευής. Στην παρούσα διατριβή, διερευνήθηκε περαιτέρω ο μηχανισμός της ανευπλοειδογόνου δράσης των παραπάνω δραστικών ενώσεων και πραγματοποιήθηκε σύγκριση της γενετικής δράσης δύο νέων στεροειδών αναλόγων του PHE, τα ανάλογα ΕΑ-92 και ΕΑ-97 με αυτήν των MEL, CAB και PHE. Τα στεροειδή ανάλογα σχεδιάστηκαν με στόχο την αύξηση της εκλεκτικότητας της αντινεοπλασματικής δράσης. Η ικανότητα των MEL, CAB και PHE να προκαλούν φαινόμενα χρωμοσωματικής καθυστέρησης μελετήθηκε σε σύγκριση με τα στεροειδή ανάλογα ΕΑ-92 και ΕΑ-97. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα in vitro με τη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης (CBMN) σε συνδυασμό με τη μέθοδο FISH και τη χρήση πανκεντρομερικού ανιχνευτή. Επιβεβαιώθηκε η θραυσματογόνος και ανευπλοειδογόνος δράση των ενώσεων MEL, CAB και PHE, ενώ φάνηκε ότι τα στεροειδή ανάλογα ΕΑ-92 και ΕΑ-97 προκαλούν αποκλειστικά χρωμοσωματική θραύση. Το φαινόμενο της χρωμοσωματικής καθυστέρησης μελετήθηκε επίσης με τη μέθοδο CREST στην κυτταρική σειρά ποντικού C2C12. Με τη μέθοδο αυτή, επιβεβαιώθηκε η διπλή γενετική δράση των ενώσεων MEL, CAB και PHE. Τα στεροειδή ανάλογα ΕΑ-92 και ΕΑ-97 εμφανίστηκαν ως οι ηπιότεροι επαγωγείς ΜΝ και προκαλούν κυρίως χρωμοσωματική θραύση, ενώ ήπια ανευπλοειδογόνο δράση παρουσίασε μόνο το ανάλογο ΕΑ-92. Ακολούθως, εξετάσθηκε η ικανότητα των υπό εξέταση χημικών ενώσεων ΕΑ-92 και ΕΑ-97, να επηρεάζουν τη δομή και λειτουργία της μιτωτικής συσκευής σε σχέση με αυτήν των ενώσεων MEL, CAB, PHE, με διπλό ανοσοφθορισμό για τη β- και γ-τουμπουλίνη. Παρατηρήθηκε ότι όλες οι ενώσεις, εκτός από το στεροειδές ΕΑ-97 προκαλούν τη δημιουργία πολυπολικών μεταφάσεων, ενώ όλες οι ενώσεις επάγουν το σχηματισμό μεσοφασικών κυττάρων με ανώμαλο αριθμό κεντροσωμάτων. Όλες οι υπό εξέταση χημικές ενώσεις εμφανίζουν κυτταροτοξικότητα και καθυστέρηση του κυτταρικού κύκλου σε καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων και στα κύτταρα ποντικού C2C12. Στη συνέχεια διερευνήθηκε η ικανότητα των υπό εξέταση ενώσεων να επάγουν την απόπτωση και μελετήθηκε ο ρόλος της απόπτωσης στην εκδήλωση της γενετικής δράσης των ενώσεων MEL, CAB και PHE. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε στα κύτταρα C2C12 με τη μέθοδο της διπλής χρώσης Αννεξίνης V/Ιωδιούχου προπιδίου και το διπλό ανοσοφθορισμό β- και γ-τουμπουλίνης, ανεξάρτητα, σε κύτταρα ποντικού C2C12, παρουσία του γενικού αναστολέα της δράσης των κασπασών, Z-VAD-FMK, αλλά και αναστολέων της δράσης συγκεκριμένων κασπασών. Όλες οι υπό εξέταση ενώσεις επάγουν χαμηλά ποσοστά απόπτωσης. Οι κασπάσες-3, -6 και -8 συμμετέχουν στην επαγόμενη από τη MEL απόπτωση αλλά δεν συμμετέχουν στην απομάκρυνση των κυττάρων με μικροπυρήνες που επάγονται από τη δράση της ίδιας ένωσης. Η απόπτωση αποτελεί μηχανισμό απομάκρυνσης των κυττάρων με μικροπυρήνες και κανονικό κεντροσωματικό αριθμό που επάγονται από τις ενώσεις MEL, CAB και PHE. Αντίθετα, τα κύτταρα με υπεράριθμα κεντροσώματα, που προκύπτουν από τη δράση των παραπάνω ενώσεων δεν απομακρύνονται μέσω απόπτωσης. Για την περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίο οι δραστικές ενώσεις MEL και CAB εκφράζουν τις ανευπλοειδογόνες ιδιότητες τους, μελετήθηκε η επίδραση τους στην έκφραση των πρωτεϊνών Aurora-B, survivin, Aurora-A και γ-τουμπουλίνη σε κύτταρα ποντικού C2C12, με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης των πρωτεϊνών. Παράλληλα μελετήθηκε η ένωση ΕΑ-97, η οποία σύμφωνα με τα ευρήματα μας, εμφάνισε αποκλειστικά θραυσματογόνο δράση. Οι ενώσεις MEL και CAB, εκδηλώνουν τις ανευπλοειδογόνες ιδιότητες τους προκαλώντας μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνών Aurora-B και survivin και επάγοντας την αύξηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Aurora-A. Επιπρόσθετα, η ένωση MEL, προκαλεί αύξηση της έκφρασης της γ-τουμπουλίνης. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν τη συμμετοχή των παραπάνω πρωτεϊνών στην εκδήλωση της ανευπλοειδογόνου δράσης των ενώσεων που μελετήθηκαν. Αντίθετα το στεροειδές ανάλογο ΕΑ-97 που εμφανίζει αποκλειστικά θραυσματογόνο δράση, δεν μεταβάλλει την έκφραση των παραπάνω πρωτεϊνών. / Nitrogen mustards represent an effective class of drugs that are used in chemotherapy. Recent findings of our group have shown that nitrogen mustard analogues, melphalan (MEL), chlorambucil (CAB) and PHE, in addition to their clastogenic activity, they exert their aneugenic potential by affecting chromosome segregation due to modifications of mitotic apparatus. In the present study, we investigated the mechanism by which the above compounds display their aneugenicity in comparison with two new steroidal analogues of PHE, EA-92 and EA-97, which were designed aiming at most effective antineoplasmatic activity. The ability of MEL, CAB and PHE to induce chromosome delay events was studied in comparison with the steroidal analogues EA-92 and EA-97. The mechanism of micronucleation was determined by Cytokinesis Block Micronucleus assay (CBMN assay) in combination with Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) using pancentromeric DNA probe. It was confirmed that MEL, CAB and PHE generated MNi by two mechanisms, chromosome breakage and chromosome delay, while EA-92 and EA-97 induced the formation of MN originated exclusively from chromosome breakage events. The ability of the tested compounds to induce chromosome delay was also investigated in C2C12 mouse cells by CREST analysis. The dual genetic activity of MEL, CAB, and PHE was confirmed in a different biological system. The analogues EA-92 and EA-97 appeared as weaker MN inducers and they induced mainly chromosome breakage, while a weak aneugenic activity was observed for EA-92. The ability of the nitrogen mustard analogues to affect the organization of mitotic apparatus was investigated in comparison with MEL, CAB and PHE by double immunofluorescence of β- and γ-tubulin in C2C12 mouse cells. It was observed that all compounds, except EA-97, induced mutlipolar metaphases, and also generated interphase cells with abnormal centrosome number. All compounds displayed increased cytotoxicity and they caused cell cycle delay in human lymphocyte cultures and in C2C12 mouse cells. The ability of the tested compounds to induce apoptosis was studied by Annexin V/PI assay. It was revealed that all compounds induced apoptosis. The effect of apoptosis on the genetic activity of MEL, CAB and PHE was investigated by inhibition of apoptosis in the presence of the inhibitor Z-VAD-FMK and the use of specific inhibitors for caspase -3, -6, -8 and -1. For this reason Annexin V/PI assay and double immunofluorescence of β- and γ-tubulin were performed, independently in C2C12 mouse cells. Caspases -3, -6 and -8 are involved in melphalan-induced apoptosis, but they are not involved in the elimination of cells in the presence of melphalan. Apoptosis is the responsible mechanism for the exclusion of cells with MNi and normal centrosome number that are induced by MEL, CAB and PHE. On the contrary, cells exerting supernumerary centrosomes are not eliminated by apoptosis in the presence of the above compounds. To further elucidate the mechanisms by which MEL and CAB exert their aneugenic potential, we examined the ability of the compounds to alter the expression of proteins having important role in chromosome segregation, such as the proteins Aurora-B, survivin, Aurora-A and γ-tubulin. The analysis was performed by Western blot method in C2C12 mouse cells. We also studied the steroid analogue EA-97, which according to our findings acts as a pure clastogen and do not exert aneugenic potential as opposed to MEL and CAB. MEL and CAB exert their aneugenic potential by the reduction of Aurora-B and survivin expression and by enhancing the expression of Aurora-A. γ-tubulin was upregulated in the presence of MEL. These findings show the implication of these proteins in chromosome delay events induced by MEL and CAB. On the other hand, the analogue EA-97 did not affect the expression of the above proteins.