No description available.

No description available.

- / -

Haematopoietic stem cells (HSC) are strictly regulated by intrinsic regulators and extrinsic signals from the microenvironment. Nov (CCN3), a matricellular protein of the CCN family, has been reported as a suppressor gene in solid tumours and chronic myeloid leukaemia (CML). Recent study identified Nov as a positive regulator in human cord blood CD34+ stem cells. However, the functions of Nov in haematopoiesis and adult HSC remain largely unknown.

L’acide valproïque (VPA) est un inhibiteur des histones désacétylases (HDACi), qui présente des propriétés anti-tumorales nsur différents types de cancers. Son utilisation depuis plusieurs décennies comme médicament antiépileptique a révélé des effets secondaires, notamment sur le système hématopoïétique. Dans la présente étude, nous nous sommes intéressés à l’effet du VPA sur les réseaux microARN (miR)/Facteurs de transcription (FT) spécifiquement impliqués dans la régulation des voies de différenciation érythro-mégacaryocytaires. Nous montrons que le VPA est capable d’inhiber la différenciation érythroïde dans les cellules érythroleucémiques humaines TF1 et K562 et dans les cellules souches hématopoïétiques (CSH) CD34+, stimulées par l’érythropoïétine recombinante (Epo) ou par l’aclacinomycine A. Cette inhibition se traduit par une diminution de l’expression de la glycophorine A, de la γ-globine, des miR-144/451 et du FT GATA-1. L’inhibition du pré-miR-144 suggère que le VPA est capable de réguler l’expression du gène miR-144/451 au niveau transcriptionnel, via GATA-1. Dans les cellules Epo/CD34+, le VPA induit l’augmentation du FT PU.1 en accord avec l’inhibition du miR-155 et favorise son interaction avec GATA-1 pour inhiber son activité. L’utilisation d’un analogue du VPA, sans activité HDACi (Valpromide) et d’un inhibiteur d’HDAC de classe I, le MS-275, a montré que l’activité HDACi du VPA n’est pas requise pour l’inhibition de la différenciation érythroïde. Le VPA affecte également la voie mégacaryocytaire issue d’un progéniteur commun aux cellules érythroïdes. Dans la lignée mégacaryoblastique Meg-01, le VPA induit des modifications morphologiques du type mégacaryocytaire, une augmentation du marqueur CD61, du FT GATA-2 et du miR-27a. En revanche, l’expression du FT GATA-1 et des miR-144/451 diminuent. L’augmentation du miR-27a coïncide avec la diminution de l’expression de l’ARNm du FT RUNX1, en accord avec l’induction de la voie mégacaryocytaire. En conclusion, le VPA est capable de moduler le programme de différenciation érythro-mégacaryocytaire, à travers un micro réseau de régulation miR/FT / Valproic acid (VPA), a histone deacetylase inhibitor (HDACi), exhibits anti-cancer properties against several tumor types. Its use as an anti-epileptic drug for several decades reveled side effects at the hematological level. In this study, we analyzed the effect of VPA on an erythro-megakaryocyte-specific miR/transcription factors network. VPA inhibited erythroid differentiation in the erythroleukemia cell lines TF1 and K562 as well as in CD34+/hematopoietic stem cells (HSCs), induced by the recombinant erythropoietin (Epo) or aclacinomycin. This inhibition was characterized by glycophorin-A, γ-globin and GATA-1/miR-144/451 down-regulation. Inhibition of pre-miR-144 expression suggested that VPA regulates transcription of the miR-144/451 gene through GATA-1. In Epo-stimulated HSCs, VPA induced PU.1 expression in correlation with miR-155 inhibition and promoted GATA-1/PU.1 interaction. The use of valpromide, a VPA analogue without HDACi activity and the class-I HDACi MS-275, showed that HDAC inhibition by VPA was not required for its inhibitory activity on erythropoiesis. VPA also induced megakaryocyte features in Meg-01 cells, at both cellular and molecular levels. Notably, CD61, GATA-2 and miR-27a were over-expressed. RUNX1 mRNA expression and GATA-1/miR-144/451 axis decreased in accordance with megakaryocyte differentiation. In conclusion, VPA is able to modulate erythro-megakaryocytic differentiation program, through a regulatory micro-network involving miRs and TFs

Στην επίκτητη απλαστική αναιμία (ΑΑ) ο υποκυτταρικός μυελός και η πανκυτταροπενία στο περιφερικό αίμα είναι αποτέλεσμα βλάβης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι κύριο χαρακτηριστικό γνώρισμα της νόσου είναι η ποσοτική αλλά και ποιοτική διαταραχή της stem cell δεξαμενής. Κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα προτείνουν το σημαντικό ρόλο του ανοσοποιητικού συστήματος και ειδικά των Τ λεμφοκυττάρων στην ανάπτυξη της απλαστικής αναιμίας. Σήμερα, πλέον, είναι ευρύτερα αποδεκτό ότι η καταστολή του μυελού, που παρατηρείται στην ιδιοπαθή απλαστική αναιμία, είναι αποτέλεσμα της υπερπαραγωγής των μυελοκατασταλτικών κυτταροκινών IFN-γ και TNF-α από διεγερμένα CD8+ κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα, τα οποία συναντούμε τόσο στο περιφερικό αίμα όσο και στο μυελό ασθενών με απλαστική αναιμία. Οι κυτοκίνες αυτές παρουσιάζουν μάλλον προσθετική αντί συνεργική δράση, η οποία σχετίζεται με την IFN-γ-εξαρτώμενη αύξηση της έκφρασης του Fas στα CD34+ κύτταρα και από την IFN-γ-επαγώμενη έκκριση του TNF-α από τα μακροφάγα. Μελέτες έχουν δείξει ότι τόσο τα CD34+ όσο και τα BMMNC κύτταρα του μυελού των ασθενών με ΑΑ είναι περισσότερα αποπτωτικά σε σχέση με φυσιολογικούς μυελούς. Στόχος της διατριβής ήταν η περαιτέρω μελέτη των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανοσολογικής προέλευσης απλαστική αναιμία. Λόγω, όμως, του ότι η απλαστική αναιμία είναι μια σπάνια νόσος, η παρουσία ενός εύκολα αναπαραγώγιμου in vitro μοντέλου μυελικής απλασίας θα βοηθούσε περισσότερο στη μοριακή μελέτη αυτής. Στη μελέτη μας, η αναπαραγωγή του καταλληλότερου μοντέλου μυελικής απλασίας επιτεύχθηκε με την προσθήκη των μυελοκατασταλτικών κυτταροκινών IFN-γ και TNF-α σε φυσιολογικό σύστημα μακράς διάρκειας καλλιέργειας μυελού των οστών. Στο μοντέλο αυτό έγινε διερεύνηση των μοριακών μονοπατιών των σχετιζομένων με την Fas και TRAIL επαγόμενη απόπτωση. Παράλληλα, έγινε σύγκριση των δεδομένων από το in vitro μοντέλο με τα αποτελέσματα της παράλληλης μελέτης των αντίστοιχων μοριακών παραμέτρων σε κύτταρα μυελού ασθενών με απλαστική αναιμία. Στο IFN-γ/ΤNF-α μοντέλο παρατηρήθηκε σημαντική μείωση τόσο των πιο άωρων LTC-IC όσο και των πιο δεσμευμένων προγονικών κυττάρων, σε σχέση με τις καλλιέργειες-μάρτυρες. Επιπλέον, τα αποτελέσματα των πρωτογενών και δευτερογενών καλλιεργειών βραχείας διάρκειας σε μυελικά κύτταρα ασθενών με ενεργό νόσο, επιβεβαίωσαν το χαρακτηριστικό γνώρισμα της απλαστικής αναιμίας, δηλαδή, το μειωμένο αριθμό προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Η επώαση φρέσκων φυσιολογικών μυελικών κυττάρων, σε 5-6 εβδομάδων LTBMC σύστημα, με συνδυασμό των TNF-α/IFN-γ παραγόντων οδηγεί σε αύξηση της Fas mRNA έκφρασης στα CD34+ κύτταρα, κάτι που δεν παρατηρείται στα, αντίστοιχα, φρέσκα και στα 5-6 εβδομάδων κύτταρα-μάρτυρες. Το εύρημα αυτό σε συνδυασμό με τη χαμηλή mRNA έκφραση της caspase 3 καθώς και την απουσία έκφρασης των Bcl-2, Bax και της caspase 8 στον ίδιο πληθυσμό, προτείνουν το σημαντικό ρόλο του external μονοπατιού επαγωγής της απόπτωσης, όπως αυτό ρυθμίζεται από την δράση των μυελοκατασταλτικών κυτοκινών TNF-α/IFN-γ. Παράλληλα, η παρουσία χαμηλής Bcl-2 mRNA έκφρασης, στα CD34+ κύτταρα, τονίζει τη σημασία της αναλογίας προ-αποπτωτικών/αντι-αποπτωτικών σημάτων στη κυτταρική έκβαση. To σημαντικότερο, πάντως, εύρημα του TNF-α/IFN-γ μοντέλου είναι η συνεχής TRAIL mRNA έκφραση, στα CD34+ κύτταρα αυτού, κάτι το οποίο δεν έχει αναφερθεί, ως τώρα, στη βιβλιογραφία. Η μοριακή ανάλυση των μυελικών κυττάρων των ΑΑ ασθενών απεκάλυψε, εκτός της Fas mRNA έκφρασης στα BMMNC και/ή στα CD34+ κύτταρα, την αυξημένη TRAIL mRNA έκφραση στο CD34+ κυτταρικό πληθυσμό των ασθενών με ενεργό νόσο. Αντίθετα, στους ασθενείς σε ύφεση, απουσιάζει η έκφραση και των δύο γονιδίων στον ίδιο πληθυσμό. Ενώ, στα BMMNC η έκφραση του TRAIL mRNA παραμένει, ένα συνεχές εύρημα, ακόμη και στους ασθενείς σε ύφεση. Επιπρόσθετα, η μειωμένη έκφραση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων Bcl-xl και/ή Bcl-2 στα BMMNC όλων των ασθενών και του Bcl-xl στα CD34+ κύτταρα των ασθενών με ενεργό νόσο, δείχνει «ανίκανη» να αναστείλλει το μηχανισμό της απόπτωσης στους AA ασθενείς. Το γεγονός ότι η έκφραση του TRAIL mRNA είναι συνεχής στο CD34+ κυτταρικό πληθυσμό του TNF-α/IFN-γ μοντέλου και μόνο στα CD34+κύτταρα ΑΑ ασθενών με ενεργό νόσο, δείχνει τη σημαντικότητα του συγκεκριμένου μορίου στην απόπτωση των προγονικών κυττάρων στη μυελική απλασία. Συμπερασματικά, το μοντέλο μυελικής απλασίας που τελικά επιλέξαμε επιβεβαιώνει προηγούμενη γνώση της συμμετοχής των TNF-α και IFN-γ στη παθοφυσιολογία της απλαστικής αναιμίας. Παράλληλα, τα μοριακά δεδομένα, τόσο του μοντέλου όσο και των ασθενών με απλαστική αναιμία, ενισχύουν την εμπλοκή του Fas/FasL στη παθογένεση της νόσου και προτείνουν την πιθανή συμμετοχή του TRAIL/Apo2L στην όλη διαδικασία. / In aplastic anemia (AA) the hypocellular bone marrow and blood pancytopenia occur as a result of damage to hematopoietic stem cells . Previous studies have shown that a profound quantitative and qualitative defect in the stem cell compartment is a common feature in most patients with AA. Clinical and laboratory data suggest that the immune system, especially T lymphocytes, have an important role in the development of AA. It is well established that IFN-γ and TNF-α mediate hematopoietic stem cell suppression in aplastic anemia. These proinflammatory cytokines exhibit additive rather than synergistic effect, which may be mediated by the IFN-γ-dependent increase in Fas expression on CD34+ progenitor cells and by the IFN-γ-inducible secretion of TNF-α by macrophages. Bone marrow total mononuclear and progenitor cells from aplastic anemia patients are more apoptotic than cells from normal donors, indicating that apoptosis may be a major mechanism of stem cell loss in aplastic anemia. The aim of our study was to investigate the molecular mechanisms involved in the immune-mediated pathology of aplastic anemia. Since aplastic anemia is a rare disease the existence of an easily reproducible model of in vitro hematopoietic cell suppression can facilitate studies concerning the molecular pathways of this disease. In our study, we reproduced such a model with the addition of the myelosuppressive cytokines IFN-γ and TNF-α in a normal long term bone marrow culture system. In this model, we examined the Fas mediated pathway of apoptosis and especially the correlation between TRAIL expression and myelosuppression. We, also, studied these parameters in marrow cells from aplastic anemia patients. The IFN-γ and TNF-α inhibitory cytokines appeared to affect both immature LTC-ICs and more commited progenitor cells capable of lineage-specific colony formation (CFCs). In addition our progenitor cell assays results in patients, supported this unifying feature of reduced haematopoietic progenitor cells in aplastic anemia. TNF-α and IFN-γ treatment up-modulated Fas expression and induced apoptosis of 5-6 weeks cultured normal CD34+ cells, while normal freshly isolated and 5-6 weeks untreated cultured CD34+ cells showed no Fas mRNA expression. This finding, along with the low mRNA expression of caspase 3 and the absence of Bcl-2, Bax and caspase 8 expression, proposes the major role for activation of the extrinsic apoptosis pathway due to treatment of BMMNC with TNF-α and IFN-γ. In parallel, the existence of the low Bcl-xl mRNA expression in the same cell compartment points to the importance of the ratio of pro-apoptotic to anti-apoptotic signals, in cell fate. The most interesting finding is the constant TRAIL mRNA expression on CD34+ cells in TNF-α/IFN-γ treated LTBMC, something not mentioned before. Molecular analysis of patients’ marrow cells revealed, apart from Fas mRNA expression in BMMNC and/or CD34+ cells, TRAIL mRNA expression in CD34+ cell population in active disease. Ιn contrast, in patients in remission, both Fas and TRAIL mRNA expression does not exist. Instead, in BMMNC’s cell compartment TRAIL mRNA expression remains a constant finding even in patients in remission. Additionally, the decreased expression of anti-apoptotic bcl-xl and/or bcl-2 in all patients’ BMMNCs and bcl-xl expression in CD34+ cells from patients with active disease, seems unable to inhibit the mechanism of apoptosis in aplastic anemia patients. In our study, the fact that the expression of TRAIL was constant on CD34+ cells in TNF-α/IFN-γ treated LTBMC and only in CD34+ cells of patients with active disease, points out its significance in apoptosis of progenitor cells. In conclusion, our in vitro model of hematopoietic suppression confirmed previous knowledge for participation of TNF-α and IFN-γ in the pathophysiology of marrow failure in aplastic anemia. In parallel, the molecular data both from the in vitro model, as well as from patients with aplastic anemia, reinforce the implication of Fas/FasL pathway in the pathogenesis of this disease and propose a probable role for TRAIL/Apo2L in the process.

Το Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο (ΜΔΣ) αποτελεί νόσημα με διαταραχή σε επίπεδο αρχέγονου αιμοποιητικού κυττάρου (stem cell) που χαρακτηρίζεται από μη αποδοτική αιμοποίηση και κυτταροπενίες του περιφερικού αίματος που περιλαμβάνουν μία ή περισσότερες αιμοποιητικές σειρές. Διάφορες ανοσολογικές διαταραχές των ασθενών με ΜΔΣ, όπως, αυξημένη ευαισθησία σε βακτηριακές λοιμώξεις, αυτοάνοσα φαινόμενα και υψηλή συχνότητα κακοηθειών του λεμφικού ιστού, υποδεικνύουν αδυναμία των ασθενών με ΜΔΣ για ανοσολογική απάντηση, οι αιτίες των οποίων παραμένουν άγνωστες μέχρι σήμερα. Τα Δενδριτικά Κύτταρα (ΔΚ) είναι κύτταρα του ανοσολογικού μηχανισμού που προέρχονται από το μυελό των οστών. Ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APC), είναι εξειδικευμένα για τη πρόσληψη, επεξεργασία, μεταφορά και παρουσίαση του αντιγόνου στα Τ λεμφοκύτταρα. Στη παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε ανάλυση διαφορετικών ποσοτικών και λειτουργικών παραμέτρων των ΔΚ από ασθενείς με Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο, in vivo ή in vitro. Αρχικά διερευνήθηκε ο αριθμός, ο φαινότυπος, η ικανότητα ενδοκύττωσης και η αλλογενής διεγερτική δυνατότητα των ΔΚ, προερχόμενων από μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος (ΜοΔΚ) ασθενών με ΜΔΣ και υγιών μαρτύρων, σε διαφορετικά στάδια διαφοροποίησης. Τα μονοκύτταρα των ασθενών με ΜΔΣ χαρακτηρίστηκαν από μειωμένη ικανότητα διαφοροποίησης σε ΔΚ, λόγω του μειωμένου αριθμού των διαφοροποιημένων κυττάρων και τη χαμηλή έκφραση του CD1a αντιγόνου επιφανείας. Τα ΜοΔΚ των ΜΔΣ ασθενών παρουσίασαν χαμηλή έκφραση του υποδοχέα της μανόζης και μειωμένη ικανότητα ενδοκύττωσης. ΜοΔΚ των ΜΔΣ ασθενών επέδειξαν μειωμένη απάντηση ύστερα από διέγερση με TNF-α, καθώς η έκφραση των CD83, CD80 και CD54 αντιγόνων και η αλλοδιεγερτική ικανότητα ήταν μειωμένη, ενώ η επίδραση με LPS είχε ως αποτέλεσμα να εμφανίσουν φαινοτυπικά χαρακτηριστικά και ικανότητα διέγερσης των Τ-κυττάρων, όμοια με τα ΜοΔΚ των φυσιολογικών μαρτύρων. Σε δύο από τους ασθενείς με σύνδρομο 5q-, σχεδόν όλα τα μονοκύτταρα και τα ΜοΔΚ περιείχαν τη χρωμοσωμική διαταραχή, υποδηλώνοντας την προέλευσή τους από τον παθολογικό κλώνο. Στη συνέχεια διερευνήθηκε το δυναμικό πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των CD34+ προγονικών κυττάρων του μυελού ασθενών με ΜΔΣ σε δενδριτικά κύτταρα (CD34-ΔΚ) σε υγρή καλλιέργεια παρουσία κυτοκινών. Παράλληλα, έγινε ανάλυση των κυκλοφορούντων ΔΚ περιφερικού αίματος στους ίδιους ασθενείς. Τα CD34+ προγονικά κύτταρα παρουσίασαν χαμηλή δυνατότητα ανάπτυξης ΔΚ in vitro, καθώς ο αριθμός των παραγόμενων ΔΚ ανά CD34+ κύτταρο ήταν χαμηλότερος συγκριτικά με τα δείγματα των υγιών μαρτύρων. Παρά την αυξημένη απόπτωση των προγονικών κυττάρων του μυελού των ΜΔΣ ασθενών, η επιβίωση και ο πολλαπλασιασμός των CD34+ κυττάρων στην καλλιέργεια, δεν συσχετίστηκε με την απόπτωση και αποτελεί αξιοσημείωτη παρατήρηση. Φαινοτυπικά, τα CD34-ΔΚ των ΜΔΣ ασθενών δεν διέφεραν από τα ΔΚ που παρήχθησαν από τα CD34+ κύτταρα του μυελού των φυσιολογικών μαρτύρων καθώς επέδειξαν όμοια έκφραση των CD83, CD80, CD40, HLA-DR και CD54 αντιγόνων. Κυτταροεπιλεγμένα CD1a+ κύτταρα ασθενών είχαν όμοια διεγερτική ικανότητα αλλογενών Τ κυττάρων με τα CD34-ΔΚ των φυσιολογικών ατόμων. Το ποσοστό των κυκλοφορούντων μυελοειδών- και πλασματοκυτταροειδών- ΔΚ στους ασθενείς με ΜΔΣ ήταν σημαντικά μειωμένο συγκριτικά με τους υγιείς μάρτυρες. Στους ασθενείς με 5q έλλειψη, τόσο τα CD34-ΔΚ, όσο και τα ΔΚ του αίματος, είχαν τη χρωμοσωμική ανωμαλία. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η διαδικασία παραγωγής δενδριτικών κυττάρων από το μυελό (‘δενδριτοποίηση’) των ασθενών με ΜΔΣ, είναι μέρος της κλωνικής διαταραχής με αποτέλεσμα την μη αποδοτική παραγωγή ΔΚ από τα προγονικά κύτταρα του μυελού και το χαμηλό ποσοστό των κυκλοφορούντων πρόδρομων ΔΚ. Όλες οι ΔΚ υποομάδες προέρχονται από τον παθολογικό κλώνο και χαρακτηρίζονται από ποσοτικές και ποιοτικές ανωμαλίες. Το σύνολο αυτών των διαταραχών που παρατηρήθηκαν στα ΔΚ πολύ πιθανόν να συμβάλει στη διαταραγμένη ανοσολογική απάντηση έναντι παθογόνων οργανισμών, στην επιβίωση και στην επικράτηση του παθολογικού κλώνου, όπως επίσης και στην εμφάνιση αυτοάνοσων φαινομένων, που παρατηρούνται στους ασθενείς με ΜΔΣ. / Myelodysplastic syndrome (MDS) is a stem cell disorder characterized by ineffective hematopoiesis and blood cytopenias involving one or several myeloid lineages. Various immune disturbances in MDS such as increased susceptibility to bacterial infections, autoimmune phenomena and high incidence of lymphoid malignancies reveal an underlying defect of the immune response in MDS patients, the reasons for which still remain unclear. Dendritic cells (DCs) are bone marrow derived cells. As the most potent antigen presenting cells (APC), they are specialized for the uptake, processing, transport and presentation of Ag to T cells. In the present study different quantitative and functional parameters of DCs in patients with MDS were analyzed either in vivo or in vitro. The number, phenotype, endocytic ability, and allostimulatory capacity of DCs derived from peripheral blood monocytes (MoDCs) were investigated in patients with MDS and healthy controls at different stages of differentiation using the maturation stimuli-TNF-á and LPS. Monocytes in MDS showed low potential to differentiate into DCs, as determined by low cell yield and CD1a expression. MDS-MoDCs exhibited low expression of Mannose receptor and reduced endocytic capacity. When stimulated with TNF-á, MoDCs obtained from MDS patients showed a diminished response with low CD83, CD80 and CD54 expression and allostimulatory capacity, whereas in the presence of LPS MDS-MoDCs acquired phenotypic characteristics and ability to stimulate T-cells similar to MoDCs derived from controls. In two patients with 5q- syndrome the vast majority of both monocytes and MoDCs were positive for the 5q deletion, suggesting that they originate from the malignant clone. Second, we investigated the potential of bone marrow CD34+ progenitors in patients with MDS to proliferate and differentiate into DCs in a liquid cytokine supplemented culture system and also analyzed the status of blood DC subsets in those patients. CD34+ progenitors had low potential to generate DCs in vitro, as the number of DCs obtained from one CD34+ cell was significantly lower compared to controls. Interestingly, although the increased apoptotic level of bone marrow progenitors in MDS, the survival and proliferation of CD34+ cells in culture was not correlated to the degree of apoptosis. Phenotypically the MDS CD34-DCs did not differ from DCs obtained from normal BM CD34+ cells, exhibiting similar expression of CD83, CD80, CD40, HLA-DR, and CD54. FACsorted CD1a+ cells from MDS patients were as efficient stimulators of allogeneic T cells as normal CD34-DCs. The percentage of both circulating DC subsets, MDCs and PDCs in MDS patients was extremely diminished compared to controls. In cases with the 5q deletion both CD34-DCs and blood DCs harbor the cytogenetic abnormality. The results indicate that “dendritopoiesis” in MDS is affected by the transformation process resulting in ineffective production of DCs from bone marrow progenitors with low circulating blood precursors. All DC subsets were derived from the malignant clone and exhibited quantitative and qualitative abnormalities. This constellation of DCs defects probably contribute to the defective immune response against pathogens, escape and expansion of the malignant clone, as well as autoimmune phenomena, observed in MDS patients.

Το Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο (ΜΔΣ) αποτελεί μια ετερογενή ομάδα κλωνικών αιματολογικών διαταραχών με κοινό χαρακτηριστικό τη μη αποδοτική αιμοποίηση που οδηγεί σε ανθεκτικές κυτταροπενίες και συχνή εκτροπή προς Οξεία Λευχαιμία (ΟΛ). Η παράδοξη συνύπαρξη ενός πληθωρικού ή νορμοκυτταρικού μυελού των οστών και κυτταροπενιών στην περιφέρεια έχει αποδοθεί στην αυξημένη απόπτωση προγονικών και ώριμων αιμοποιητικών κυττάρων του μυελού των ασθενών αυτών. Παρ'όλ'αυτά, αιτιοπαθογενετική σχέση της υπέρμετρης απόπτωσης με την ανεπαρκή κλωνογόνο ικανότητα των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων του μυελοδυσπλαστικού μυελού δεν τεκμηριώνεται επαρκώς από τα υπάρχοντα ερευνητικά δεδομένα. Αντίθετα, αδιαμφισβήτητη είναι η συσχέτιση της κατάργησης των μηχανισμών του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου στο προχωρημένο ΜΔΣ με την εκτροπή της νόσου προς ΟΛ. Η αυξημένη έκφραση αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών όπως οι Bcl-2, Bcl-xL, IAPs, survivin έχει προταθεί ότι υποστηρίζει την πρόοδο της νόσου και την επακόλουθη λευχαιμική εξέλιξη. Οι Heat Shock Proteins αποτελούν θεμελιώδεις πρωτεΐνες, ως προς τις αποφάσεις των κυττάρων σχετικά με την επιβίωση ή το θάνατό τους. Η Hsp73, ένα σταθερά εκφραζόμενο μέλος, και οι Hsps 72 και 27, δύο ισχυρά επαγόμενες από ποικίλα στρεσσογόνα ερεθίσματα πρωτεΐνες, είναι τρεις από τις πιο σημαντικές Hsps εκδηλώνοντας πολυδιάστατη αντι-αποπτωτική δράση και παρέχοντας ισχυρή κυτταροπροστασία. Σε αρκετά είδη συμπαγών όγκων αλλά και αιματολογικών κακοηθειών έχει δειχθεί υπερέκφραση των Hsps, ενώ έχει προταθεί ακόμη και αιτιοπαθογενετική σχέση της διαταραχής της έκφρασης των πρωτεϊνών αυτών με την ογκογένεση. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η εκτίμηση του βαθμού της απόπτωσης στα προγονικά και ώριμα κύτταρα μυελού ασθενών με ΜΔΣ και η περαιτέρω διερεύνηση της ουσιαστικής συνεισφοράς του φαινομένου στην ανεπαρκή κλωνογόνο ικανότητα των προγονικών κυττάρων και, κατ' επέκταση, στη μη αποδοτική αιμοποίηση που χαρακτηρίζει το σύνδρομο. Εν συνεχεία, διερευνήθηκαν οι αποπτωτικές μεταβολές κατά την πρόοδο της νόσου οι οποίες συσχετίσθηκαν με την έκφραση των αντι-αποπτωτικών Heat Shock Proteins. Η έκφραση των Hsps 72, 27 & 73 μελετήθηκε υπό συνθήκες ηρεμίας (βασική έκφραση, ΒΕ), ενώ ελέγχθηκε η επαγωγιμότητα των Hsps 72 και 27 κατόπιν εφαρμογής θερμικού shock ή ο-αποπτωτικής διέγερσης με συνδυασμό κυτταροκινών (TNFα+IFNγ). Η προσδιοριζόμενη έκφραση των Hsps συσχετίσθηκε, κατόπιν, με την απόπτωση και το στάδιο της νόσου. Η παρούσα μελέτη επιβεβαιώνει την παρουσία αυξημένης απόπτωσης τόσο στα ώριμα CD34- όσο και στα προγονικά CD34+ κύτταρα του μυελού ασθενών με ΜΔΣ με αξιοσημείωτη ετερογένεια να διέπει τα αποτελέσματα ακόμη και μεταξύ ασθενών της ίδιας κατά FAB κατηγορίας νόσου. Τα επίπεδα ανιχνευόμενης απόπτωσης υπερείχαν σημαντικά στο μυελό των ασθενών με "πρώιμη" (RA και RARS) έναντι εκείνων με "προχωρημένη" (RAEB και RAEB-t) νόσο, ενισχύοντας τη θεωρία της κατάργησης των αποπτωτικών μηχανισμών κατά την πρόοδο της νόσου. Μετά από 24 ώρες υγρής καλλιέργειας, το ποσοστό των ανιχνευόμενων πρώιμων αποπτωτικών CD34+ κυττάρων μυελού ασθενών με ΜΔΣ μειώθηκε σημαντικά. Προκειμένου να διερευνηθεί η πραγματική συμβολή της απόπτωσης στη μη αποδοτική αιμοποίηση του ΜΔΣ in vitro, αποπτωτικά και μη αποπτωτικά προγονικά CD34+ φρέσκα κύτταρα μυελού διαχωρίστηκαν με τη μέθοδο του Κυτταροδιαχωρισμού ενεργοποιούμενου από φθορισμό και τοποθετήθηκαν σε βραχείας διάρκειας ημιστερεές καλλιέργειες, όπου ελέγχθηκε η σχετική κλωνογόνος ικανότητά τους. Τόσο τα αποπτωτικά όσο και τα μη αποπτωτικά CD34+ κύτταρα των ασθενών με ΜΔΣ επέδειξαν εξίσου ανεπαρκή ανάπτυξη in vitro, υποδεικνύοντας ότι η παρουσία απόπτωσης δεν επηρεάζει σημαντικά τη συμπεριφορά των κυττάρων στην καλλιέργεια. Η βασική ενδοκυττάρια έκφραση των αντιαποπτωτικών Hsps 27, 72 και 73 βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στο μυελό ασθενών με ΜΔΣ. Η υπερέκφραση των Hsps αφορούσε κυρίως τα ολικά μονοπύρηνα κύτταρα του μυελού των ασθενών, ενώ τα προγονικά CD34+ κύτταρα δεν επέδειξαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα των υπό μελέτη πρωτεϊνών. Επιπλέον, η εφαρμογή θερμικού shock οδήγησε επιτυχώς στην επαγωγή των Hsps 27 και 72 στο μυελό ασθενών και μαρτύρων, προσεγγίζοντας όμως υψηλότερα τελικά επίπεδα έκφρασης στο μυελό των ασθενών. Tόσο η βασική όσο και η εκ θερμικού stress επαγόμενη έκφραση της Hsp72 βρέθηκε σημαντικά ενισχυμένη στα μονοπύρηνα κύτταρα του μυελού ασθενών με "προχωρημένου τύπου" ΜΔΣ, ενώ σημαντικά θετική συσχέτιση τεκμηριώθηκε μεταξύ της έκφρασης ηρεμίας των τριών Hsps και του ποσοστού των βλαστών του μυελού των ασθενών. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ενδεχόμενο ρόλο της υπερέκφρασης των Hsps στην ευνοϊκή επιλογή και εξάπλωση των κλωνικών κυττάρων και, συνεπακόλουθα, στην πρόοδο της νόσου. Η συνδυασμένη επίδραση κυτταροκινών σε κύτταρα φυσιολογικών μυελών οδήγησε σε σημαντική μείωση της έκφρασης της Hsp72, ενώ στο 36% των ασθενών παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης της Hsp72. Τέλος, αρνητική ήταν η συσχέτιση της βασικής ή επαγόμενης έκφρασης των Hsps με την αυτόματη ή προκλητή απόπτωση σε ολικά ή προγονικά κύτταρα μυελού ασθενών με ΜΔΣ, επιβεβαιώνοντας τον κυτταροπροστατευτικό τους ρόλο. Συνοψίζοντας, τα ευρήματα της παρούσας μελέτης επιβεβαιώνουν την παρουσία αυξημένης απόπτωσης στο μυελό των ασθενών με ΜΔΣ, ιδιαίτερα πρώιμου τύπου. Τα πρώιμα αποπτωτικά προγονικά κύτταρα επιδεικνύουν δυνατότητα διαφυγής από τον κυτταρικό θάνατο και σχετική λειτουργική ανάνηψη κατά την απομάκρυνσή τους από το προαποπτωτικό μικροπεριβάλλον του μυελού. Εναλλακτικά, πρόκειται για κύτταρα που, εξ'αιτίας αποτυχίας του αποπτωτικού μηχανισμού να περατωθεί, υφίστανται "ατελή απόπτωση" και διασώζονται, φέροντα όμως δυνητικά ογκογόνες μεταλλάξεις. Η γενική αντίληψη, πάντως, που καθιστά την απόπτωση ως την αιτία της μη αποδοτικής αιμοποίησης του συνδρόμου κλονίζεται, καθώς αποπτωτικά και μη αποπτωτικά προγονικά κύτταρα διαθέτουν παρόμοια κλωνογόνο ικανότητα, in vitro; φαίνεται ότι επιπρόσθετες ενδογενείς ανωμαλίες περιορίζουν το κλωνογόνο δυναμικό αποπτωτικών και μη προγονικών κυττάρων. Η υπερέκφραση Hsps που τεκμηριώθηκε στο μυελό ασθενών με ΜΔΣ ενδεχομένως υποστηρίζει την διαδικασία κακοήθους εξαλλαγής μέσω της σιωπηρής συσσώρευσης μεταλλάξεων στα κύτταρα του κλώνου. Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα των αντι-αποπτωτικών αυτών πρωτεϊνών θα μπορούσε να ευθύνεται για την προτεινόμενη ατελή απόπτωση των κυττάρων του μυελοδυσπλαστικού μυελού. Όπως προκύπτει από τη σημαντική συσχέτιση της έκφρασης των Hsps τόσο με το ποσοστό βλαστών όσο και με το στάδιο της νόσου, τα υπερεκφράζοντα ώριμα με τα αντίστοιχα προγονικά τους παθολογικά κύτταρα, ενέχοντας πλεονέκτημα επιβίωσης έναντι των φυσιολογικών στο προ-αποπτωτικό μικροπεριβάλλον του δυσπλαστικού μυελού, φαίνεται ότι επιλέγονται και επικρατούν κατά την πρόοδο της νόσου. Σε ένα τέτοιο υπόστρωμα αντίστασης στην απόπτωση ένα επιγενετικό συμβάν που αναστέλλει τη διαφοροποίηση ενδέχεται να πυροδοτήσει τη λευχαιμική εκτροπή. / Myelodysplastic syndrome comprises a heterogeneous group of clonal stem cell disorders characterized by ineffective hematopoiesis leading to refractory cytopenias and frequent evolution to acute myeloid leukemia (AML). The existing inconsistency between normal or hypercellular bone marrow and peripheral blood cytopenias remains a paradox that has been attributed to excessive intramedullary apoptosis. However, a causative relationship of apoptosis to the progenitor’s defective clonogenic growth has not been sufficiently demonstrated. On the other hand, it is widely accepted that abrogation of apoptotic control in advanced MDS favours the expansion of the malignant clone and contributes to the frequently observed evolution to acute myeloid leukaemia (AML). Enhanced expression of antiapoptotic proteins Bcl-2, Bcl-xL, IAPs, survivin has been proposed to contribute to elimination of apoptosis, disease progression and subsequent leukemic evolution. Heat Shock Proteins (Hsps) are fundamental for cell life and death decisions and essential for the coordination between proliferation, differentiation and apoptosis. Hsp73, one of the constitutively expressed Hsps, and Hsps 72 and 27, two strongly inducible by several stress stimuli proteins, are three of the most important Hsps. These three Hsps regulate programmed cell death by interfering with multiple key-regulatory points of the apoptotic cascade, acting as apoptosis inhibitors and conferring strong cytoprotection. Hsps 72 and 27 are overexpressed in a number of human cancers and haematological malignancies, while a causative relationship of these proteins to oncogenesis has even been proposed. The aim of our study was to determine the degree of programmed cell death in progenitor and mature bone marrow cells of MDS patients. Moreover, apoptosis' actual contribution to defective clonogenic capacity of MDS progenitors and, subsequently, to ineffective hematopoiesis in MDS was assessed. Furthermore, apoptosis modifications during disease progression were detected and correlated to the expression of antiapoptotic Hsps. Hsps 72, 27 and 73 intracellular expression was studied under conditions of tranquillity in bone marrow and progenitor cells of MDS patients, while the inducibility of Hsps 27 and 72 was further tested after application of an environmental type of stress (heat shock) and pro-apoptotic stimulation under combined cytokine treatment (TNFα+IFNγ). Finally, we determined an existing link between Hsps' levels, apoptosis and disease progression. Apoptosis was significantly augmented in both progenitor and mature bone marrow cell fractions from MDS patients. Apoptosis determined in the bone marrow of patients with "early" MDS (RA and RARS) significantly exceeded cell death levels detected in those with "advanced" (RAEB and RAEB-t) disease, supporting the theory of apoptosis' abrogation as the disease evolves. We should remark, however, that even inside the same FAB-category, a great heterogeneity existed in results. After 24 hours of liquid culture the percentage of early apoptotic progenitors in MDS BM significantly decreased. In order to determine apoptosis' actual contribution to defective clonogenic capacity of MDS progenitors, “apoptotic” and “non-apoptotic” bone marrow CD34+ cells were sorted by FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) and their differential clonogenic capacity was assessed in a short-term semisolid culture system. There was no correlation between apoptosis’ existence and culture performance, since non-apoptotic as well as apoptotic CD34+ bone marrow cells both exhibited similar defective growth. Basal intracellular expression of antiapoptotic Hsps 27, 72 and 73 was found significantly elevated in bone marrow cells of MDS patients. Hsps overexpression mainly involved total BMMC, while higher protein levels were also detected within patients’ progenitor bone marrow cells, but the differences noted did not attain statistical significance. Moreover, HS treatment provoked the effective induction of Hsps 27 and 72 in both MDS and normal subjects leading to the achievement of even higher final protein levels in the patients’ marrow, despite the already enhanced basal expression. Both basal and HS-induced Hsp72 expression were significantly enhanced in BMMC of MDS patients with advanced disease, while a positive correlation between all three Hsps basal expression and blast percentage was established in the patients' marrow. These findings suggest a probable role of Hsps overexpression in the favored selection and expansion of clonal cells, further hematopoiesis depression and disease progression. Combined pro-apoptotic treatment of normal BM cells caused a significant downregulation of Hsp72. On the contrary, BM cells from MDS patients responded by elevating the expression of cytoprotective Hsp72 in about 36% of cases. Finally, in accordance to the well-demonstrated cytoprotective role of Hsps, an inverse correlation was noted between spontaneous or induced apoptosis and Hsps basal or induced expression. In conclusion, our findings support the previous observations of increased apoptosis in MDS marrow, especially in "early" disease. Interestingly, early apoptotic MDS progenitors exhibit the potential to escape from apoptosis and even recover functionally, as shown in CFU-assays, when separated from the bone marrow microenvironment, the main source of pro-apoptotic signalling. Alternatively, these cells, due to intrinsic defects in cell death activated pathways, may undergo incomplete apoptosis and get rescued possibly carrying, though, potentially transforming mutations. However, apoptosis does not seem to be the only cause of impaired clonogenic growth in MDS, as apoptotic and non-apoptotic progenitors exhibit similar patterns of growth, both defective compared to normal. Apparently, additional intrinsic abnormalities limit the clonogenic potential of apoptotic and non-apoptotic progenitors. Augmented Hsps expression established in MDS marrow may support the underlying transformation process through the suppression and silent gathering of mutations, probably promoting viability and growth of otherwise mutant cells. Moreover, increased levels of anti-apoptotic Hsps may account for the proposed incomplete apoptosis of MDS marrow cells. Hsps appear to provide resistance against spontaneous or induced apoptosis to the overexpressing cell population. Hsps' positive correlation to blast count and disease stage implies that the overexpressing mature cells along with their abnormal progenitors, encompassing a survival advantage over normal cells in the pro-apoptotic MDS marrow, get selected and expanded during disease progression. On such a background of non-susceptibility to apoptosis a secondary event blocking differentiation could lead to leukaemic transformation.

La mégacaryopoïèse représente le processus de différenciation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) en mégacaryocytes (MK). Ce processus précède la thrombopoïèse qui aboutira à la formation des plaquettes sanguines. Ces processus complexes ont lieu 1) au sein de la structure tridimensionnelle (3D) de la moelle osseuse, 2) dans les vaisseaux sinusoïdes de la moelle et 3) dans la circulation sanguine. Le but général de ce travail a été de comprendre le mécanisme de chaque étape. Le premier objectif a été d’étudier les effets d’une structure poreuse 3D mimant celle de la moelle osseuse, sur la différenciation mégacaryocytaire et la production plaquettaire in vitro. Cette étude a permis de démontrer que la synergie entre l’organisation spatiale et les signaux du microenvironnement améliore la production en MK et en plaquettes. Par la suite, nous avons souhaité caractériser in vitro et in vivo les plaquettes produites en conditions de flux. Nous avons notamment mis en évidence la capacité des plaquettes produites in vitro dans un système de microfluidique, à s’incorporer et à participer à la formation d’un thrombus in vitro et in vivo contrairement aux plaquettes obtenues en statique. Ces travaux prouvent donc l’intérêt d’une part, de mimer le microenvironnement de la moelle osseuse et d’autre part, de reproduire les forces de cisaillement du sang afin d’améliorer et d’augmenter la production de plaquettes in vitro pour de futures applications en thérapeutique. / Megakaryopoiesis is a process allowing hematopoietic stem cell (HSC) to proliferate and differentiate into megakaryocytes (MK). It is followed by thrombopoiesis allowing blood platelet production. These processes occur 1) in the bone marrow three-dimensional (3D) structure, 2) in the bone marrow sinusoid vessels and 3) in the blood flow. Our general aim was to decipher the mechanism associated to each process. The first objective was to study the effects of porous 3D structure on MK differentiation and platelet production. This study demonstrated that the synergy between spatial organization and biological cues improved MK and platelet production. We also characterized platelets produced from mature MK in flow conditions, with respect to their in vitro and in vivo properties. We highlighted the capacity of flow-derived platelets to incorporate in a thrombus in vitro and in vivo, compared to static-derived platelets. These works represent some new developments for mimicking the bone marrow structure and to reproduce blood shear forces in order to improve and increase in vitro platelet production for therapeutic use.