Ανοσολογική διαταραχή η οποία οδηγεί σε καταστολή της αιμοποίησης μέσω υπερπαραγωγής μυελοκατασταλτικών κυτταροκινών από ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα θεωρείται ότι παίζει καθοριστικό ρόλο στην παθογένεια της επίκτητης απλαστικής αναιμίας (ΑΑ). Μελετήσαμε αρρώστους με επίκτητη απλαστική αναιμία ως προς τα ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηριστικά των λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος και του μυελού των οστών με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής. Λεμφοπενία, κυρίως των CD4+ T λεμφοκυττάρων, παρατηρήθηκε σε ασθενείς με ενεργό νόσο όσο και σε ασθενείς σε αιματολογική ύφεση σε σχέση με φυσιολογικούς μάρτυρες. Επίσης, στατιστικά υψηλότερο ποσοστό ενεργοποιημένων CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων ανιχνεύθηκε τόσο σε ασθενείς με ενεργό νόσο όσο και σε ασθενείς που βρίσκονται σε ύφεση. Επίσης, ανιχνεύθηκαν οι ενδοκυτταροπλασματικές κυτταροκίνες της τύπου-1 (IFNγ, IL-2) και τύπου-2 (IL-4, IL-10) ανοσολογικής απόκρισης στα CD4+ και CD8+ λεμφοκύτταρα πριν και μετά την in vitro ενεργοποίηση σε ασθενείς με ΑΑ καθώς και σε φυσιολογικούς μάρτυρες. Ασθενείς νεοδιαγνωσθέντες ή ανθεκτικοί (ενεργός νόσος) είχαν στην χωρίς ενεργοποίηση μελέτη, στατιστικά μεγαλύτερο ποσοστό CD4+ και CD8+ που παρήγαγαν IFNγ και IL-2, ενώ η παραγωγή IL-4 και IL-10 δεν διέφερε από τους φυσιολογικούς μάρτυρες. Οι ασθενείς σε αιματολογική ύφεση, παρουσίαζαν επίσης αυξημένο ποσοστό CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων που παρήγαγε IFN-γ, ενώ ήταν επίσης αυξημένο των ποσοστό των CD4+ και CD8+ κυττάρων που παρήγαγαν IL-4 και IL-10. Σε ασθενείς με ενεργό νόσο, η ισορροπία μεταξύ των τύπου-1/τύπου-2 κυτταροκινών, όπως αυτή εκφράζεται από τον λόγο IFNγ/IL-4, δείχνει πόλωση προς μια τύπου-1 ανοσολογική απόκριση. Σε ασθενείς σε αιματολογική ύφεση, παρόλη την επίσης παρατηρούμενη αυξημένη παραγωγή INF-γ από τα λεμφοκύτταρα στην χωρίς διέγερση μελέτη, η ισορροπία του λόγου τύπου-1/τύπου-2 επανέρχεται στα επίπεδα των φυσιολογικών μαρτύρων. Η πόλωση των CD4+ κυττάρων προς μια τύπου-1 ανοσολογική απόκριση μπορεί να είναι απαραίτητη για την παθογένεια της ΑΑ, οδηγώντας σε ενεργοποίηση των κυτταροτοξικών CD8+ κυττάρων και στην καταστροφή των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Σ’ ένα μικρό ποσοστό ασθενών με ΑΑ σε αιματολογική ύφεση μετά από ανοσοκατασταλτική θεραπεία, αναπτύσεται δευτεροπαθής κλωνική διαταραχή, όπως παροξυντική νυχτερινή αιμοσφαιρινουρία ή καρυοτυπική ανωμαλία. Οι ασθενείς με φυσιολογικό καρυότυπο παρουσίαζαν μια πιο έντονη ανοσολογική απόκριση τύπου 1 σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς μάρτυρες και τους ασθενείς με κλωνική διαταραχή. Πιθανά μια εμμένουσα και διαρκής ανοσολογική αντίδραση τύπου 1 σε ένα ποσοστό ασθενών με ΑΑ σε ύφεση μετά από επιτυχή ανοσοθεραπεία ενισχύει την ανοσολογική επιτήρηση και προστατεύει αυτούς τους ασθενείς από την εμφάνιση ενός παθολογικού κλώνου. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει αυξημένη απόπτωση στο μυελό των ασθενών με ΑΑ και έχουν πιθανολογήσει πως παίζει σημαντικό ρόλο στην πρόκληση της μυελικής απλασίας. Η ρύθμιση της αυξημένης απόπτωσης των αρχέγονων προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων στην απλαστική αναιμία (ΑΑ) παραμένει ασαφής. Η παρουσία της απόπτωσης στο μυελό των οστών διερευνήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με ποσοτικό προσδιορισμό της επιφανειακής έκφρασης του Fas υποδοχέα και των αποπτωτικών Annexin+/PI- BMMNC και CD34+ κυττάρων. Παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του Fas υποδοχέα (MAb/cell) στα CD34+ κύτταρα τόσο στους ασθενείς με ενεργό νόσο όσο και σ’ αυτούς σε ύφεση, σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Ο αριθμός των CD34+/Annexin+/PI- κυττάρων είναι σημαντικά αυξημένος τόσο σε ασθενείς με ενεργό νόσο όσο και σε ασθενείς σε ύφεση, σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Συμπερασματικά, μια ανοσολογική αντίδραση τύπου-1 κυριαρχεί στα λεμφοκύτταρα των ασθενών με απλαστική αναιμία, ιδίως σ’ αυτούς με ενεργό νόσο. Η αντίδραση αυτή συσχετίζεται θετικά με το ποσοστό απόπτωσης των CD34+ κυττάρων του μυελού των οστών. / Immune dysfunction, which leads to suppression of haemopoiesis through cytokines secreted by activated T lymphocytes, is considered to play a key role in the pathogenesis of acquired aplastic anaemia (AAA). The peripheral blood lymphocyte subpopulations were calculated by flow cytometry. Lymphopenia, mainly of CD4+ subset, was observed in both patients with active disease and in patients in remission. There was also a significant increase in activated CD4+ and CD8+ T cells in active disease but also in remission. We also studied the intracytoplasmic cytokines of type-1 and type-2 immune responses in CD4+ and CD8+ cells before and after in vitro activation in AAA patients and controls. Untreated or refractory patients had a significantly higher proportion of unstimulated CD4+ and CD8+ cells that produced IFNg and IL-2, while the production of IL-4 and IL-10 did not differ from that of controls. In patients in remission, the proportion of IFN-γ-producing unstimulated CD4+ and CD8+ cells was also increased with a parallel increased production of IL-4 and IL-10. In newly diagnosed or refractory patients, the balance of type-1 /type-2 cytokines, as it has been shown by the ratio of IFNγ/IL-4, shows a polarization towards type-1 response. In patients in remission, despite the increased INF-γ production by unstimulated T cells, the balance returns to that of controls. Polarization of CD4+ cells towards a type-1 response may be essential for the pathogenesis of AAA, leading to activation of cytotoxic CD8+ cells and stem cell destruction. A small proportion of patients with AAA in hematologic remission after immunosuppressive therapy develop a secondary clonal abnormality (e.g. paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, karyotypic abnormality). A significantly higher proportion of unstimulated CD4+ cells produced IL-2 and IFNγ in patients with a normal karyotype. The balance between IFNγ/IL-4 is normalized in unstimulated CD4+ cells of AA patients with an abnormal clone, whereas in patients with normal karyotype this ratio remains significantly higher compared to the group with clonal abnormality. According to the above data, the possibility exists that an ongoing type-1 reaction, especially in CD4+ cells in a cohort of AA patients after successful immunotherapy “protects” these patients from the emergence of an abnormal clone. Increased apoptosis is a possible pathogenetic mechanism for the damage of hematopoietic stem cells in aplastic anemia (AA), but the regulation of apoptotic machinery remains unclear. We examined the presence of apoptosis in the marrow cells with flow cytometry (FC) analysis. Bone marrow was obtained from aplastic anemia patients and healthy volunteers of similar age. The AA patients had active disease (untreated or refractory) or complete or partial hematological remission long after immunosuppressive therapy was discontinuated. Two-or three-color FC analysis was used for quantitative measurement of cell surface expression of Apo-1/Fas receptor in CD34+ cells and Annexin+/PI- total BMMNC and CD34+ cells. Two-color FC analysis revealed a significant increase in Fas expression CD34+ in active disease patients as well as in patients in remission compared to controls. CD34+/Annexin+/PI- cells are significantly increased in both active disease and in remission patients compared to controls. In conclusion, a type-1 immune response dominates in aplastic anemia patients, especially in patients with active disease. This polarization of lymphocytes correlates with increased apoptosis in CD34+ bone marrow cells.

Οι ασθενείς με ομόζυγο β-μεσογειακή αναιμία εμφανίζουν αυξημένη καρδιακή νοσηρότητα και θνητότητα. Μία παρακλινική, μη επεμβατική μέθοδος ικανή να αποκαλύψει καρδιακή δυσλειτουργία σε ασυμπτωματικό στάδιο θα ήταν χρήσιμη για την πρώιμη ενίσχυση της αποσιδήρωσης και ενδεχόμενη χορήγηση καρδιοπροστατευτικής αγωγής στους ασθενείς αυτούς. Η ινοτροπική διέγερση με δοβουταμίνη μπορεί να αποκαλύψει λανθάνουσα δυσλειτουργία της αριστερής κοιλίας και πιθανώς αυξημένο μελλοντικό καρδιακό κίνδυνο μέσω της κατάδειξης ανεπαρκούς συστολικής εφεδρείας σε ασυμπτωματικούς, μη θαλασσαιμικούς ασθενείς. Μέθοδοι: 36 καρδιολογικά ασυμπτωματικοί ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία και φυσιολογική καρδιακή λειτουργία (ηλικίας 25±6 έτη, φερριτίνη ορού 3574±2393 νανογρ / κυβ. εκατ.) και 25 υγιείς μάρτυρες συγκρίσιμοι σε ηλικία, φύλο και επιφάνεια σώματος μελετήθηκαν υπερηχοκαρδιογραφικά σε ηρεμία και μετά φόρτιση με ενδοφλέβια δοβουταμίνη σε αυξανόμενες δόσεις. Η μελέτη επαναλήφθηκε σε 23 ασθενείς μετά 24±12 μήνες. Το σύνολο των ασθενών εκτιμήθηκε κλινικά κατά τη δεκαετία που ακολούθησε την αρχική μελέτη. Αποτελέσματα: Στην ομάδα των θαλασσαιμικών υπήρχε ελαττωμένη ποσοστιαία πάχυνση του οπισθίου τοιχώματος της αριστερής κοιλίας σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες. Στην επαναληπτική μελέτη διαπιστώθηκε ότι η αριστερή κοιλία εμφάνιζε στη ηρεμία δυσμενή αναδιαμόρφωση αλλά επαρκή συστολική εφεδρεία στη φόρτιση με δοβουταμίνη. Κατά τη δεκαετή κλινική παρακολούθηση 7 ασθενείς απεβίωσαν, όλοι από καρδιακά αίτια. Η μέθοδος πολλαπλής εξάρτησης αναλογικού κινδύνου έδειξε ότι η φερριτίνη ορού και η ηλικία, με ανάστροφη συσχέτιση, όχι όμως οι υπερηχοκαρδιογραφικοί παράμετροι ήταν οι μοναδικοί προβλεπτικοί δείκτες θνητότητας. Συμπέρασμα : Η φερριτίνη ορού και η ηλικία φέρουν σημαντική προγνωστική αξία σε ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία. Το υπερηχοκαρδιογράφημα δοβουταμίνης δεν συνεισφέρει στην διαβάθμιση κινδύνου στους ασθενείς αυτούς. / Patients with beta-thalassemia major demonstrate increased cardiac morbidity and mortality. A non-invasive method, capable of revealing cardiac dysfunction at an asymptomatic stage would be useful for the early intensification of chelation therapy and possible application of cardioprotective treatment in these patients. The inadequate, left ventricular inotropic response upon dobutamine challenge has prognostic implications in studies on asymptomatic, non-thalassemic patients. Methods: 36 asymptomatic patients with beta-thalassemia major and normal biventricular systolic function (mean age 25±6 years, mean serum ferritin 3574±2393ng/ml) and 25 healthy controls matched for age, sex, and body surface area were examined echocardiographically at rest and after intravenous dobutamine infusion in incremental doses. Echocardiographic dobutamine examination was repeated in 23 thalassemic patients after 24±12 months. All patients were clinically evaluated during the decade following the first study. Results: Compared to the healthy controls, thalassemic patients exhibited a reduced thickening of the left ventricular posterior wall. At follow up, both an unfavorable left ventricular remodeling at rest and sufficient systolic reverse were evident. During the ten-year clinical evaluation seven patients died, all of cardiac causes. Cox regression analysis showed that higher serum ferritin and lower age, but not the echocardiographic parameters, were predictive of mortality. Conclusions: Serum ferritin and age, but not the dobutamine stress echocardiogram, are independently associated with cardiac mortality among patients with beta-thalassemia major.

Η μη επαγόμενη και η επαγόμενη παραγωγή των GM-CSF, G-CSF, IL-3, IL-6, SCF, IL-1β, TNF-α , TNF-β, IFN-γ και του TGF-β προσδιορίστηκαν μετά από καλλιέργεια μονοπύρηνων κυττάρων αίματος 22 ασθενών με βαριά β-θαλασσαιμία που υποβάλλονταν σε κανονικό πρόγραμμα μεταγγίσεων, 5 ασθενών με ενδιάμεση β- θαλασσαιμία που δεν υποβάλλονταν σε κανονικό πρόγραμμα μεταγγίσεων και 9 φυσιολογικών ατόμων. Ένα διακριτό πρότυπο παραγωγής κυτταροκινών διαπιστώθηκε στους β-θαλασσαιμικούς ασθενείς. Συγκεκριμένα παρατηρήθηκε μειωμένη μη επαγόμενη παραγωγή όλων των κυτταροκινών και σημαντική αύξηση της επαγόμενης παραγωγής των IFN-γ, TNF-α και της IL-1β. Αυτές οι διαταραχές ήταν περισσότερο εμφανείς στους μεγαλύτερους σε ηλικία ασθενείς, που έχουν υποβληθεί στις περισσότερες μεταγγίσεις. Η αυξημένη παραγωγή των παραπάνω κυτταροκινών, συνήθως χαρακτηρίζει την οξεία απόκριση σε μολυσματικούς παράγοντες και ασκεί αρνητική επίδραση στην ερυθροποίηση. Αυτό μπορεί να εξηγεί την επιδείνωση της αναιμίας στους θαλασσαιμικούς ασθενείς, κατά τη διάρκεια οξείων λοιμώξεων. / The unstimulated and induced production of granulocyte-macrofage colonystimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony –stimulating factor (G-CSF), IL-3, IL-6, stem cell factor (SCF), IL-1β, tumour necrosis factor-alpha (TNF-a), TNF-β, interferon-gamma (IFN-γ) and transforming growth factor-beta (TGF-β) was determined after culture of blood mononuclear cells from 22 patients with severe β- thalassaemia in a regular transfusion programme, five non-regularly transfused patients with β-thalassaemia intermedia and nine normal persons. A distinct pattern of cytokine production in thalassaemic patients was detected, namely a low unstimulated production of all cytokines and a significant increase in the stimulated production of IFN-γ, TNF-a and IL-1β; these abnormalities were more pronounced in the more heavily transfused older patients. The increased production of the above cytokines, which usually characterize the acute response to infectious agents and have a negative effect on erythropoiesis, may explain the deterioration of anaemia found in thalassaemic patients during acute infections.

- / -

- / -

Γενετικές παραλλαγές σε γονιδιακούς τόπους που βρίσκονται εντός (cis) αλλά και εκτός (trans) του συμπλέγματος των ανθρώπινων β-σφαιρινικών γονιδίων έχει δειχθεί πως συσχετίζονται σημαντικά με τα επίπεδα της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF). Ένα από τα γονίδια αυτά είναι το γονίδιο MAP3K5 (ή ASK1), το οποίο είναι μέλος της οδού της MAP κινάσης, ενεργοποιείται από διάφορες παθολογικές καταστάσεις και από προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες, συμβάλλοντας στην κυτταρική απόπτωση. Πρόσφατα αποτελέσματα από το εργαστήριό μας έδειξαν ότι η παρουσία του σπάνιου αλληλομόρφου C σε μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς (SNP) του συγκεκριμένου γονιδίου, και συγκεκριμένα στους rs9376230 και rs9483947, συσχετίζεται με μειωμένα επίπεδα της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF) (Tafrali et al., 2013). Για το λόγο αυτό, υποθέσαμε ότι οι πολυμορφισμοί αυτοί συνδέονται με πιθανές αλλαγές σε ρυθμιστικές περιοχές του γονιδίου ΜΑΡ3Κ5 οι οποίες τροποποιούν τα επίπεδα έκφρασής του. Έτσι, ερευνήσαμε τον υποκινητή του γονιδίου ΜΑΡ3Κ5 ως προς τη συχνότητα παρουσίας τεσσάρων ή πέντε αντιγράφων της μικροδορυφορικής αλληλουχίας 5’ – GCGCG – 3’ (θέση -51 έως -27 από τη θέση έναρξης της μεταγραφής). Με την προσέγγιση αυτή θελήσαμε να εξακριβώσουμε εάν οι μικροδορυφορικές αυτές αλληλουχίες συνδέονται με τους μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς και, κατά συνέπεια, με τα επίπεδα της HbF σε ασθενείς με ενδιάμεση ή μείζονα β-μεσογειακή αναιμία και σε μη-θαλασσαιμικά άτομα. Για τον σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν 11 ασθενείς με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία, 15 ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία και 60 μη-θαλασσαιμικά άτομα ελληνικής καταγωγής. Ο προσδιορισμός του γονότυπου πραγματοποιήθηκε με εκλεκτική ενίσχυση του τμήματος του υποκινητή του γονιδίου ΜΑΡ3Κ5, μεταξύ των θέσεων -273 έως και +79, και στη συνέχεια, είτε με αλληλούχιση σε αυτοματοποιημένο αναλυτή ή με ανάλυση ετεροδιμερών. Η ανάλυση έδειξε ότι υπάρχει σχεδόν απόλυτη σύνδεση των σπάνιων αλληλομόρφων C τόσο για τον rs9376230 όσο και για τον rs9483947 με τη μικροδορυφορική αλληλουχία των πέντε επαναλήψεων, σχηματίζοντας έναν απλότυπο. O συγκεκριμένος απλότυπος συσχετίζεται με χαμηλά επίπεδα της HbF και το φαινότυπο της βαριάς β-μεσογειακής αναιμίας, αφού σε ασθενείς με μείζονα β-μεσογειακή αναιμία εντοπίζεται με συχνότητα 60% και αποκλίνει στατιστικώς σημαντικά από τις αντίστοιχες συχνότητες σε ασθενείς με ενδιάμεση β-μεσογειακή αναιμία (p=0,04) και σε μη-θαλασσαιμικά άτομα (p=0,003). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι οι πολυμορφισμοί rs9376230 και rs9483947 συνδέονται με τη μικροδορυφορική αλληλουχία του υποκινητή, η οποία έχει πιθανό λειτουργικό ρόλο στα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου ΜΑΡ3Κ5. / Genetic variations in loci that are in cis or trans of the human beta-globin gene cluster are shown to correlate significantly with the levels of fetal hemoglobin (HbF). One of these genes is MAP3K5 (or ASK1), a member of the MAPK pathway, which is activated by various stresses and pro-inflammatory cytokines that contribute to cellular apoptosis. Recent results from our laboratory have shown that the presence of the rare C allele in two intronic SNPs of MAP3K5, namely rs9376230 and rs9483947, is associated with reduced levels of fetal hemoglobin (HbF) (Tafrali et al., 2013). For this reason, we assumed that these polymorphisms may be associated with changes in the regulatory regions of MAP3K5 which could modify its expression levels. Thus, we investigated the frequency of a microsatellite marker at the proximal promoter region of MAP3K5, regarding the presence of four or five repeats of a 5-bp short tandem repeat (STR), am y 5’ – GCGCG – 3’ (positio -51 to -27 from transcription start site). With this approach, we wanted to ascertain whether this STR is associated with the previously studied SNPs (Tafrali et al., 2013) and consequently with th v s o bF i β-thalassemia intermediate or major patients compared to non-thalassemic individuals. For this purpose, we analyzed the DNA samples from 11 β-tha ass mia i t rm ia a 15 β-thalassemia major patients, as well as 60 non-thalassemic controls of Western Greek origin. Genotyping was performed by selectively amplifying a MAP3K5 gene promoter fragment between positions -273 to +79, followed by either sequencing or heteroduplex analysis. The analysis showed that there is an almost perfect correlation of the rare C allele for rs9376230 and the rare C allele for rs9483947 with the five STR repeats, forming a haplotype associated with low levels of HbF and with the phenotype of severe b-thalassemia. This haplotype is detected with a r qu cy o 60% i β-thalassemia major patients and it statistica y sig i ica t y viat s rom th corr spo i g r qu ci s i β-thalassemia intermedia patients (p = 0.04) and in non-thalassemic individuals (p = 0.003). These results indicate that the polymorphisms rs9376230 and rs9483947 are in linkage with the promoter STR polymorphism, which may have a functional role in MAP3K5 gene expression.

- / -

- / -

- / -

- / -