Στην επίκτητη απλαστική αναιμία (ΑΑ) ο υποκυτταρικός μυελός και η πανκυτταροπενία στο περιφερικό αίμα είναι αποτέλεσμα βλάβης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι κύριο χαρακτηριστικό γνώρισμα της νόσου είναι η ποσοτική αλλά και ποιοτική διαταραχή της stem cell δεξαμενής. Κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα προτείνουν το σημαντικό ρόλο του ανοσοποιητικού συστήματος και ειδικά των Τ λεμφοκυττάρων στην ανάπτυξη της απλαστικής αναιμίας. Σήμερα, πλέον, είναι ευρύτερα αποδεκτό ότι η καταστολή του μυελού, που παρατηρείται στην ιδιοπαθή απλαστική αναιμία, είναι αποτέλεσμα της υπερπαραγωγής των μυελοκατασταλτικών κυτταροκινών IFN-γ και TNF-α από διεγερμένα CD8+ κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα, τα οποία συναντούμε τόσο στο περιφερικό αίμα όσο και στο μυελό ασθενών με απλαστική αναιμία. Οι κυτοκίνες αυτές παρουσιάζουν μάλλον προσθετική αντί συνεργική δράση, η οποία σχετίζεται με την IFN-γ-εξαρτώμενη αύξηση της έκφρασης του Fas στα CD34+ κύτταρα και από την IFN-γ-επαγώμενη έκκριση του TNF-α από τα μακροφάγα. Μελέτες έχουν δείξει ότι τόσο τα CD34+ όσο και τα BMMNC κύτταρα του μυελού των ασθενών με ΑΑ είναι περισσότερα αποπτωτικά σε σχέση με φυσιολογικούς μυελούς. Στόχος της διατριβής ήταν η περαιτέρω μελέτη των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανοσολογικής προέλευσης απλαστική αναιμία. Λόγω, όμως, του ότι η απλαστική αναιμία είναι μια σπάνια νόσος, η παρουσία ενός εύκολα αναπαραγώγιμου in vitro μοντέλου μυελικής απλασίας θα βοηθούσε περισσότερο στη μοριακή μελέτη αυτής. Στη μελέτη μας, η αναπαραγωγή του καταλληλότερου μοντέλου μυελικής απλασίας επιτεύχθηκε με την προσθήκη των μυελοκατασταλτικών κυτταροκινών IFN-γ και TNF-α σε φυσιολογικό σύστημα μακράς διάρκειας καλλιέργειας μυελού των οστών. Στο μοντέλο αυτό έγινε διερεύνηση των μοριακών μονοπατιών των σχετιζομένων με την Fas και TRAIL επαγόμενη απόπτωση. Παράλληλα, έγινε σύγκριση των δεδομένων από το in vitro μοντέλο με τα αποτελέσματα της παράλληλης μελέτης των αντίστοιχων μοριακών παραμέτρων σε κύτταρα μυελού ασθενών με απλαστική αναιμία. Στο IFN-γ/ΤNF-α μοντέλο παρατηρήθηκε σημαντική μείωση τόσο των πιο άωρων LTC-IC όσο και των πιο δεσμευμένων προγονικών κυττάρων, σε σχέση με τις καλλιέργειες-μάρτυρες. Επιπλέον, τα αποτελέσματα των πρωτογενών και δευτερογενών καλλιεργειών βραχείας διάρκειας σε μυελικά κύτταρα ασθενών με ενεργό νόσο, επιβεβαίωσαν το χαρακτηριστικό γνώρισμα της απλαστικής αναιμίας, δηλαδή, το μειωμένο αριθμό προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Η επώαση φρέσκων φυσιολογικών μυελικών κυττάρων, σε 5-6 εβδομάδων LTBMC σύστημα, με συνδυασμό των TNF-α/IFN-γ παραγόντων οδηγεί σε αύξηση της Fas mRNA έκφρασης στα CD34+ κύτταρα, κάτι που δεν παρατηρείται στα, αντίστοιχα, φρέσκα και στα 5-6 εβδομάδων κύτταρα-μάρτυρες. Το εύρημα αυτό σε συνδυασμό με τη χαμηλή mRNA έκφραση της caspase 3 καθώς και την απουσία έκφρασης των Bcl-2, Bax και της caspase 8 στον ίδιο πληθυσμό, προτείνουν το σημαντικό ρόλο του external μονοπατιού επαγωγής της απόπτωσης, όπως αυτό ρυθμίζεται από την δράση των μυελοκατασταλτικών κυτοκινών TNF-α/IFN-γ. Παράλληλα, η παρουσία χαμηλής Bcl-2 mRNA έκφρασης, στα CD34+ κύτταρα, τονίζει τη σημασία της αναλογίας προ-αποπτωτικών/αντι-αποπτωτικών σημάτων στη κυτταρική έκβαση. To σημαντικότερο, πάντως, εύρημα του TNF-α/IFN-γ μοντέλου είναι η συνεχής TRAIL mRNA έκφραση, στα CD34+ κύτταρα αυτού, κάτι το οποίο δεν έχει αναφερθεί, ως τώρα, στη βιβλιογραφία. Η μοριακή ανάλυση των μυελικών κυττάρων των ΑΑ ασθενών απεκάλυψε, εκτός της Fas mRNA έκφρασης στα BMMNC και/ή στα CD34+ κύτταρα, την αυξημένη TRAIL mRNA έκφραση στο CD34+ κυτταρικό πληθυσμό των ασθενών με ενεργό νόσο. Αντίθετα, στους ασθενείς σε ύφεση, απουσιάζει η έκφραση και των δύο γονιδίων στον ίδιο πληθυσμό. Ενώ, στα BMMNC η έκφραση του TRAIL mRNA παραμένει, ένα συνεχές εύρημα, ακόμη και στους ασθενείς σε ύφεση. Επιπρόσθετα, η μειωμένη έκφραση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων Bcl-xl και/ή Bcl-2 στα BMMNC όλων των ασθενών και του Bcl-xl στα CD34+ κύτταρα των ασθενών με ενεργό νόσο, δείχνει «ανίκανη» να αναστείλλει το μηχανισμό της απόπτωσης στους AA ασθενείς. Το γεγονός ότι η έκφραση του TRAIL mRNA είναι συνεχής στο CD34+ κυτταρικό πληθυσμό του TNF-α/IFN-γ μοντέλου και μόνο στα CD34+κύτταρα ΑΑ ασθενών με ενεργό νόσο, δείχνει τη σημαντικότητα του συγκεκριμένου μορίου στην απόπτωση των προγονικών κυττάρων στη μυελική απλασία. Συμπερασματικά, το μοντέλο μυελικής απλασίας που τελικά επιλέξαμε επιβεβαιώνει προηγούμενη γνώση της συμμετοχής των TNF-α και IFN-γ στη παθοφυσιολογία της απλαστικής αναιμίας. Παράλληλα, τα μοριακά δεδομένα, τόσο του μοντέλου όσο και των ασθενών με απλαστική αναιμία, ενισχύουν την εμπλοκή του Fas/FasL στη παθογένεση της νόσου και προτείνουν την πιθανή συμμετοχή του TRAIL/Apo2L στην όλη διαδικασία. / In aplastic anemia (AA) the hypocellular bone marrow and blood pancytopenia occur as a result of damage to hematopoietic stem cells . Previous studies have shown that a profound quantitative and qualitative defect in the stem cell compartment is a common feature in most patients with AA. Clinical and laboratory data suggest that the immune system, especially T lymphocytes, have an important role in the development of AA. It is well established that IFN-γ and TNF-α mediate hematopoietic stem cell suppression in aplastic anemia. These proinflammatory cytokines exhibit additive rather than synergistic effect, which may be mediated by the IFN-γ-dependent increase in Fas expression on CD34+ progenitor cells and by the IFN-γ-inducible secretion of TNF-α by macrophages. Bone marrow total mononuclear and progenitor cells from aplastic anemia patients are more apoptotic than cells from normal donors, indicating that apoptosis may be a major mechanism of stem cell loss in aplastic anemia. The aim of our study was to investigate the molecular mechanisms involved in the immune-mediated pathology of aplastic anemia. Since aplastic anemia is a rare disease the existence of an easily reproducible model of in vitro hematopoietic cell suppression can facilitate studies concerning the molecular pathways of this disease. In our study, we reproduced such a model with the addition of the myelosuppressive cytokines IFN-γ and TNF-α in a normal long term bone marrow culture system. In this model, we examined the Fas mediated pathway of apoptosis and especially the correlation between TRAIL expression and myelosuppression. We, also, studied these parameters in marrow cells from aplastic anemia patients. The IFN-γ and TNF-α inhibitory cytokines appeared to affect both immature LTC-ICs and more commited progenitor cells capable of lineage-specific colony formation (CFCs). In addition our progenitor cell assays results in patients, supported this unifying feature of reduced haematopoietic progenitor cells in aplastic anemia. TNF-α and IFN-γ treatment up-modulated Fas expression and induced apoptosis of 5-6 weeks cultured normal CD34+ cells, while normal freshly isolated and 5-6 weeks untreated cultured CD34+ cells showed no Fas mRNA expression. This finding, along with the low mRNA expression of caspase 3 and the absence of Bcl-2, Bax and caspase 8 expression, proposes the major role for activation of the extrinsic apoptosis pathway due to treatment of BMMNC with TNF-α and IFN-γ. In parallel, the existence of the low Bcl-xl mRNA expression in the same cell compartment points to the importance of the ratio of pro-apoptotic to anti-apoptotic signals, in cell fate. The most interesting finding is the constant TRAIL mRNA expression on CD34+ cells in TNF-α/IFN-γ treated LTBMC, something not mentioned before. Molecular analysis of patients’ marrow cells revealed, apart from Fas mRNA expression in BMMNC and/or CD34+ cells, TRAIL mRNA expression in CD34+ cell population in active disease. Ιn contrast, in patients in remission, both Fas and TRAIL mRNA expression does not exist. Instead, in BMMNC’s cell compartment TRAIL mRNA expression remains a constant finding even in patients in remission. Additionally, the decreased expression of anti-apoptotic bcl-xl and/or bcl-2 in all patients’ BMMNCs and bcl-xl expression in CD34+ cells from patients with active disease, seems unable to inhibit the mechanism of apoptosis in aplastic anemia patients. In our study, the fact that the expression of TRAIL was constant on CD34+ cells in TNF-α/IFN-γ treated LTBMC and only in CD34+ cells of patients with active disease, points out its significance in apoptosis of progenitor cells. In conclusion, our in vitro model of hematopoietic suppression confirmed previous knowledge for participation of TNF-α and IFN-γ in the pathophysiology of marrow failure in aplastic anemia. In parallel, the molecular data both from the in vitro model, as well as from patients with aplastic anemia, reinforce the implication of Fas/FasL pathway in the pathogenesis of this disease and propose a probable role for TRAIL/Apo2L in the process.

Η λεπτίνη παράγεται από τα κύτταρα του λιπώδους ιστού, καθώς και από άλλους ιστούς συμπεριλαμβανομένων του πλακούντος και ρυθμίζει τη πρόσληψη τροφής, τη κατανάλωση ενέργειας, την αναπαραγωγική διαδικασία και τις ανοσολογικές λειτουργίες. Για τη διερεύνηση του ρόλου της λεπτίνης επί του νεογνικού ανοσολογικού συστήματος μετρήσαμε τα επίπεδα λεπτίνης και κυτταροκινών (INF-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10 και IL-12) στον ορό αίματος ομφαλίου λώρου 481 φυσιολογικών νεογνών τα οποία γεννήθηκαν από υγιείς μητέρες. 317 ήταν νεογνά με ιδανικό βάρος γέννησης για την ηλικία κύησης (AGA) και 164 έφεραν αυξημένο βάρος για την ηλικία κύησης (LGA). Η ενδιάμεση συγκέντρωση λεπτίνης σε ολόκληρο το δείγμα ήταν 11.6 ng/ml. Στο 12% AGA νεογνών, τα επίπεδα λεπτίνης ήταν υψηλότερα του μέσου όρου (ενδιάμεση τιμή 34 ng/ml). Στο 33% των νεογνών αυτών (4% του ολικού δείγματος) τα επίπεδα λεπτίνης κυμαίνονταν μεταξύ 37.5-204 ng/ml, στην ομάδα αυτή βρέθηκαν επίσης υψηλά επίπεδα ιντερφερόνης-γ (μέση τιμή 27.11 pg/ml, διακύμανση 17.5-38.5 pg/ml). Κατόπιν μελετήσαμε εάν η λεπτίνη μπορεί να επηρεάσει τη γονιδιακή έκφραση κυτταροκινών στα Τ κύτταρα και μονοκύτταρα αίματος ομφαλίου λώρου. Η καλλιέργεια των κυττάρων ομφαλίου λώρου (Τ ή μονοκυττάρων) AGA νεογνών, τυχαία επιλεγμένων ή κυττάρων περιφερικού αίματος ενηλίκου, με λεπτίνη είχε σαν αποτέλεσμα τη γονιδιακή έκφραση IL-2, INF-γ και IL-4 από τα κύτταρα του ομφαλίου λώρου, καθώς και από τα Τ κύτταρα του ενηλίκου όπως και την έκφραση IL-10 κυρίως από τα μονοκύτταρα αίματος ομφαλίου λώρου. Σημαντικά υψηλότερη γονιδιακή έκφραση INF-γ παρατηρήθηκε σε Τ κύτταρα ομφαλίου λώρου θήλεος τα οποία καλλιεργήθηκαν με λεπτίνη συγκριτικά με τα Τ κύτταρα ομφαλίου λώρου άρρενος. Συμπερασματικά, η παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων λεπτίνης και INF-γ στον ορό αίματος ομφαλίου λώρου φυσιολογικών AGA νεογνών, καθώς και το γεγονός ότι η λεπτίνη μπορεί άμεσα να διεγείρει τη γονιδιακή έκφραση κυτταροκινών σε κύτταρα ομφαλίου λώρου (Τ και μονοκύτταρα) δείχνει ότι τα υψηλά επίπεδα λεπτίνης μπορούν ανεξάρτητα να επηρεάσουν το ανοσολογικό σύστημα των φυσιολογικών νεογνών και να συμβάλλουν στη Th1 διαφοροποίηση της ανοσολογικής απόκρισης. / Leptin is a hormone synthesized by adipocytes and other tissues, including the placenta, and it regulates food intake and energy expenditure, reproductive and immune functions. To investigate the role of leptin in neonatal immunity, we measured serum leptin and cytokine (INF-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) levels in cord blood (cb) of 481 healthy neonates, born to healthy mothers, of which 317 were appropriately grown for gestational age (AGA) and 164 were large for gestational age (LGA). The median serum leptin concentration in the whole sample was 11.6 ng/ml. In 12% AGA neonates, leptin levels were well above average, with a median of 34 ng/ml. In 33% of these neonates (4% of the total sample) leptin levels ranged between 37.5-204 ng/ml; in this group, significantly elevated levels of serum IFN- were also found (mean 27.11 pg/ml, range 17.5-38.5 pg/ml). We then investigated whether leptin can independently influence cytokine gene expression by cb T-cells and monocytes (Mc). Culture of cb T-cells or Mc, isolated from randomly selected AGA neonates or adult peripheral blood mononuclear cells (PBMC), with leptin, resulted in upregulation of IL-2, IFN- and IL-4 gene expression in cb and adult T-cells and IL-10 gene expression mainly in cb-Mc. Significantly higher expression of IFN- occurred in female cb-T-cells cultured with leptin, compared with male cb-T-cells. In conclusion, the concurrent presence of high concentrations in both leptin and INF- in cb of healthy AGA infants, together with the fact that leptin can directly upregulate cytokine gene expression in cb T and Mc cells, indicate that abnormally high leptin levels can independently influence the immune system of healthy newborns, and may mediate gender differences in the development of a Th1 polarized immune response.