Η πλειοτροπίνη (pleiotrophin, PTN), είναι ένας αυξητικός παράγοντας 18 kDa με υψηλή συγγένεια για την ηπαρίνη. Το μόριο της PTN είναι πολύ συντηρημένο μεταξύ των ειδών και έχει 50% ομολογία με τη midkine, με την οποία συγκροτεί μια νέα οικογένεια αυξητικών παραγόντων. Υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης έχουν ανιχνευθεί σε πολλούς καρκινικούς όγκους, αλλά και κυτταρικές σειρές που προέρχονται από διάφορους τύπους καρκίνου σε ανθρώπους. Αρκετές είναι οι αναφορές που υποδεικνύουν την PTN ως μόριο που ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση κυττάρων. Επίσης, έχει προταθεί θετική συσχέτιση της PTN με την αγγειογένεση in vivo, αλλά και με κυτταρικές λειτουργίες που σχετίζονται με την αγγειογένεση in vitro. Ασκεί τη βιολογική της δράση μετά από αλληλεπίδραση με πρωτεογλυκάνες της επιφάνειας του κυττάρου ή μετά από δέσμευση σε ειδικούς υποδοχείς, όπως o υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (RPTPβ/ζ) και ο υποδοχέας του αναπλαστικού λεμφώματος με δράση κινάσης τυροσίνης (ALK). Στην παρούσα εργασία διαπιστώθηκε η έκφραση του υποδοχέα RPTPβ/ζ στα κύτταρα HUVEC, T98G, MO59K, U87MG, LN18, C6 και LNCaP, ενώ ο υποδοχέας ALK ανιχνεύεται σε μικρότερα επίπεδα στα κύτταρα T98G, MO59K, LN18, C6 και LNCaP. Η PTN αλληλεπιδρά με τη διαμεμβρανική μεγάλη ισομορφή του υποδοχέα RPTPβ/ζ με υψηλό βαθμό γλυκοζυλίωσης σε όλα τα υπό μελέτη κύτταρα, ενώ φαίνεται πως η διμερισμένη μορφή της, μοριακού μεγέθους 36 kDa, είναι αυτή που δεσμεύεται στους υποδοχείς της. Καθώς η PTN έχει πρόσφατα ταυτοποιηθεί ως σημαντικός αυτοκρινής παράγοντας για την καρκινική σειρά LNCaP και με βάση αποτελέσματα που δείχνουν ότι τα δύο άκρα του μορίου ίσως να παίζουν σημαντικό ρόλο στις βιολογικές δράσεις του αυξητικού παράγοντα, δημιουργήθηκαν σταθερά διαμολυσμένα καρκινικά κύτταρα προστάτη LNCaP που υπερεκφράζουν την αλληλουχία HΔ111-136 της PTN, από την οποία λείπουν τα 26 αμινοξέα του καρβόξυτελικού άκρου (HΔ111-136) και σταθερά διαμολυσμένα κύτταρα LNCaP που υπερεκφράζουν την αλληλουχία 9-110 που κωδικοποιεί τα αμινοξέα (Η9-110). Τα κύτταρα αυτά θα χρησιμοποιηθούν προκειμένου να βρεθεί αν τα άκρα του μορίου που εκφράζεται ενδογενώς εμπλέκονται με κάποιο τρόπο στις παρατηρούμενες βιολογικές δράσεις του μορίου. Στο πλαίσιο της προσπάθειας διαλεύκανσης της σχέσης δομής-δράσης της PTN, προηγούμενα αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας έχουν δείξει ότι η πλασμίνη πρωτεολύει την ΡΤΝ, οδηγώντας στο σχηματισμό πέντε πεπτιδίων με διαφορετικές δράσεις σε αγγειογενετικές διαδικασίες in vitro και in vivo. Επιπλέον, o αναστολέας της πλασμίνης απροτινίνη αναστέλλει την πρωτεόλυση της ΡΤΝ από πλασμίνη, ενώ είναι γνωστό ότι επάγει την αγγειογένεση in vivo στο μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας, τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων καθώς και τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό λείων μυϊκών κυττάρων Με βάση τα παραπάνω δεδομένα, μελετήθηκε η πιθανή εμπλοκή της ΡΤΝ στις διεγερτικές δράσεις της απροτινίνης σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά HUVEC και καρκινικά κύτταρα προστάτη LNCaP. Διαπιστώθηκε πως η απροτινίνη επάγει τη μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων προστάτη. Επίσης, εκτός από αναστολή της πρωτεόλυσης της ΡΤΝ, η απροτινίνη επάγει και την έκκριση της ΡΤΝ στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων HUVEC και LNCaP, μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα AP-1 και μεταγραφής του γονιδίου της ΡΤΝ. Η ΡΤΝ φαίνεται να εμπλέκεται στην επαγόμενη από απροτινίνη κυτταρική μετανάστευση μέσω του υποδοχέα της RΡΤΡβ/ζ και στους δύο τύπους των υπό μελέτη κυττάρων, ενισχύοντας την υπόθεση ότι η ΡΤΝ μέσω του υποδοχέα της RΡΤΡβ/ζ παίζει σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των κυττάρων που επάγεται από διάφορους παράγοντες. / Pleiotrophin (PTN) is an 18-kDa growth factor that has a high affinity for heparin. It is highly conserved between species and shares a 55% amino acid sequence homology with midkine. The two proteins form a new family of structurally related heparin binding growth factors. A potential role of PTN in human cancers has been suggested after the detection of PTN mRNA and/or protein in various human cancer cell lines and tumour specimens of diverse origin. Many data have shown that PTN mediates proliferation, migration and cell differentiation. Moreover, it has been suggested that PTN acts as an angiogenic molecule in vivo and in vitro. It exerts its biological activity through interaction with cell surface proteoglycans and more specific receptors like receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) and anaplastic lymphoma kinase (ALK). In the present study, RPTPβ/ζ protein expression has been detected in HUVEC, T98G, MO59K, U87MG, LN18, C6 and LNCaP cells, while ALK receptor is expressed as a protein at lower levels in T98G, MO59K, LN18, C6 and LNCaP cells. Interestingly, dimmers of PTN with a molecular mass of 36 kDa seem to interact with the transmebrane long isoform of RPTPβ/ζ, in all cells under study. It was also observed that dimerized PTN, is capable of co-immunoprecipitating with ALK in LNCaP cells, although this interaction could not be verified in all assays. As PTN has been recently identified as an important autocrine growth factor for the LNCaP prostate cancer cell line and based on data showing the important role of the terminal domains of PTN on its biological activities, we have developed stably transfected LNCaP cell lines overexpressing PTN lacking 25 aminoacids from its C-terminal region or the sequence that corresponds to aminoacids 9-110 of the growth factor. These cell lines are going to be used in order to investigate the implication of the terminal domains of the endogenously expressed molecule in the observed biological activities. In the frame of structure - function analysis of PTN, previous results of our group have shown that through proteolytic activity, plasmin can generate five peptides that correspond to distinct domains of the molecule, which can either activate or inhibit angiogenesis. Aprotinin, a serine protease inhibitor, enhances angiogenesis in the in vivo model of the chick embryo chorioallantoic membrane. Furthermore, aprotinin induces HUVEC migration, smooth muscle cell migration and proliferation, as well as LNCaP cell proliferation. The goal of this study was to evaluate the possible implication of PTN in aprotinin-induced stimulatory activities in human endothelial and prostate cancer cells. Our data demonstrate that aprotinin induces LNCaP and HUVEC cell migration. In line with its inhibitory effect on plasmin, aprotinin increased the amounts of the full length PTN detected in the culture medium of LNCaP and HUVEC cells. This increase seems to be due partly to inhibition of PTN proteolysis and partly to transcriptional activation of the PTN gene, as evidenced by the increased luciferase activity of a reporter gene vector carrying the full length promoter of the ptn gene. The latter seems to be dependent on the activation of the transcription factor AP-1. Finally, PTN seems to mediate the stimulatory effects of aprotinin in cell migration through its receptor RΡΤΡβ/ζ in LNCaP and HUVEC cells, strengthening the hypothesis that PTN plays an important role in cell migration induced by many factors.

Το αδενοκαρκίνωμα του προστάτη αποτελεί μείζων και κλιμακούμενο πρόβλημα παγκοσμίως. Σε πολλές ανεπτυγμένες χώρες ο καρκίνος του προστάτη αποτελεί την πιο κοινά διαγνωσμένη κακοήθεια στους άνδρες. Η μετάσταση των καρκινικών κυττάρων αποτελεί την κύρια αιτία θνησιμότητας και συχνά συμβαίνει μέσω του λεμφαγγειακού συστήματος που αποτελεί την κυριότερη οδό για την διαφυγή των καρκινικών κυττάρων. Η εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων στους λεμφαδένες είναι ένα από τα πρώτα βήματα της μεταστατικής διαδικασίας και αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για την πρόγνωση. Η λεμφαγγειογένεση (σχηματισμός νέων λεμφαγγείων) θεωρείται καθοριστική για την μετάσταση των καρκινικών κυττάρων στους λεμφαδένες. Οι λεμφαγγειογενετικοί παράγοντες φαίνεται να προάγουν, τη δημιουργία νέων λεμφαγγείων καθώς και τη μετάσταση του πρωτοπαθούς όγκου στους λεμφαδένες. Ένα από τους παράγοντες αυτούς είναι ο VEGF-C. Σκοπός. Η μελέτη αυτή σχεδιάστηκε για την σύγκριση της λεμφαγγειοβρίθειας μεταξύ προστατικών καρκινωμάτων με και χωρίς λεμφαδενικές μεταστάσεις. Σκοπό της εργασίας αποτελούσε επίσης η διευκρίνιση του ρόλου που παίζει ο λεμφαγγειογενετικός παράγοντας VEGF-C στις λεμφαδενικές μεταστάσεις. Σχεδιασμός της μελέτης. Για τον λόγο αυτό εγκλεισμένοι σε παραφίνη ιστοί 87 ασθενών οι οποίοι υποβλήθηκαν σε ριζική προστατεκτομή επεξεργάσθηκαν με τη διαδικασία της ανοσοϊστοχημείας με μονοκλωνικά αντισώματα για της πρωτεΐνες CD-31, Lyve-1, podoplanin και VEGF-C. Αποτελέσματα. Ετερογενής χρώση για τον VEGF-C παρατηρήθηκε στο σύνολο των καρκινικών δειγμάτων. Η ανοσοχρώση παρουσίαζε μεγαλύτερη ένταση στα περιστατικά με λεμφαδενικές μεταστάσεις σε σχέση με αυτά που έφεραν αρνητικούς λεμφαδένες. Μεγαλύτερη λεμφαγγειοβρίθεια εντοπίσθηκε γύρω από τον όγκο σε σχέση με τις εντός του όγκου περιοχές. Η λεμφαγγειοβρίθεια δεν σχετίσθηκε με την ύπαρξη μεταστάσεων ούτε με το grade του όγκου. Συμπεράσματα. Από κοινού τα αποτελέσματα αυτά προτείνουν ότι η λεμφαγγειοβρίθεια δεν μπορεί να αποτελέσει προγνωστική μεταβλητή των λεμφαδενικών μεταστάσεων στο αδενοκαρκίνωμα του προστάτη. Ο VEGF-C παρουσιάζει έντονη έκφραση στις καρκινικές περιοχές και η σχέση που εντοπίσθηκε με τις λεμφαδενικές μεταστάσεις προτείνει ένα πιθανό ρόλο στην ανάπτυξη λεμφαδενικών μεταστάσεων. Πχ μέσω της αυξημένης διαπερατότητας των τοιχωμάτων των λεμφαγγείων. / Carcinoma of the prostate now constitutes a major and escalating international health problem. In many developed countries prostate cancer is the most commonly diagnosed malignancy in men. The metastatic spread of tumor cells is the most lethal aspect of cancer and often occurs via the lymphatic vasculature which serves as a major route for tumour metastasis. The dissemination of malignant cells to the regional lymph nodes is an early step in the progression of prostate tumours and is an important determinant of prognosis. Lymphangiogenesis (formation of new lymphatic vessels) is thought to be crucial for cancer cells to metastasise to the regional lymph nodes. Lymphangiogenic growth factors have been identified that promote formation of tumor lymphatics and metastatic spread of tumor cells to lymph nodes. These include the secreted glycoproteins vascular endothelial growth factor- C (VEGF-C) Purpose: This study was designed to compare prostate carcinoma, with and with no lymph node metastasis, for lymphatic vessel density (LVD) and the expression of the lymph-endothelial specific growth factor, vascular endothelial growth factor C (VEGF-C), to determine their role in lymphogenic metastasis. Experimental Design: For this purpose paraffin-embedded tissues obtained from 87 patients who underwent radical prostatectomy were immunostained with D2-40, CD-31, Lyve-1 and VEGF-C monoclonal antibodies. The associations between the results were analyzed with statistic analysis protocols. Results: Widespread, heterogeneous staining for VEGF-C was observed in all cancer specimens. Intensity of VEGF-C staining was higher in carcinomas with lymph node metastasis than in those with negative lymph nodes. The highest LVD was found in periphery as opposed to tumorous areas. There was no correlation with clinical staging. Conclusions: Together, these results suggest that LVD is not a prognostic variable for the process of lymphogenic metastasis in prostate cancer. VEGF-C is up-regulated in prostate cancer and its correlation with lymph node status suggests a role for the development of lymph node metastasis. e.g. via an increased permeability of lymphatic vessels.

Το αδενοκαρκίνωμα του προστάτη αποτελεί σημαντικό πρόβλημα υγείας σε παγκόσμια κλίμακα. Οι διαθέσιμες μέθοδοι κλινικής σταδιοποίησης φαίνεται να μην επαρκούν εφόσον 10% περίπου των ασθενών στους οποίους διαγιγνώσκεται εντοπισμένη νόσος και υποβάλλονται σε ριζική προστατεκτομή εμφανίζουν ήδη μετάσταση στους λεμφαδένες. Το αναπτυσσόμενο ενδιαφέρον για τη μοριακή σταδιοποίηση βασίζεται στα αποτελέσματα μελετών που χρησιμοποιούν δείκτες λεμφαγγείων και λεμφαγγειογενετικούς παράγοντες στην πρόβλεψη της κατάστασης των λεμφαδένων. Ερευνητικές μελέτες στο καρκίνωμα του μαστού, του τραχήλου και του στομάχου υποδεικνύουν τη στενή σχέση ανάμεσα στη λεμφαγγειακή πυκνότητα (LVD) και τις λεμφαδενικές μεταστάσεις. Ο διατηρημένος στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) αποτελεί κινάση σερίνης/θρεονίνης του σηματοδοτικού μονοπατιού (PI3K)/AKT. Μεγάλος αριθμός μελετών υποδεικνύει το πιθανό ρόλο του m-TOR στην αγγειογένεση μέσω της επαγωγής του VEGF-A. Αποτελέσματα μελετών συνδέουν τη κινάση m-TOR με την αγγειογένεση μέσω της επαγωγής του αυξητικού παράγοντα VEGF-A. Η συμμετοχή του mTOR στη λεμφαγγειογένεση δεν είναι τόσο σαφής εφόσον φαίνεται να κατέχει σημαντικό ρόλο στην επαγόμενη λεμφαγγειογένεση από τον VEGF-C αλλά όχι από τον VEGF-A. Επιπλέον παραμένει ασαφές εάν η έκφραση του m-TOR συνδέεται με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων. Παρόλο που ο COUP-TFII είναι απαραίτητος για τη λεμφαγγειογένεση, ελάχιστα είναι γνωστά για τη σχέση ανάμεσα στον μεταγραφικό παράγοντα το mTOR και τη δημιουργία λεμφαδενικών μεταστάσεων στο αδενοκαρκίνωμα του προστάτη. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός της έκφρασης της ενεργοποιημένης κινάσης (p-mTOR) και η σύγκριση της με παραμέτρους που σχετίζονται με τα λεμφαγγεία (LVD, παρουσία καρκινικών εμβόλων κτλ) σε ασθενείς με αρνητικούς και θετικούς λεμφαδένες. Τα λεμφαγγεία καθορίσθηκαν από τους ειδικούς δείκτες D2-40 και LYVE-1. Επιπλέον εξετάσαμε την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα COUP-TFII και των αυξητικών παραγόντων VEGF-A και VEGF-C σε σχέση με την έκφραση του p-mTOR τη μέση λεμφαγγειακή πυκνότητα την παρουσία εμβόλων και την κατάσταση των λεμφαδένων. Για να επιτευχθεί ο στόχος της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν ιστοί εγκλεισμένοι σε παραφίνη από 92 ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε ριζική προστατεκτομή. Εφαρμόσθηκε ανοσοϊστοχημική μέθοδος, χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι των p-mTOR, D2-40, CD-31, LYVE-1, VEGF-C, VEGF-A και COUP-TFII. Οι σχέσεις ανάμεσα στα αποτελέσματα εξετάσθηκαν με πρωτόκολλα στατιστικής ανάλυσης. Στην παρούσα μελέτη, η περιφερική του όγκου LVD η οποία καθορίσθηκε από το D2-40 ήταν αυξημένη στα περιστατικά με pN1. Η ένταση και η κατανομή της ανοσοϊστοχημικής χρώσης για το p-mTOR ήταν αυξημένη στα καρκινώματα με λεμφαδενικές μεταστάσεις σε σχέση με αυτά που παρουσίαζαν αρνητικούς λεμφαδένες. Επιπλέον, τα περιστατικά με εντονότερη κυτταροπλασματική έκφραση του p-mTOR παρουσίασαν αυξημένη LVD και μεγαλύτερο αριθμό διηθημένων λεμφαγγείων. Αντίστοιχα οι περιπτώσεις με pN1 παρουσίασαν εντονότερο ανοσοϊστοχημικό εντοπισμό των VEGF-C, VEGF-A και COUP-TFII που επίσης σχετίσθηκε με την παρουσία περισσότερων λεμφαγγειακών εμβόλων και με υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του p-mTOR. Τέλος ο αριθμός των COUP-TFII θετικών αγγείων ήταν μεγαλύτερος στα περιστατικά με λεμφαδενικές μεταστάσεις και διηθημένα λεμφαγγεία. Τα ευρήματα μας υποδεικνύουν ότι τόσο το D2-40 όσο και το LYVE-1 αποτελούν ειδικούς δείκτες για τον εντοπισμό των λεμφαγγείων. Παρόλα αυτά η έκφραση του LYVE-1 περιοριζόταν σε έναν υποπληθυσμό λεμφαγγείων ελαττώνοντας την ευαισθησία του μορίου ως δείκτη. Η ενεργοποίηση του mTOR σηματοδοτικού μονοπατιού φαίνεται να διευκολύνει τη δημιουργία λεμφαδενικών μεταστάσεων πιθανώς επάγοντας την έκφραση των VEGF-C και VEGF-A. Η επαγωγή των αυξητικών παραγόντων έχει ως επακόλουθο την δημιουργία νέων λεμφαγγείων και πιθανόν την αύξηση της διαπερατότητας τους. Επιπλέον τα αποτελέσματα μας υποδηλώνουν ότι ο COUP-TFII ευοδώνει όχι μόνο τη νέο-λεμφαγγειογένεση αλλά και τη λεμφαγγειακή διήθηση. Τέλος μπορεί να υποτεθεί ότι τα νεοδημιουργηθέντα λεμφαγγεία είναι σημαντικότερα από τα ώριμα για τη εξάπλωση του προστατικού αδενοκαρκινώματος στους επιχώριους λεμφαδένες. / Adenocarcinoma of prostate is a major health problem worldwide. The available methods for clinical staging seem to be inefficient, since approximately 10% of patients who will undergo radical prostatectomy for clinically localized disease, harbor metastasis in the regional lymph nodes. Recent studies that utilize lymphangiogenic factors and lymphangiogenesis markers to predict the nodal status trigger the interest in molecular staging. Research studies in breast, cervical and gastric cancers suggest a high correlation between the lymphatic microvessel density (LVD) and nodal metastasis. The conserved mammalian target of rapamycin (mTOR) is a serine/threonine kinase of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT signaling pathway. Many studies suggest a role of m-TOR in angiogenesis via the upregulation of VEGF-A. In lymphangiogenesis the participation of mTOR is more complicated as it seems to be essential for the VEGF-C induced lymphangiogenesis but not for lymphangiogenesis that is induced from VEGF-A. Furthermore it is unclear if the expression of m-TOR correlates with the presence of lymph node metastasis or not. Although studies indicate that the transcription factor COUP-TFII is indispensable for lymphangiogenesis, little is known about the relationship between the transcription factor, mTOR and lymph node metastasis in prostate adenocarcinoma. The aim of this study was to determine the expression status of the activated kinase p-mTOR and compare it with lymphatic parameters (LVD, lymphatic invasion etc.) in patients that were found to have positive lymph nodes and patients with negative lymph node status. The lymphatics were determined with the lymphatic-specific markers D2-40 and LYVE-1. Moreover, we examined the expression of the transcription factor COUP-TFII, the vascular endothelial growth factors A and C (VEGF-A, VEGF-C) in relation to each other, p-mTOR expression, mean LVD, lymphatic invasion and lymph node status. In order to accomplish our objective paraffin-embedded tissues obtained from 92 patients who underwent radical prostatectomy were immunostained with p-mTOR, D2-40, CD-31, LYVE-1, VEGF-C, VEGF-A and COUP-TFII antibodies. The associations between the results were analyzed with statistical analysis protocols. In the current study, peritumoral (but not intratumoral) mean LVD assessed by D2-40 was higher in pN1 tumors. Intensity of p-mTOR staining was higher in carcinomas with lymph node metastasis than in those with negative lymph nodes. Furthermore, higher p-mTOR cytoplasmic expression was strongly associated with LVD and lymphatic invasion. Intense VEGF-C, VEGF-A and COUP-TFII immunostaining was observed in N1 cases and correlated with the presence of lymphatic emboli and higher p-mTOR expression. Finally the number of COUP-TFII positive vessels was positively associated with lymph node metastasis and lymphatic invasion. Our findings suggest that both D2-40 and LYVE-1 are useful markers that may reveal lymphatic vasculature, the latter however showing lower expression, probably limited to a specific lymphatic vessel cellular sub-population. Activation of mTOR pathway may facilitate nodal metastasis, possibly due to increased lymphangiogenesis and lymphatic vessel invasion via increased VEGF-C and VEGF-A expression. Additionally our results indicate that COUP-TFII may facilitate not only neo-lymphangiogenesis but also promotes lymphatic invasion. Finally it seems that newly formed lymphatic vessels are more important than mature ones for lymphatic spread in prostate adenocarcinoma.

Ο μεταγραφικός παράγοντας PPARγ ανήκει στην οικογένεια των πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην διαδικασία της καρκινογένεσης του προστάτη, συμμετέχοντας στην κυτταρική διαφοροποίηση, στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, στην ενεργοποίηση ή καταστολή της μεταγραφής συγκεκριμένων γονιδίων, στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, στην απόπτωση, στην αναστολή της αγγειογένεσης, στην διεισδυτική ικανότητα και στο μεταστατικό δυναμικό του αδενοκαρκινώματος του προστάτη, καθώς επίσης και στο μεταβολικό μονοπάτι του αραχιδονικού οξέος μέσω αναστολής της κυκλο-οξυγενάσης 2. O ΡΡΑRγ φαίνεται να διαθέτει αντινεοπλασματική δράση, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο στην χημειοπροφύλαξη, όσο και στην χημειοθεραπευτική αντιμετώπιση του αδενοκαρκινώματος του προστάτη. / The transcription factor PPARγ is a member of the superfamily of the nuclear hormone receptors and plays a significant role in the carcinogenesis of the prostate. PPARγ participates and controls various cellular functions, necessary for the malignant transformation of the prostatic cell, such as the cellular differentiation, the gene expression, the activation or repression of the transcription of various genes, the control of the cell cycle, the apoptosis, the inhibition of aggiogenesis, the invasive and metastatic potential of the adenocarcinoma and finally the metabolic pathway of the arachidonic acid, through inhibition of the COX-2. The antiproliferative functions of PPARγ can be used for the chemoprevention and as an adjuvant in the chemotherapeutic regimens targetting the adenocarcinoma of the prostate.

- / -

Τα ρετινοειδή αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια οργανικών μορίων που μοιάζουν δομικά με τη βιταμίνη Α. Το all-trans ρετινοϊκό οξύ (atRA) είναι γνωστό πως ρυθμίζει ένα μεγάλο εύρος κυτταρικών βιολογικών διεργασιών μέσω της πρόσδεσής του και της ενεργοποίησης των υποδοχέων του, τους υποδοχείς ρετινοϊκού οξέος (RAR) και τους υποδοχείς ρειτνοειδών Χ (RXR). Κάθε κατηγορία υποδοχέων περιλαμβάνει τρία μέλη, α, β και γ. Τα ρετινοειδή χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία πολλών ασθενειών, από την κοινή ακμή ως την οξεία προμυελωτική λευχαιμία. Η χρήση τους, παρ’ όλα αυτά, περιορίζεται εξαιτίας των σοβαρών ανεπιθύμητων ενεργειών τους, και είναι επιτακτική ανάγκη να συντεθούν ανάλογα με λιγότερες ανεπιθύμητες δράσεις. Προς αυτήν την κατεύθυνση έχουν συντεθεί πολλά ανάλογα, ανάμεσα τους και το N12-bis(all-trans-retinoyl)spermine (RA2SPM), ένα σύζευγμα δύο μορίων atRA με σπερμίνη, το οποίο συντέθηκε από την ερευνητική ομάδα του καθηγητή Δ. Παπαϊωάννου, στο Τμήμα Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η δράση του atRA και του RA2SPM στην αγγειογένεση και την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων προστάτη. Το atRA ανέστειλε με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο την αγγειογένεση στο μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης (CAM) εμβρύου όρνιθας, παρόλο που η δράση του ήταν χαμηλότερη από αυτή που είχε δείξει παλιότερα το RA2SPM στο ίδιο σύστημα. Παρ’ όλο που το atRA προκάλεσε επαγωγή στην έκφραση του αγγειογενετικού αυξητικού παράγοντα πλειοτροπίνη (PTN) στην CAM, ανέστειλε την αλληλεπίδρασή της με τον υποδοχέα της RPTPβ/ζ, κάτι που συνάδει με μειωμένη επαγωγική δράση της PTN στην αγγειογένεση της CAM εμβρύου όρνιθας. Τα δύο ρετινοειδή μείωσαν των αριθμό των ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων φλέβας ομφαλίου λώρου (HUVEC) και των προστατικών καρκινικών κυττάρων LNCaP και PC3, με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε όλες τις περιπτώσεις, το RA2SPM ήταν πιο αποτελεσματικό σε σχέση με το atRA. Η δράση και των δύο ρετινοειδών στα καρκινικά κύτταρα προστάτη ήταν μεγαλύτερη από τη δράση τους στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Αυτές οι δράσεις φαίνεται να σχετίζονται με αύξηση των επιπέδων του mRNA του ογκοκαταστατλικού γονιδίου RARβ και από τις δύο ουσίες που μελετήθηκαν. Ενδιαφέρον είναι ότι η δράση του atRA και του RA2SPM βρέθηκε να διαμεσολαβείται από τον RARα και ήταν μεγαλύτερη στα PC3 κύτταρα, τα οποία δεν εκφράζουν τον RARβ και θεωρούνται πιο επιθετικά. Στα κύτταρα που εκφράζουν τον RARβ, δηλαδή στα HUVEC και στα LNCaP, οι δύο ουσίες ήταν λιγότερο αποτελεσματικές. Τέλος, τόσο το atRA όσο και το RA2SPM μείωσαν τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης της PTN, η οποία είναι γνωστό πως παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων προστάτη PC3. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας υποδεικνύουν ότι το RA2SPM φαίνεται να είναι πιο αποτελεσματικό από το atRA στην αναστολή της αγγειογένεσης και της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων προστάτη. Επίσης, καταδεικνύουν τον RARα ως τον υποδοχέα μέσω του οποίου τα δύο υπό μελέτη ρετινοειδή προκαλούν αύξηση της έκφρασης του RARβ και αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων προστάτη. / Retinoids constitute a large family of organic compounds structurally related to the naturally occurring vitamin A. All-trans-retinoic acid (atRA) is known to modulate a wide range of cellular biological processes through binding to and activation of its specific receptors, retinoic acid receptors (RAR) and retinoid X receptors α, β and γ. Retinoids are being used for the treatment of various diseases, ranging from acne vulgaris to acute promyelotic leukemia. Their use however is limited due to serious adverse effects and there is a great need for analogues with minimized adverse effects. Towards this direction, many analogues are being synthesized, among which N1,N12-bis(all-trans-retinoyl)spermine (RA2SPM), a conjugate of all-trans retinoic acid with spermine, which has been synthesized by the research group of Prof. D. Papaioannou at the Dept. of Chemistry of the University of Patras. In the present work, the effect of atRA and RA2SPM on angiogenesis and prostate cancer cell growth has been studied. ATRA dose-dependently inhibited angiogenesis in the chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model, although its effect was lower that the previously shown effect of RA2SPM on the same system. Although atRA increased the expression of the angiogenic growth factor pleiotrophin (PTN) in the CAM, it decreased its interaction with its receptor RPTPβ/ζ, in line with a possible decreased effect of PTN in stimulating CAM angiogenesis. Both retinoids decreased the number of human umbilical vein endothelial (HUVEC) and prostate cancer LNCaP and PC3 cells in a concentration-dependent manner. In all cases, RA2SPM was more effective and potent compared with atRA and the effect of both retinoids on prostate cancer cells was higher than their corresponding effect on endothelial cells. These effects seem to be related to an increase of the mRNA of the RARβ tumour repressing gene by both substances tested. Interestingly, the effect of atRA and RA2SPM was mediated by RARα and was higher in PC3 cells that do not express RARβ and are considered more aggressive; in cells that express RARβ, i.e. HUVEC and LNCaP, both substances were less effective. Finally, both atRA and RA2SPM decreased mRNA and protein levels of PTN, which is known to be significant for prostate cancer PC3 cell growth. These data suggest that RA2SPM seems to be more effective than atRA in decreasing angiogenesis and prostate cancer cell growth and identify RARα as the receptor through which it causes RARβ up-regulation and decrease of prostate cancer cell growth.

Η νεοπλασία των όρχεων αναπτύσσεται σε άνδρες ηλικίας 15-35 ετών και ενώ είναι μια σπάνια μορφή νεοπλασίας (1-2% όλων των νεοπλασμάτων του άνδρα) αποτελεί τον πιο συχνό όγκο στις ηλικίες 20-40 ετών και είναι η τρίτη κατά σειρά αιτία θανάτου στις ηλικίες αυτές. Περίπου το 95% των όγκων όρχεων προέρχεται από τα βλαστικά κύτταρα. Οι πρωτεογλυκάνες είναι βιοδραστικά μόρια και η έκφραση τους τροποποιείται σημαντικά στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Μελέτες του εργαστηρίου μας έδειξαν ότι η πρωτεογλυκάνη σεργλυκίνη (SG) υπερεκφράζεται σε πολλές κακοήθειες όπως στον καρκίνο του μαστού, του πνεύμονα και σε γλοιώματα, ενώ σε πιο επιθετικές μορφές καρκινικών κυττάρων η SG υπερεκφράζεται και εκκρίνεται σε υψηλά ποσά στο μέσο καλλιέργειας. Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία μελετήθηκε η έκφραση της σεργλυκίνης σε όγκους όρχεων. Δείγματα ασθενών μελετήθηκαν με ανοσοαποτύπωση και βρέθηκε ότι η SG εκφράζεται τόσο στον φυσιολογικό ορχικό ιστό όσο και στους όγκους όρχεων όπου εμφανίζει πιο έντονη έκφραση. Ανοσοϊστοχημική μελέτη έδειξε ότι η SG εκφράζεται από τα φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα ενώ η έκφραση της αυξάνεται στους όγκους όρχεων. Η έκφραση της SG μελετήθηκε σε τρεις σειρές όγκων όρχεων (JKT-1, σεμίνωμα; NT2/D1, εμβρυϊκό καρκίνωμα; NCCIT, τεράτοκαρκίνωμα) και βρέθηκε ότι εκφράζεται και στις τρεις κυτταρικές σειρές, με μεγαλύτερη έκφραση στην πιο επιθετική σειρά, NT2/D1. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε υπερέκφραση της SG στις κυτταρικές σειρές όγκων όρχεων με διαμόλυνση των κυττάρων με πλασμίδιο που φέρει το γονίδιο της SG. Ακολούθως μελετήθηκε ο ρόλος της SG στην έκφραση βιοδραστικών μορίων, όπως είναι τα ένζυμα βιοσύνθεσης και καταβολισμού καθώς και ο υποδοχέας CD44 του ΗΑ και οι πρωτεογλυκάνες της κυτταρικής μεμβράνης syndecans. Ο CD44 είναι μια γλυκοπρωτεΐνη και αποτελεί τον κύριο υποδοχέα του ΗA. Οι συνθάσες του HA είναι τα ένζυμα που βιοσυνθέτουν το ΗΑ και διακρίνονται σε τρεις ισομορφές τις HAS- 1, HAS-2, HAS-3α και HAS-3β. Μελέτες υποστηρίζουν ότι ο μεμβρανικός υποδοχέας CD44 και το ΗΑ υπερεκφράζονται σε πολλές κακοήθειες και η αλληλεπίδρασή τους διεγείρει σειρά λειτουργιών στα κύτταρα του όγκου που συντελούν στην πρόοδο της νόσου. Η κύρια ισομορφή CD44s εκφράζεται ευρέως στους ιστούς και υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου όπου και συνυπάρχει με το ΗΑ. Η σηματοδοτική δράση του ΗΑ στα καρκινικά κύτταρα μέσω του υποδοχέα CD44 έχει προταθεί ως βασικό βήμα για την ανάπτυξη και πρόοδο της νόσου. Επίσης μελέτες έχουν δείξει πως υπάρχει συσχέτιση μεταξύ των HYALs και του διεισδυτικού και μεταστατικού φαινότυπου των όγκων. Αυξημένα επίπεδα τους έχουν βρεθεί σε όγκους της ουροδόχου κύστεως, του προστάτη, κεφαλής και τραχήλου, μαστού αλλά σε μεταστατικούς όγκους. Η ισομορφή CD44s εκφράζεται και στις τρεις κυτταρικές σειρές, αλλά η υπερέκφραση της SG μειώνει την έκφραση του CD44s στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινωμάτος, ενώ δεν επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό την έκφραση του στο σεμίνωμα και το εμβρυϊκό καρκίνωμα. Στην κυτταρική σειρά σεμινώματος, έχει βρεθεί, ότι εκφράζεται μόνο η ισομορφή HAS-3α, ενώ στις κυτταρικές σειρές του εμβρυικού καρκινώματος και του τερατοκαρκινώματος εμφανίζεται ισχυρή έκφραση της ισομορφής HAS-3α και μικρή έκφραση της HAS-2. Μετά την υπερέκφραση της SG παρατηρείται αύξηση της HAS-3a στην κυτταρική σειρά του σεμινώματος. Στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινώματος παρατηρείται αύξηση της HAS-2, ενώ στην κυτταρική σειρά του εμβρυϊκού καρκινώματος παρατηρείται αύξηση και των δυο συνθασών που μελετήθηκαν. Μελετήθηκε, επιπλέον, η έκφραση των HYAL-1, -2,-3 και PH-20 στο σεμίνωμα και το τερατοκαρκίνωμα, μετά την υπερέκφραση της SG στις σειρές αυτές. Στην κυτταρική σειρά του σεμινώματος παρατηρήθηκε αύξηση στις HYAL-2 και HYAL-3, μείωση της PH-20, ενώ δεν παρατηρήθηκε μεταβολή της HYAL-1. Αντίθετα, στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινώματος παρατηρήθηκε αύξηση και στα τέσσερα μόρια των HYALs, με τη μεγαλύτερη αύξηση να παρουσιάζεται στην HYAL-2. Οι syndecans έχoυν σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, την προσκόλληση, την μετανάστευση, την διαφοροποίηση και την αγγειογένεση. Η μελέτη στις κυτταρικές σειρές των όγκων των όρχεων έδειξε ότι οι syndecan-1 και 4 εκφράζονται στα κύτταρα του σεμινώματος και παρουσιάζουν αύξηση έπειτα από την υπερέκφραση της σεργλυκίνης, ενώ η syndecan-2 δεν εκφράζεται. Στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινώματος έπειτα από διαμόλυνση με το γονίδιο της σεργλυκίνης παρατηρήθηκε αύξηση της syndecan-2 και μείωση της syndecan-4, ενώ η syndecan-1 δεν εκφράζεται σε αυτή την κυτταρική σειρά. Οι μεταβολές αυτές μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η SG, επηρεάζει τον φαινότυπο και την συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων. / Testicular tumors are present in men between the age of 15-35 and while it is a rare type of tumor (it adds up to 1-2% of the tumors that affect men) it is the most frequent tumor at the aged between 20-40 and is the third leading cause of death in this age group range. Approximately 95% of testicular tumors originate from germ cells. The PGs are bioactive molecules and their expression is significantly modified at the microenvironment of the tumor. Our recent data showed that proteglycan serglysin (SG) is over expressed in many malignancies such as breast cancer, lung cancer and in gliomas, while in more aggressive forms of cancer cells SG is over expressed and secreted in the culture medium. In this thesis we studied the role of SG in testicular tumors. Patient samples were studied by immunoblotting and the results showed that SG is expressed both in normal testicular tissue and testicular tumor where there is greater expression. Ιmmunohistochemical study showed that SG is expressed by normal germ cells while its expression is increasing in testicular tumor. The expression of SG was studied in three cell lines of testicular cancer (JKT-1, seminoma; NT2/D1, embryonic carcinoma; NCCT, teratocarcinoma) and showed that it is expressed in all three cell lines, with higher expression in the most aggressive line, NT2/D1. Then, we achieved over expression of the testicular tumor cell lines with transfection of the cells with the plasmid which contains the gene of SG. Subsequently, we examine the role of SG in the expression of some biosynthetic and catabolic enzymes as well as HA receptor CD44 and the cell-surface PG, syndecans. CD44 is a glycoprotein and represents the major receptor for HA. The synthases of HA are the enzymes that produce HA and exist in three distinct isoforms HAS-1, HAS-2, HAS-3a, and HAS-3b. Numerous studies supports that the membrane receptor CD44 and HA are overexpressed in several malignancies and their interaction trigger various cellular events in tumour cells, which leds to the disease progression. The major isoform of CD44 is the CD44s, which is expressed widely in tissues, and is over expressed in several types of tumors, coexisting with HA. The signaling effect of HA in tumor cells through CD44 has been stated to be a crucial step in the development and progression of the disease. It was shown that there is association between HYALs and the invasive and metastatic phenotype of tumors. High levels of HYALs were found at head and neck tumors, breast cancer and metastatic tumors. The isoform CD44s is expressed in all 3 cell lines, but the over expression of SG reduces the expression of CD44 in the teratocarcinoma cell line, while it does not affect to a large extent its expression in seminoma and embryonic carcinoma. In the seminoma cell line, it has been found that only HAS-3a isoform is expressed, while in the embryonic carcinoma and teratocarcinoma cell lines showed high expression of isoform HAS-3a and low expression of HAS-2. After the overexpression of SG we detect increased levels of HAS-3a in seminoma and HAS-2 in teratocarcinoma, while at embryonic carcinoma both synthases were increased. SG over-expression in the teratocarcinoma cell line induced the expression of HAS-2 while in the embryonic carcinoma cell line triggered the expression of both synthases HAS-3a and HAS-2. The expression of HYAL-1, -2, -3 and PH-20 in the seminoma and the teratocarcinoma were also studied after the over-expression of SG in these lines. In the cell line of seminoma we noticed an increase of HYAL-2 and HYAL-3, a decrease of PH-20, while there was no variation in HYAL-1. Unlike this, in the teratocarcinoma cell line we noticed increase in all HYALs, with the greater increase shown in HYAL-2. Syndecans have an important role in the growth of tumor cells, the attachment, migration, differentiation and angiogenesis. The study of testicular tumor cell lines showed that syndecan-1 and syndecan-4 are expressed in the seminoma cells and showed to be increased after the over-expression of SG, while syndecan-2 is not expressed. In the teratocarcinoma cell line after transfection with the gene of SG we detected an increase of syndecan-2 and decrease of syndecan-4, while syndecan -1 is not expressed in this cell line. Those variations lead us to the conclusion that SG affects the phenotype and the biological behavior of testicular tumor cells.

Ο αυξητικός παράγοντας πλειοτροπίνη (Pleiotrophin, PTN), γνωστός και ως HARP (Heparin-Affin Regulatory Peptide), έχει μοριακή μάζα 18 kDa και ανήκει σε μια διακριτή οικογένεια αυξητικών παραγόντων που δεσμεύονται στην ηπαρίνη και σχετίζονται με αγγειογένεση και καρκινική ανάπτυξη. Στην παρούσα εργασία, μελετήσαμε την επίδραση εξωγενώς χορηγούμενης PTN στην παραγωγή Η2Ο2 ενδοκυτταρικά, σε δύο τύπους ανθρώπινων κυττάρων, ενδοθηλιακά από φλέβα ομφάλιου λώρου (HUVEC) και καρκινικά κύτταρα προστάτη LNCaP. Η ΡΤΝ επάγει με δοσο-εξαρτώμενο και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο την παραγωγή του Η2Ο2 και στους δύο τύπους κυττάρων. Προεπώαση των κυττάρων με apocynin, που θεωρείται εκλεκτικός αναστολέας του ενζυμικού συστήματος της NADPH οξειδάσης, οδήγησε σε πλήρη αναστολή της επαγόμενης από ΡΤΝ αύξησης του ενδοκυτταρικού Η2Ο2 και κυτταρικής μετανάστευσης. Ο υποδοχέας RPTPβ/ζ, ο οποίος εμπλέκεται στην επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση των HUVEC, φαίνεται να εμπλέκεται και στην επαγόμενη από ΡΤΝ αύξηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων Η2Ο2, αφού μείωση της έκφρασης ή της ενεργότητας του RPTPβ/ζ στα κύτταρα HUVEC και LNCaP είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της επαγόμενης από την PTN ενδοκυτταρικής παραγωγής Η2Ο2. Η κινάση Src, η οποία αλληλεπιδρά και ενεργοποιείται από δέσμευση της ΡΤΝ στον RPTPβ/ζ, εμπλέκεται στην παραγωγή Η2Ο2 που επάγεται από την PΤΝ και στους δύο υπό μελέτη τύπους κυττάρων, αφού αναστολή της από τον εκλεκτικό αναστολέα ΡΡ1 είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της επαγόμενης από την PTN ενδοκυτταρικής παραγωγής Η2Ο2. Με σκοπό να αξιολογηθεί ο ρόλος της ενδογενούς ΡΤΝ στα ενδοκυτταρικά επίπεδα Η2Ο2 χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα LNCaP που είχαν μετασχηματιστεί σταθερά με την αντινοηματική αλληλουχία του γονιδίου της ΡΤΝ και εκφράζουν μειωμένα επίπεδα ΡΤΝ (AS-LNCaP) ή κύτταρα που είχαν μετασχηματιστεί σταθερά μόνο με το πλασμίδιο φορέα (PC-LNCaP). Επιπλέον, δημιουργήθηκαν και χαρακτηρίστηκαν σταθερά μετασχηματισμένα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα PC3, τα οποία εκφράζουν την αντινοηματική αλληλουχία του γονιδίου της ΡΤΝ και εκφράζουν μειωμένα επίπεδα ΡΤΝ (AS-PC3),τροποποιημένη μορφή της ΡΤΝ από την οποία λείπουν 26 αμινοξέα από το καρβοξυτελικό της άκρο (ΗΔ-PC3), ή μόνο το πλασμίδιο φορέα (PC-PC3). Παρατηρήθηκε ότι μειωμένα επίπεδα έκφρασης PTN ή υπερέκφραση της τροποποιημένης μορφής της χωρίς το καρβοξυτελικό άκρο σχετίζεται με μειωμένη μεταναστευτική ικανότητα και στους δύο τύπους κυττάρων. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία καταδεικνύεται ότι η πλειοτροπίνη μέσω του υποδοχέα της RPTPβ/ζ και της κινάσης src επάγει την παραγωγή Η2Ο2 σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά και καρκινικά κύτταρα προστάτη, γεγονός που φαίνεται να εμπλέκεται με επαγωγή της μετανάστευσης των κυττάρων. / Pleiotrophin (PTN), also called heparin affin regulatory peptide or heparin-binding growth associated molecule, is an 18 kDa secreted growth factor that displays high affinity for heparin. A growing body of evidence indicates that PTN is involved in cell proliferation, migration and differentiation. In the present work, we studied the effect of exogenous administration of PTN on the generation of hydrogen peroxide (HP) by two types of human cells, umbilical vein endothelial (HUVEC) and prostate cancer LNCaP cells. Human recombinant PTN significantly increased the production of HP in a concentration and time dependent manner. The PTN induced production of HP was blocked by the NADP(H) oxidase inhibitor apocynin, suggesting that superoxide is probably the initial ROS produced by PTN, rapidly dismutating to HP. In addition, apocynin completely abolished the stimulatory effect of PTN in migration of both HUVEC and LNCaP cells. Receptor protein-tyrosine phosphatase beta/zeta (RPTPβ/ζ), which has been implicated in PTN-induced migration, seems to be also involved in PTN-induced HP generation, since suppression of the receptor using genetic and pharmacological inhibitors or inhibition of src kinase activity abolished PTN induced HP levels. Finally, stably transfected human prostate cancer LNCaP and PC3 cells that express reduced amounts of PTN or over-express a truncated form of PTN missing 25 aminoacids from its carboxyl terminus, considered as dominant negative for tumor growth, have reduced amounts of intracellular HP and decreased migration capability, compared with the corresponding cells that are non transfected or are transfected only with the carrier plasmid. Collectively, these results suggest a role of HP in the PTN/RPTPβ/ζ signaling pathway that leads to cell migration in both human endothelial and prostate cancer cell lines.

The purpose of this work is to investigate the influence of possible patient movement and anatomy alteration on the quality of delivered prostate US based HDR-brachytherapy. The effect of patient movement and anatomy change (after the needle implantation and 3D image set acquisition) on catheter and organ dislocation and the consequences that this generated on the DVHs, conformity index and on radiobiological parameters. Materials and methods: This work is based on 3D image sets and treatment plans of 48 patients obtained right after the needle implantation (clinical plan is based on this 3D image set) and before and after the irradiation. In our institution the 3D-US based pre-planning, the transperineal implantation of needles using template and the intraoperative planning and irradiation is realized using the real-time dynamic planning system Oncentra Prostate. All pre-plans and all the inverse optimization of clinical plans were based on HIPO using the modulation restriction option. The patient body/OARs/catheters movement are generated from the clinical, pre- and post- irradiation plans and its influence on DVH-, COIN and radiobiological parameters of PTV and OARs are calculated and presented. Results: It is observed a slight decrease of treatment plan quality with increase of time between the clinical image set acquisition and the patient irradiation. Also, we show that the patient body movement/anatomy alteration and/or catheters dislocation results in decreased plan quality; change of values of the COIN, DVH- and radiobiological parameters. Conclusion: The measured mean shift of anatomy and needles (beams) is as low as 1.0mm that is lower by an order of magnitude to values known from external beam irradiation. For high modulated plans as those in HDR Brachytherapy such small shifts result in dosimetric changes which are in general lower than 5%. Our results demonstrate that quality assurance procedures have to be clinically implemented to guarantee anatomy and implant stability of the order of 1mm. This can only be realized without any manipulation of the implant and anatomy as done, for instance in the case of removing the US-probe before treatment delivery or moving the patient from one bed to another for the irradiation purposes / Σκοπός της εργασίας αυτής είναι να διερευνήσει την επιδραση που έχει η πιθανή μετακίνηση του ασθενούς και η αλλαγή της ανατομίας στην ποιότητα της Βραχυθεραπείας. Η μετακίνηση του ασθενούς, οι αλλαγές της ανατομίας ( μετά την εμφύτευση των βελονών και την συλλογή των τρισδιάστατων 3D εικόνων), η μετακίνηση των καθετήρων και των οργάνων επιφέρουν αλλαγές που παρουσιάζονται μέσα από τα ιστογράμματα δόσης - όγκου (DVH), δείκτη συμμορφίας (conformity index) και των ραδιοβιολογικών παραμέτρων. Υλικά και Μέθοδοι: Η μελέτη αυτή βασίζεται στην συλλογή τρισδιάστατων εικόνων υπερήχων (3D set) και στους σχεδιασμούς θεραπείας (treatment plans) από 48 ασθενείς που συλλέχθηκαν σε τρείς φάσεις: μετά την εμφύτευση των καθετήρων (κλινικός σχεδιασμός θεραπείας (clinical plan) βασίζεται σε αυτή την συλλογή 3D εικόνων), πριν την ακτινοβόληση και μετά την ακτινοβόληση.Στην κλινική μας ο προσχεδιασμός της θεραπείας (pre-planing) που βασίζεται στο τρισδιάστατο υπερηχογράφημα (3D-US), η διαπερινεϊκή εμφύτευση των καθετήρων με την βοήθεια του οδηγού template, ο διεγχειρητικός σχεδιασμός της θεραπείας (intraoperative planning) και η ακτινοβόληση πραγματοποιούνται με την χρήση του Real-time dynamic planning system Oncentra Prostate. Όλα τα pre-plans και όλα τα inverse optimization clinical plans βασίζονται στο HIPO χρησιμοποιώντας την επιλογή του modulation restriction. Οι μετακινήσεις του σώματος του ασθενούς/ των ευαίσθητων σε κίνδυνο οργάνων (OARs)/ και των καθετήρων αναπαράγονται από τα clinical, pre και post- irradiation plans. Κατόπιν υπολογίζεται και παρουσιάζεται η επίδρασή τους στο DVH, COIN και στις ραδιοβιολογικές παραμέτρους του όγκου στόχου σχεδιασμού (PTV) και των (OARs). Αποτελέσματα: Παρατηρείται μια ελαφρά μείωση της ποιότητας του σχεδιασμού θεραπείας με την αύξηση του χρόνου μεταξύ του κλινικού σχεδιασμού και της ακτινοβόλησης του ασθενούς. Επίσης παρουσιάζουμε ότι η μετακίνηση του ασθενούς/ η αλλαγή στην ανατομία ή/ και η μετακίνηση των καθετήρων έχει ως αποτέλεσμα στην μείωση της ποιότητας του σχεδιασμού. Έχουμε αλλαγή στις αλλαγές στις τιμές του COIN, του DVH και των ραδιοβιολογικών παραμέτρων. Συμπέρασματα: Η μέση τιμή των μετρούμενων μετακινήσεων της ανατομίας και των βελονών είναι ιδιαίτερα μικρή περίπου 1.0mm σε σύγκριση με τις γνωστές τιμές από την εξωτερική ακτινοθεραπεία. Για τους υψηλής διαμόρφωσης σχεδιασμούς, όπως αυτοί της HDR βραχυθεραπείας, μικρές μετακινήσεις οδηγούν σε δοσιμετρικές αλλαγές γενικά μικρότερες από 5%. Τα αποτελέσματα μας παρουσιάζουν ότι λαμβάνοντας υπόψη τις διαδικασίες εξασφάλισης ποιότητας επιτυγχάνεται η ακινητοποίηση του εμφυτεύματος της τάξης του 1mm. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί μόνο με ακινητοποίηση του εμφυτεύματος και της ανατομίας, για παράδειγμα στην περίπτωση όπου μετακινούμε την κεφαλή της συσκευής υπερήχων (US- probe) πριν την ακτινοβόληση ή μετακινώντας τον ασθενή από ένα κρεβάτι σε ένα άλλο για τις ανάγκες τις ακτινοβόλησης.

Τhe purpose of this study is to investigate and analyze the influence of the possible errors eventually occurring in a 3D-US based HDR Brachytherapy of prostate cancer on the quality of dose delivery. The influence of modulation restriction tool on the plan quality and sensitivity is also investigated. Materials: Twelve clinical implants for HDR Brachytherapy of prostate cancer have been selected out of the clinical routine. The range of the prostate volumes was 26-101 cm3. Due to the fact that the implanted needles are fixed on the template, the most probable error should be a systematic shift of the implanted catheters on the cranial-caudal direction caused by the movement of the patient relative to the template. The planning was done using HIPO which is implemented in the real time intraoperative planning system Oncentra Prostate (OcP). HIPO offers a unique modulation restriction option that limits the free modulation of dwell times. Firstly the reference plans, where no catheter shift has been simulated, the clinical with MR >0 and the theoretical with MR=0, for all 12 implants have been compared. Then for each of the 12 clinical implants, 10 systematic shifts of the implanted catheters in the range of [-5, +5] mm in step of 1mm were simulated. The influence of this systematic shift on DVH-, COIN, EI and radiobiological parameters of PTV and OARs is calculated and recorded. The analysis of the observed changes has been done firstly by addressing the quality of the implant. For this purpose the range of shift was estimated that the resulted 3D dose distributions keep fulfilling the clinical dosimetric protocol. Secondly, the focus was placed to the stability of the dose distribution. Here the range for the shift has been estimated which enables that the dosimetric, conformity and radiobiological parameters of the implant remain within ±5% or ±10% of the originally planned values. Results: The use of modulation restriction (MR>0) results in plans with more conformal dose distribution (COIN, EI) but slightly lower D90 and V100 , gEUD, EUD2,v and EUD2,s values. The quality analysis demonstrate that for the DVH based parameters values of prostate a maximal shift of ±1.0 mm can be tolerated, although in case of using the modulation restriction the sensitivity from the influence of the systematic shift is greater. Similar were the results for the DVH parameters for urethra, rectum and bladder. For the stability analysis in order to keep the dosimetric parameters within ±5% of the originally planned value for the prostate and OARs, a maximum shift of around ±0.5 mm can be tolerated and for the ±10% criterion this is -1.0/+0.5 mm. The same behavior applies for the radiobiological parameters. The analysis based on COIN considering only the target and also the OARs have shown a maximum shift range of ±1.5 mm. For the EI analysis this range is ±0.0 mm. For ±10% criterion this is ±2.5 mm and ±0.5 mm respectively. Conclusion: Our study has demonstrated that high modulated, high conformal Brachytherapy dose distributions for prostate HDR implants are sensitive to systematic catheter shift. The consequence of shift changes is not clear. We can generally speak about a required geometrical stability of the implant as high as ±1.0mm. Modulation restriction without improving this reduces significantly the total dwell time keeping the plan quality and increasing conformity (COIN, EI). / Ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι να ερευνήσουμε και να αναλύσουμε την επιρροή που μπορεί να έχουν τα πιθανά λάθη που συμβαίνουν στην Υψηλού Ρυθμού Δόσης (HDR) Βραχυθεραπεία του καρκίνου του προστάτη, η οποία βασίζεται σε τρισδιάστατες εικόνες (3D) υπερήχου, στη ποιότητα εναπόθεσης δόσης. Επίσης διερευνάται η επίδραση του Modulation Restriction (MR) στην ποιότητα και ευαισθησία του πλάνου θεραπείας. Υλικά και Μέθοδοι: Επιλέχθηκαν 12 κλινικά εμφυτεύματα για την HDR Βραχυθεραπεία του καρκίνου του προστάτη από την κλινική ρουτίνα μας. Το εύρος του όγκου του προστάτη είναι 26-101 cm3. Επειδή οι βελόνες που εμφυτεύθηκαν στον προστάτη είναι σταθεροποιημένες πάνω στο template, το πιο πιθανό λάθος που μπορεί να συμβεί είναι η συστηματική μετατόπιση των εμφυτευμένων καθετήρων σε cranial – caudal (κρανιακή – ουραία ) διεύθυνση η οποία έχει προκληθεί από την κίνηση του ασθενούς σε σχέση με το template. Το πλάνο θεραπείας έγινε χρησιμοποιώντας την επιλογή HIPO του προγράμματος real time intraoperative planning system Oncentra Prostate (OcP). Το HIPO προσφέρει την δυνατότητα επιλογής του Modulation Restriction (MR) το οποίο περιορίζει την ελεύθερη διαμόρφωση των χρόνων παραμονής της πηγής στους καθετήρες. Στα αρχικά μας πλάνα θεραπείας (reference plans) δεν έχει γίνει προσομοίωση μετακίνησης του καθετήρα. Συγκρίνουμε τα κλινικά μας πλάνα (MR>0) και τα θεωρητικά μας (MR=0) και για τα 12 εμφυτεύματα. Στην συνέχεια για κάθε ένα από τα 12 εμφυτεύματα γίνεται η προσομοίωση 10 συστηματικών μετακινήσεων των εμφυτευμένων καθετήρων με εύρος [-5,+5]mm και με βήμα 1mm. Υπολογίζεται και καταγράφεται η επίδραση της συστηματικής μετακίνησης στα ιστογράμματα δόσης - όγκου (DVH), δείκτη συμμορφίας (conformity index- COIN), External Index (EI) και στις ραδιοβιολογικές παραμέτρους για τον όγκο στόχου (PTV) και των ευαίσθητων σε κίνδυνο οργάνων (OARs). Αρχικά η ανάλυση των παρατηρούμενων αλλαγών έχει γίνει σύμφωνα με την ποιότητα του εμφυτεύματος (quality analysis). Για αυτό τον λόγο το εύρος της μετακίνησης έχει υπολογιστεί έτσι ώστε τα αποτελέσματα από τις 3D κατανομές δόσεις να πληρούν το κλινικό δοσιμετρικό μας πρωτόκολλο. Στην συνέχεια εστιάσαμε στην σταθερότητα της κατανομής της δόσης (stability analysis). Σε αυτή την περίπτωση το εύρος μετακίνησης των καθετήρων έχει υπολογιστεί έτσι ώστε οι τιμές των DVH, COIN και ραδιοβιολογικών παραμέτρων των εμφυτευμάτων να παραμένουν μέσα στο ±5% ή στο ±10% των αρχικών πλάνων (reference). Αποτελέσματα: Χρησιμοποιώντας την επιλογή του Modulation Restriction (MR>0) προκύπτουν πλάνα με πιο ομοιόμορφη κατανομή της δόσης (COIN, EI) αλλά με ελαφρώς μικρότερες τιμές των D90, V100, gEUD, EUD2,v και EUD2,s. H “quality analysis” έδειξε ότι για τις δοσιμετρικές παραμέτρους του προστάτη η μέγιστη μετατόπιση που μπορούμε να έχουμε είναι ±1mm. Χρησιμοποιώντας την επιλογή του MR η μετατόπιση αυτή γίνεται ακόμα πιο ευαίσθητη. Παρόμοια ήταν τα αποτελέσματα μας για τις δοσιμετρικές παραμέτρους των OARs (ουρήθρα, κύστη και ορθό). Σύμφωνα με την “stability analysis” η μέγιστη μετατόπιση που μας επιτρέπεται έτσι ώστε να διατηρήσουμε τις τιμές των δοσιμετρικών παραμέτρων του προστάτη και των OARs μέσα στο ±5% της τιμής του αρχικού μας πλάνου είναι ±0.5mm ενώ για το ±10% το όριο αυτό είναι -1.0/+0.5 mm. Την ίδια συμπεριφορά παρατηρούμε και για τις ραδιοβιολογικές παραμέτρους. Η ανάλυση που βασίζεται στο COIN, συμπεριλαμβάνοντας αρχικά μόνο τον στόχο μας και στην συνέχεια και τα OARs έδειξε ότι η μέγιστη μετακίνηση μας έχει εύρος ±1.5mm . Για την ανάλυση που βασίζεται στο EI αυτό το εύρος είναι ±0.0 mm . Για το ±10% τα όρια είναι ±2.5mm και 0.5mm αντίστοιχα. Συμπεράσματα: Η μελέτη μας έδειξε ότι οι υψηλά διαμορφωμένες και οι υψηλά ομοιόμορφες κατανομές δόσης των εμφυτευμάτων της HDR βραχυθεραπείας του προστάτη είναι ευαίσθητες στις συστηματικές μετακινήσεις των καθετήρων. Οι συνέπειες από τις αλλαγές αυτών των μετακινήσεων δεν είναι ξεκάθαρες. Μπορούμε γενικά να μιλήσουμε για μια απαιτούμενη γεωμετρική σταθερότητα του εμφυτεύματος τόσο υψηλή όσο ±1.0mm. Η δυνατότητα επιλογής του MR χωρίς να βελτιώνει αυτό, μειώνει σημαντικά τον ολικό χρόνο παραμονής της πηγής στους καθετήρες διατηρώντας την ποιότητα του πλάνου θεραπείας και αυξάνοντας την ομοιομορφία στην κατανομή της δόσης (COIN, EI).