Η νεοπλασία των όρχεων αναπτύσσεται σε άνδρες ηλικίας 15-35 ετών και ενώ είναι μια σπάνια μορφή νεοπλασίας (1-2% όλων των νεοπλασμάτων του άνδρα) αποτελεί τον πιο συχνό όγκο στις ηλικίες 20-40 ετών και είναι η τρίτη κατά σειρά αιτία θανάτου στις ηλικίες αυτές. Περίπου το 95% των όγκων όρχεων προέρχεται από τα βλαστικά κύτταρα. Οι πρωτεογλυκάνες είναι βιοδραστικά μόρια και η έκφραση τους τροποποιείται σημαντικά στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Μελέτες του εργαστηρίου μας έδειξαν ότι η πρωτεογλυκάνη σεργλυκίνη (SG) υπερεκφράζεται σε πολλές κακοήθειες όπως στον καρκίνο του μαστού, του πνεύμονα και σε γλοιώματα, ενώ σε πιο επιθετικές μορφές καρκινικών κυττάρων η SG υπερεκφράζεται και εκκρίνεται σε υψηλά ποσά στο μέσο καλλιέργειας. Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία μελετήθηκε η έκφραση της σεργλυκίνης σε όγκους όρχεων. Δείγματα ασθενών μελετήθηκαν με ανοσοαποτύπωση και βρέθηκε ότι η SG εκφράζεται τόσο στον φυσιολογικό ορχικό ιστό όσο και στους όγκους όρχεων όπου εμφανίζει πιο έντονη έκφραση. Ανοσοϊστοχημική μελέτη έδειξε ότι η SG εκφράζεται από τα φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα ενώ η έκφραση της αυξάνεται στους όγκους όρχεων. Η έκφραση της SG μελετήθηκε σε τρεις σειρές όγκων όρχεων (JKT-1, σεμίνωμα; NT2/D1, εμβρυϊκό καρκίνωμα; NCCIT, τεράτοκαρκίνωμα) και βρέθηκε ότι εκφράζεται και στις τρεις κυτταρικές σειρές, με μεγαλύτερη έκφραση στην πιο επιθετική σειρά, NT2/D1. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε υπερέκφραση της SG στις κυτταρικές σειρές όγκων όρχεων με διαμόλυνση των κυττάρων με πλασμίδιο που φέρει το γονίδιο της SG. Ακολούθως μελετήθηκε ο ρόλος της SG στην έκφραση βιοδραστικών μορίων, όπως είναι τα ένζυμα βιοσύνθεσης και καταβολισμού καθώς και ο υποδοχέας CD44 του ΗΑ και οι πρωτεογλυκάνες της κυτταρικής μεμβράνης syndecans. Ο CD44 είναι μια γλυκοπρωτεΐνη και αποτελεί τον κύριο υποδοχέα του ΗA. Οι συνθάσες του HA είναι τα ένζυμα που βιοσυνθέτουν το ΗΑ και διακρίνονται σε τρεις ισομορφές τις HAS- 1, HAS-2, HAS-3α και HAS-3β. Μελέτες υποστηρίζουν ότι ο μεμβρανικός υποδοχέας CD44 και το ΗΑ υπερεκφράζονται σε πολλές κακοήθειες και η αλληλεπίδρασή τους διεγείρει σειρά λειτουργιών στα κύτταρα του όγκου που συντελούν στην πρόοδο της νόσου. Η κύρια ισομορφή CD44s εκφράζεται ευρέως στους ιστούς και υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου όπου και συνυπάρχει με το ΗΑ. Η σηματοδοτική δράση του ΗΑ στα καρκινικά κύτταρα μέσω του υποδοχέα CD44 έχει προταθεί ως βασικό βήμα για την ανάπτυξη και πρόοδο της νόσου. Επίσης μελέτες έχουν δείξει πως υπάρχει συσχέτιση μεταξύ των HYALs και του διεισδυτικού και μεταστατικού φαινότυπου των όγκων. Αυξημένα επίπεδα τους έχουν βρεθεί σε όγκους της ουροδόχου κύστεως, του προστάτη, κεφαλής και τραχήλου, μαστού αλλά σε μεταστατικούς όγκους. Η ισομορφή CD44s εκφράζεται και στις τρεις κυτταρικές σειρές, αλλά η υπερέκφραση της SG μειώνει την έκφραση του CD44s στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινωμάτος, ενώ δεν επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό την έκφραση του στο σεμίνωμα και το εμβρυϊκό καρκίνωμα. Στην κυτταρική σειρά σεμινώματος, έχει βρεθεί, ότι εκφράζεται μόνο η ισομορφή HAS-3α, ενώ στις κυτταρικές σειρές του εμβρυικού καρκινώματος και του τερατοκαρκινώματος εμφανίζεται ισχυρή έκφραση της ισομορφής HAS-3α και μικρή έκφραση της HAS-2. Μετά την υπερέκφραση της SG παρατηρείται αύξηση της HAS-3a στην κυτταρική σειρά του σεμινώματος. Στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινώματος παρατηρείται αύξηση της HAS-2, ενώ στην κυτταρική σειρά του εμβρυϊκού καρκινώματος παρατηρείται αύξηση και των δυο συνθασών που μελετήθηκαν. Μελετήθηκε, επιπλέον, η έκφραση των HYAL-1, -2,-3 και PH-20 στο σεμίνωμα και το τερατοκαρκίνωμα, μετά την υπερέκφραση της SG στις σειρές αυτές. Στην κυτταρική σειρά του σεμινώματος παρατηρήθηκε αύξηση στις HYAL-2 και HYAL-3, μείωση της PH-20, ενώ δεν παρατηρήθηκε μεταβολή της HYAL-1. Αντίθετα, στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινώματος παρατηρήθηκε αύξηση και στα τέσσερα μόρια των HYALs, με τη μεγαλύτερη αύξηση να παρουσιάζεται στην HYAL-2. Οι syndecans έχoυν σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, την προσκόλληση, την μετανάστευση, την διαφοροποίηση και την αγγειογένεση. Η μελέτη στις κυτταρικές σειρές των όγκων των όρχεων έδειξε ότι οι syndecan-1 και 4 εκφράζονται στα κύτταρα του σεμινώματος και παρουσιάζουν αύξηση έπειτα από την υπερέκφραση της σεργλυκίνης, ενώ η syndecan-2 δεν εκφράζεται. Στην κυτταρική σειρά του τερατοκαρκινώματος έπειτα από διαμόλυνση με το γονίδιο της σεργλυκίνης παρατηρήθηκε αύξηση της syndecan-2 και μείωση της syndecan-4, ενώ η syndecan-1 δεν εκφράζεται σε αυτή την κυτταρική σειρά. Οι μεταβολές αυτές μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η SG, επηρεάζει τον φαινότυπο και την συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων. / Testicular tumors are present in men between the age of 15-35 and while it is a rare type of tumor (it adds up to 1-2% of the tumors that affect men) it is the most frequent tumor at the aged between 20-40 and is the third leading cause of death in this age group range. Approximately 95% of testicular tumors originate from germ cells. The PGs are bioactive molecules and their expression is significantly modified at the microenvironment of the tumor. Our recent data showed that proteglycan serglysin (SG) is over expressed in many malignancies such as breast cancer, lung cancer and in gliomas, while in more aggressive forms of cancer cells SG is over expressed and secreted in the culture medium. In this thesis we studied the role of SG in testicular tumors. Patient samples were studied by immunoblotting and the results showed that SG is expressed both in normal testicular tissue and testicular tumor where there is greater expression. Ιmmunohistochemical study showed that SG is expressed by normal germ cells while its expression is increasing in testicular tumor. The expression of SG was studied in three cell lines of testicular cancer (JKT-1, seminoma; NT2/D1, embryonic carcinoma; NCCT, teratocarcinoma) and showed that it is expressed in all three cell lines, with higher expression in the most aggressive line, NT2/D1. Then, we achieved over expression of the testicular tumor cell lines with transfection of the cells with the plasmid which contains the gene of SG. Subsequently, we examine the role of SG in the expression of some biosynthetic and catabolic enzymes as well as HA receptor CD44 and the cell-surface PG, syndecans. CD44 is a glycoprotein and represents the major receptor for HA. The synthases of HA are the enzymes that produce HA and exist in three distinct isoforms HAS-1, HAS-2, HAS-3a, and HAS-3b. Numerous studies supports that the membrane receptor CD44 and HA are overexpressed in several malignancies and their interaction trigger various cellular events in tumour cells, which leds to the disease progression. The major isoform of CD44 is the CD44s, which is expressed widely in tissues, and is over expressed in several types of tumors, coexisting with HA. The signaling effect of HA in tumor cells through CD44 has been stated to be a crucial step in the development and progression of the disease. It was shown that there is association between HYALs and the invasive and metastatic phenotype of tumors. High levels of HYALs were found at head and neck tumors, breast cancer and metastatic tumors. The isoform CD44s is expressed in all 3 cell lines, but the over expression of SG reduces the expression of CD44 in the teratocarcinoma cell line, while it does not affect to a large extent its expression in seminoma and embryonic carcinoma. In the seminoma cell line, it has been found that only HAS-3a isoform is expressed, while in the embryonic carcinoma and teratocarcinoma cell lines showed high expression of isoform HAS-3a and low expression of HAS-2. After the overexpression of SG we detect increased levels of HAS-3a in seminoma and HAS-2 in teratocarcinoma, while at embryonic carcinoma both synthases were increased. SG over-expression in the teratocarcinoma cell line induced the expression of HAS-2 while in the embryonic carcinoma cell line triggered the expression of both synthases HAS-3a and HAS-2. The expression of HYAL-1, -2, -3 and PH-20 in the seminoma and the teratocarcinoma were also studied after the over-expression of SG in these lines. In the cell line of seminoma we noticed an increase of HYAL-2 and HYAL-3, a decrease of PH-20, while there was no variation in HYAL-1. Unlike this, in the teratocarcinoma cell line we noticed increase in all HYALs, with the greater increase shown in HYAL-2. Syndecans have an important role in the growth of tumor cells, the attachment, migration, differentiation and angiogenesis. The study of testicular tumor cell lines showed that syndecan-1 and syndecan-4 are expressed in the seminoma cells and showed to be increased after the over-expression of SG, while syndecan-2 is not expressed. In the teratocarcinoma cell line after transfection with the gene of SG we detected an increase of syndecan-2 and decrease of syndecan-4, while syndecan -1 is not expressed in this cell line. Those variations lead us to the conclusion that SG affects the phenotype and the biological behavior of testicular tumor cells.

Orientador: Maria Aparecida Custodio Domingues / Resumo: As neoplasias testiculares constituem aproximadamente 1% dos cânceres masculinos. Dentre eles, os tumores que têm origem nas células germinativas (TTCG) são os mais frequentes. Por sua natureza, esses tumores têm padrão morfológico variado, sendo distribuídos em dois subgrupos: os seminomas e os não-seminomas. Esses últimos, por sua vez, são classificados em carcinomas embrionários, tumores do seio endodérmico, coriocarcinomas, teratomas e tumores mistos de células germinativas. Há consenso na literatura de que a invasão vascular verificada histologicamente no tumor primário é o melhor indicador preditivo de progressão da doença e recidiva. Estudos recentes demonstram o papel dos fatores de crescimento e seus receptores para avaliação prognóstica dos TTCG, no que o uso da imuno-histoquímica é fundamental. O presente estudo procurou avaliar pela técnica imuno-histoquímica à ocorrência da expressão do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), do Her2 e do c-Kit em uma série de TTCG não-seminomas primários de testículo. Além disso, explorou a possível relação entre a expressão desses marcadores com a evolução dos pacientes após terapêutica convencional. A série foi constituída de amostras parafinadas existentes no Laboratório de Anatomia Patológica e Citologia do Hospital Amaral Carvalho de Jaú, totalizando 103 pacientes que receberam o diagnóstico de tumor testicular de células germinativas não-seminomas (TTCGNS) no período 1996-2010. Dentre os 103 casos, predominaram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Testicular neoplasms constitute approximately 1% of male cancers. Among these, germ cell tumors (TGCT) are the most prevalent. These tumors show varied morphological patterns and are distributed into two subgroups: seminomas and non-seminomas. The latter, in turn, are classified as embryonal carcinomas, endodermal sinus tumors, choriocarcinomas, teratomas and mixed germ cell tumors. The consensus in the literature is that histological verification of vascular invasion (VI) in the primary tumor is the best predictor of disease progression and recurrence. However, recent studies have highlighted the role of growth factors and their receptors for prognostic evaluation of TGCT, in which the use of immunohistochemistry is fundamental. This study sought to evaluate the occurrence of epidermal growth factor receptor (EGFR), Her2 and c-Kit in a series of primary non-seminoma TGCTs. In addition, possible relationships between the expression of these markers and patient evolution following conventional therapy was investigated. The series consisted of paraffin-embedded samples from the Laboratory of Anatomical Pathology and Cytology of Amaral Carvalho Hospital in Jaú, SP, Brazil, of 103 patients diagnosed with testicular non-seminoma germ cell tumor (NSGCT) over a 15-year period (1996-2010). Among the 103 cases, testicular NSGCT predominated (57.3%), and among these, staining for EGFR and c-Kit predominated. EGFR was expressed when the choriocarcinoma component was predominant, and c-K... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by FRANCISCO CARLOS QUEVEDO null (fcqjau@gmail.com) on 2017-09-15T16:19:40Z No. of bitstreams: 1 _TTCG FINAL 260715 FCQ [2].pdf: 2024513 bytes, checksum: 9e2b5af27bf3e7a02eb1625af9c3c0fc (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-09-15T16:27:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 quevedo_fc_dr_bot.pdf: 2024513 bytes, checksum: 9e2b5af27bf3e7a02eb1625af9c3c0fc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-15T16:27:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 quevedo_fc_dr_bot.pdf: 2024513 bytes, checksum: 9e2b5af27bf3e7a02eb1625af9c3c0fc (MD5) Previous issue date: 2017-08-25 / As neoplasias testiculares constituem aproximadamente 1% dos cânceres masculinos. Dentre eles, os tumores que têm origem nas células germinativas (TTCG) são os mais frequentes. Por sua natureza, esses tumores têm padrão morfológico variado, sendo distribuídos em dois subgrupos: os seminomas e os não-seminomas. Esses últimos, por sua vez, são classificados em carcinomas embrionários, tumores do seio endodérmico, coriocarcinomas, teratomas e tumores mistos de células germinativas. Há consenso na literatura de que a invasão vascular verificada histologicamente no tumor primário é o melhor indicador preditivo de progressão da doença e recidiva. Estudos recentes demonstram o papel dos fatores de crescimento e seus receptores para avaliação prognóstica dos TTCG, no que o uso da imuno-histoquímica é fundamental. O presente estudo procurou avaliar pela técnica imuno-histoquímica à ocorrência da expressão do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), do Her2 e do c-Kit em uma série de TTCG não-seminomas primários de testículo. Além disso, explorou a possível relação entre a expressão desses marcadores com a evolução dos pacientes após terapêutica convencional. A série foi constituída de amostras parafinadas existentes no Laboratório de Anatomia Patológica e Citologia do Hospital Amaral Carvalho de Jaú, totalizando 103 pacientes que receberam o diagnóstico de tumor testicular de células germinativas não-seminomas (TTCGNS) no período 1996-2010. Dentre os 103 casos, predominaram os TTCGMNS (57,3%). Nestes, observou-se o predomínio de marcação para EGFR e c-Kit. O EGFR foi expresso quando o componente coriocarcinoma era predominante e o c-Kit no componente epitelial do teratoma. A hipótese do estudo, que os casos positivos para os marcadores analisados estariam correlacionados com sobrevida menor, não foi confirmada pela analise estatística de Kaplan-Meier; seria necessário um maior número de casos para se chegar a uma conclusão quanto à sobrevida. Superexpressão, amplificação gênica e mutações ativadoras são frequentes em tumores testiculares germinativos; deste modo, o uso da técnica de Hibridização Fluorescente in situ (FISH) foi utilizada para avaliação dos eventos gênicos relativos a imunoexpressão proteica, observada pelos resultados encontrados no estudo imuno-histoquímico. Somente um caso, classificado como TTCGM, apresentava amplificação para gene EGFR. Este caso apresentou bom prognóstico. Considerou-se que, a ausência de amplificação observada na maioria dos casos, deve-se a qualidade inadequada do material parafinado e estocado. Conclui-se que, na série estudada, os TTCGNS expressam os marcadores EGFR, Her2 e c-Kit, a depender do subtipo histológico; entretanto, estas proteínas não tiveram impacto prognostico. A amplificação gênica para o EGFR pode ocorrer de forma isolada, porem devido a condições técnicas restritivas, não foi possível observa-la nos demais casos positivos para EGFR pela técnica de imuno-histoquímico. / Testicular neoplasms constitute approximately 1% of male cancers. Among these, germ cell tumors (TGCT) are the most prevalent. These tumors show varied morphological patterns and are distributed into two subgroups: seminomas and non-seminomas. The latter, in turn, are classified as embryonal carcinomas, endodermal sinus tumors, choriocarcinomas, teratomas and mixed germ cell tumors. The consensus in the literature is that histological verification of vascular invasion (VI) in the primary tumor is the best predictor of disease progression and recurrence. However, recent studies have highlighted the role of growth factors and their receptors for prognostic evaluation of TGCT, in which the use of immunohistochemistry is fundamental. This study sought to evaluate the occurrence of epidermal growth factor receptor (EGFR), Her2 and c-Kit in a series of primary non-seminoma TGCTs. In addition, possible relationships between the expression of these markers and patient evolution following conventional therapy was investigated. The series consisted of paraffin-embedded samples from the Laboratory of Anatomical Pathology and Cytology of Amaral Carvalho Hospital in Jaú, SP, Brazil, of 103 patients diagnosed with testicular non-seminoma germ cell tumor (NSGCT) over a 15-year period (1996-2010). Among the 103 cases, testicular NSGCT predominated (57.3%), and among these, staining for EGFR and c-Kit predominated. EGFR was expressed when the choriocarcinoma component was predominant, and c-Kit when the epithelial component of the teratoma was predominant. The initial hypothesis that positive cases for any marker would be correlated to lower survival was not confirmed by Kaplan-Meier survival probability studies. A larger number of cases is required to reach any conclusions concerning survival. Gene overexpression and amplification and activating mutations are common in testicular germinal tumors, thus fluorescent in situ hybridization (FISH) was used to validate the genic events results obtained in the immunohistochemical study. Only one case, classified as mixed TGCT, showed EGFR gene amplification, and this case presented good prognosis. The lack of amplification observed in most cases was due to the inadequate quality of the stored, paraffinembedded materials. In conclusion, in the series studied, testicular NSGCT expressed EGFR, Her2 and c-Kit markers depending on the histological subtype; however, these proteins had no prognostic impact. Gene amplification for EGFR may occur in isolation, but due to the limited technical conditions, it was not observed in the other cases positive for EGFR using immunohistochemistry.

Οι κακοήθεις όγκοι των όρχεων εμφανίζονται κυρίως σε άνδρες ηλικίας 15-35 ετών και παρουσιάζουν αυξητική τάση τα τελευταία 40 χρόνια. Περίπου 95% των νεοπλασιών προέρχονται από τα βλαστικά κύτταρα και οι περισσότεροι από τους όγκους των όρχεων είναι επιθετικοί και ικανοί για γρήγορη και ευρεία διασπορά της νόσου. Η πρόγνωση της κλινικής εξέλιξης της νόσου αποτελεί μια πρόκληση και ο ρόλος διαφόρων βιολογικών δεικτών έχει μελετηθεί προσπαθώντας να διευκρινιστούν τα ακριβή αίτια και οι παθογενετικοί μηχανισμοί της ανάπτυξης των όγκων στους όρχεις. Τόσο τα κύτταρα του στρώματος όσο και τα νεοπλασματικά κύτταρα εμπλέκονται στην αναδιοργάνωση του ECM έτσι ώστε να διευκολυνθεί ο πολλαπλασιασμός, η μετακίνηση και διήθηση των νεοπλασματικών κυττάρων. Οι PGs είναι βιοδραστικά μόρια και η έκφρασή τους τροποποιείται σημαντικά στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Μεταβολές της έκφρασης των PGs από τα κύτταρα του όγκου και τα στρωματικά κύτταρα επηρεάζουν τα σηματοδοτικά μονοπάτια των νεοπλασματικών κυττάρων, την ανάπτυξη και επιβίωσή τους, την προσκόλληση και μετανάστευσή τους καθώς και τη δημιουργία νέων αγγείων στον όγκο. Σκοπός της διδακτορικής διατριβής ήταν να μελετηθεί η παρουσία των εξωκυττάριων PGs, versican και decorin καθώς και των μεμβρανικών PGs, syndecan-4 και CD44 (standard isoform) και να διερευνηθεί η πιθανή συσχέτιση της έκφρασής τους με τη βιολογική συμπεριφορά των όγκων όρχεων που προέρχονται από βλαστικά κύτταρα. Αρχικώς, η έκφραση και ο εντοπισμός τους μελετήθηκε με ανοσοϊστοχημεία σε αρχειακό υλικό 71 ασθενών με σεμινωματώδεις και μη-σεμινωματώδεις όγκους και τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με ανοσοεντοπισμό ή με μελέτη της γονιδιακής έκφρασης μέσω RT-PCR σε περιορισμένο αριθμό δειγμάτων. Στη συνέχεια, η παρουσία των PGs συσχετίστηκε με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών και τη νεοαγγειογένεση που παρατηρείται στους όγκους. Διαπιστώθηκε ότι οι versican και decorin εκφράζονται σε μικρά ποσά στο διάμεσο συνδετικό ιστό, στα μεσολοβιώδη διαφράγματα που περιβάλλουν τα σπερματικά σωληνάρια των όρχεων και παρατηρείται σημαντική αύξηση των ποσών και των δύο PGs κυρίως στο στρώμα που περιβάλλει τόσο τους σεμινωματώδεις όσο και τους μη-σεμινωματώδεις όγκους. Οι μη-σεμινωματώδεις όγκοι χαρακτηρίζονται από μεγαλύτερη αύξηση στην έκφραση της versican σε σχέση με τους σεμινωματώδεις. Η decorin παρουσιάζει σχεδόν παρόμοια επίπεδα έκφρασης και στις δύο κατηγορίες των όγκων όρχεων. Η αυξημένη εναπόθεση της decorin στο στρώμα των όγκων δεν συσχετίζεται στατιστικά με καμία από τις κλινικοπαθολογικές μεταβλητές που μελετήθηκαν. Αντιθέτως, η αυξημένη εναπόθεση της versican τόσο στα σεμινώματα όσο και στους μη-σεμινωματώδεις όγκους συσχετίζεται στατιστικά με την παρουσία αγγειακών και λεμφαγγειακών διηθήσεων, το μέγεθος του πρωτοπαθούς όγκου (στατιστικά σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μόνο στους μη-σεμινωματώδεις όγκους), την παρουσία μεταστάσεων στους λεμφαδένες, την ύπαρξη απομακρυσμένων μεταστάσεων (συσχετίστηκε μόνο στους μη-σεμινωματώδεις όγκους) και το στάδιο της νόσου. Επιπλέον, στην παρούσα μελέτη βρέθηκε ότι η συσσώρευση της versican στο στρώμα των όγκων όρχεων σχετίζεται με την παρουσία μεγαλύτερου αριθμού νέων αγγείων. Η μελέτη της διαμεμβρανικής PG syndecan-4 ανέδειξε ότι εκφράζεται από τα τα σπερματικά κύτταρα των σπερματικών σωληναρίων, κυρίως πλησίον του βασικού υμένα, στους φυσιολογικούς ιστούς των όρχεων. Η syndecan-4 εντοπίζεται τόσο στο κυτταρόπλασμα όσο και στη μεμβράνη των φυσιολογικών κυττάρων. Αντιθέτως, δεν διαπιστώθηκε εναπόθεση της syndecan-4 στο διάμεσο συνδετικό ιστό, στα μεσολοβιώδη διαφράγματα που περιβάλλουν τα σπερματικά σωληνάρια των όρχεων. Τόσο οι σεμινωματώδεις όσο και οι μη σεμινωματώδεις όγκοι όρχεων εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του γονιδίου της syndecan-4. Οι σεμινωματώδεις όγκοι χαρακτηρίζονται από σημαντικά πιο αυξημένη έκφραση του γονιδίου της syndecan-4 σε σχέση με τους μη-σεμινωματώδεις όγκους. Η υψηλή έκφραση της syndecan-4 στα κύτταρα του όγκου στα σεμινώματα επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση των ιστών, ενώ η έκφρασή της παρουσίαζε διακυμάνσεις στα κύτταρα των μη-σεμινωματωδών όγκων. Στους μη-σεμινωματώδεις όγκους αναγνωρίστηκαν περιπτώσεις ασθενών με ασθενέστερη έκφραση της syndecan-4 στα κύτταρα του όγκου. Η ελαττωμένη παρουσία της syndecan-4 στα κύτταρα των μη-σεμινωματωδών όγκων συσχετίστηκε με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων, αγγειακής και λεμφαγγειακής διήθησης και με το στάδιο της νόσου στους ασθενείς. Επιπλέον, η syndecan-4 εντοπίστηκε στο ινώδες στρώμα και στα στρωματικά κύτταρα στους σεμινωματώδεις και μη-σεμινωματώδεις όγκους. Η παρουσία της syndecan-4 στο στρώμα συσχετίστηκε με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων, αγγειακών και λεμφαγγειακών διηθήσεων και το στάδιο της νόσου μόνο στα σεμινώματα. Η έκφραση της syndecan-4, στο στρώμα κακοήθων όγκων, αναδεικνύεται για πρώτη φορά σε αυτή τη μελέτη και συσχετίζεται με τον αυξημένο αριθμό αγγείων στο στρώμα των όγκων όρχεων. Η μελέτη του υποδοχέα CD44 στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας το πολυκλωνικό αντίσωμα Η-300 που αναγνωρίζει την κύρια ισομορφή CD44s. Διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη του CD44 δεν εκφράζεται από τα φυσιολογικά κύτταρα των σπερματικών σωληναρίων των όρχεων. Επίσης, δεν παρατηρήθηκε χρώση για τον CD44 στο διάμεσο συνδετικό ιστό, στα μεσολοβιώδη διαφράγματα που περιβάλλουν τα σπερματικά σωληνάρια των όρχεων. Ο CD44 βρέθηκε ότι εκφράζεται στα κύτταρα του όγκου στο 27% των ασθενών με σεμινώματα και στο 36.8% των ασθενών με μη-σεμινωματώδεις όγκους. Επίσης, βρέθηκε ότι ο CD44 εκφράζεται στο στρώμα του όγκου στο 48.5% των ασθενών με σεμινώματα και στο 26.3% των ασθενών με μη-σεμινωματώδεις όγκους. Η έκφραση του CD44 στα κύτταρα του όγκου και στο στρώμα συσχετίστηκε με το μέγεθος του όγκου, την παρουσία μεταστάσεων σε λεμφαδένες, τη διήθηση αγγείων και λεμφαγγείων και το προχωρημένο στάδιο της νόσου μόνο στους ασθενείς με σεμινώματα. Δεν παρατηρήθηκε καμία συσχέτιση της παρουσίας του CD44 στους μη-σεμινωματώδεις όγκους με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών. Η παρουσία του CD44 στα κύτταρα και τον ECM του στρώματος των όγκων συσχετίστηκε με αυξημένο αριθμό αγγείων, εύρημα που προτείνει ότι ο υποδοχέας εμπλέκεται στη νεοαγγειογένεση. Τα ευρήματα της διδακτορικής διατριβής προτείνουν ότι οι PGs versican, syndecan-4 και CD44 εμπλέκονται στην εξέλιξη των όγκων όρχεων και μπορούν να αποτελέσουν προγνωστικούς δείκτες. Για να τεκμηριωθεί η κλινική χρησιμότητα της έκφρασής τους σε όγκους όρχεων που προέρχονται από βλαστικά κύτταρα απαιτείται περαιτέρω έρευνα σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων. / Testicular tumors present in men aged 15-35 years with increasing incidence in the last 40 years. Approximately 95% of these tumors arise from germ cells. Although most of these tumors are aggressive with rapid growth and spread, the chemotherapy is very efficient and the mortality has been markedly reduced. Prognosis is a challenging issue and the role of various biological markers has been investigated in order to elucidate the mechanisms of the development and progression of the disease. Tumor and stromal cells are implicated in the remodeling of the ECM that facilitates the growth, motility and invasion of tumor cells. PGs are bioactive molecules and their expression is markedly affected in the microenvironment of the tumor. Alterations in the expression of PGs by tumor and stromal cells modulate various signaling pathways in tumor cells affecting tumor cell growth and survival, adhesion and migration as well as neoangiogenesis. The aim of the present thesis was to study the distribution of matrix secreted PGs, versican and decorin as well as that of cell surface associated PGs, syndecan-4 and CD44 and to investigate the possible association of their expression with the biological behavior in testicular germ cell tumors. Their expression and localization was studied performing immunohistochemistry in archive material in 71 patients with seminomatous and non-seminomatous germ cell tumors and the results were confirmed by western blots and study of the gene expression in limited number of tissue from patients. The presence of PGs was correlated with the clinicopathological variables of the patients and with the number of microvessels present in the tissues. The study revealed that versican and decorin present in small amounts in the interstitial connective tissue in the interlobular septa surrounding the seminiferous tubules and are markedly increased in the peritumoral and sometimes in intratumoral stroma in seminomas and non seminomatous tumors. Non seminomatous tumors exhibited increased staining for versican as compared to seminomas, whereas decorin is almost equally distributed in both types of testicular germ cell tumors. The increased accumulation of decorin in the tumor stroma was not correlated with any clinicopathological variable of the patients. In contrast, the accumulation of versican in both seminomas and non-seminomatous tumors was correlated with the presence of lymphatic and vascular invasion, the size of the tumor (only in non-seminomatous tumors), the presence of metastases in lymph nodes, the presence of distant metastases (evaluated only in non-seminomas) and the stage of the disease. Furthermore, the accumulation of versican in tumor stroma of testicular germ cell tumors was correlated with the increased number of microvessels in the tissues. The study of transmembrane PG syndecan-4 revealed that it was expressed by germ cells in the seminiferous tubules in normal tissue. Syndecan-4 presents both in the cytoplasm and the cell membrane of the cells. The interstitial connective tissue in the interlobular septa surrounding the seminiferous tubules was negative for the presence of syndecan-4. Both seminomas and non-seminomatous tumors exhibit increased expression of syndecan-4 and the highest expression of syndecan-4 is detected in seminomas. The increased expression of syndecan-4 in tumor cells in seminomas was confirmed by immunohistochemistry, whereas its expression was varied considerably in tumor cells among non-seminomas. Some cases in non-seminomatous tumors demonstrated with lower expression of syndecan-4 in tumor cells. The weaker expression of syndecan-4 in tumor cells was correlated with the presence of lymph node metastases, the presence of vascular and lymphatic invasion and the stage of the disease in the patients with non-seminomatous tumors. Furthermore, the presence of syndecan-4 in the stroma and in the stromal cells was demonstrated in both types of testicular germ cell tumors. The stromal presence of syndecan-4 was correlated with the presence of lymph node metastases, the presence of vascular and lymphatic invasion and the stage of the disease only in seminomas. The stromal staining of syndecan-4 is demonstrated for first time and it correlates with the increased number of microvessels present in testicular germ cell tumors. The study of CD44 in this thesis was conducted by immunohistochemistry using the polyclonal antibody H-300 that recognizes the main isoform CD44s. Our data indicate that CD44 is not expressed by germ cells present in the seminiferous tubules or the connective tissue in the normal testis. CD44 was found to be expressed in 27% and 36.8% of patients with seminomas and non-seminomas, respectively. Furthermore, CD44 was found in the stromal cells and / or stroma in 48.5% and 26.3% of patients with seminomas and non-seminomas, respectively. The expression of CD44 in the tumor cells as well as the presence of CD44 in stromal cells and / or stroma was correlated with the tumor size, the presence of lymph node metastases, the presence of vascular and lymphatic invasion and the stage of the disease only in seminomas. Nor the presence of CD44 in tumor cells neither the stromal staining of CD44 was correlated with any clinicopathological variable examined in non-seminomatous tumors. Overall the stromal staining of CD44 in testicular germ cell tumors was correlated with the neoangiogenesis, suggesting the implication of CD44 in the formation of new blood vessels. The data of this thesis suggest that versican, syndecan-4 and CD44 are implicated in the development of testicular germ cell tumors and may serve as prognostic biological markers. Further studies in a larger number of patients should be performed to determine the clinical utility of the expression of these PGs in testicular tumors.

Résumé : L’imagerie testiculaire développée dans notre unité a deux thématiques principales : l’infertilité et la caractérisation tumorale. Cette imagerie est basée sur l’échographie et l’IRM multiparamétriques. Nous avons défini des critères diagnostiques pour différentes pathologies, ayant un impact sur la prise en charge des patients, et évalué des modalités innovantes.Nous avons caractérisé l’aspect des testicules de patients infertiles porteurs d’un syndrome de Klinefelter. Nous avons déterminé l’aspect en Mode B et en Doppler couleur des tumeurs à cellules de Leydig dont la plupart sont actuellement découvertes de façon fortuite et peuvent bénéficier d’une surveillance ou d’une tumorectomie. Nous avons défini les critères diagnostiques des tumeurs éteintes ou «burned out tumors» découvertes en écho-Doppler chez des patients adressés pour bilan d’infertilité.Nous avons montré la capacité de l’IRM multiparamétrique à améliorer la caractérisation tumorale, par l’analyse qualitative et quantitative du rehaussement et par la valeur du coefficient de diffusion (ADC).L’échographie de contraste a montré des différences significatives entre les tumeurs éteintes et les autres lésions.L’élastographie par onde de cisaillement a montré des différences de dureté entre les testicules des patients infertiles par mécanisme obstructif et non obstructif mais le chevauchement des valeurs minimise l’impact clinique potentiel. Les tumeurs bénignes à cellules de Leydig étaient plus molles que les tumeurs malignes et les tumeurs éteintes. Le couplage des informations données par le mode B, le Doppler couleur, et l’élastographie ont permis une caractérisation optimale.Le Doppler ultrasensible a permis une analyse qualitative de l’architecture vasculaire des tumeurs, de la vascularisation testiculaire dans les urgences scrotales et une quantification de la vascularisation testiculaire. Nous avons objectivé une diminution de la vascularisation testiculaire pendant la manœuvre de Valsalva chez les patients avec varicocèle, ce qui représente une explication physiopathologique à l’infertilité par mécanisme hypoxique. / The testicular imaging we developped in our department focused on two main subjects: infertility and tumoral characterization. It is based on multiparametric ultrasound and MRI. We defined diagnostic criteria of several pathologies, which may change the patient’s management, and we evaluated new modalities.We characterized Klinefelter patient’s testis.We determined the Color-Doppler features of Leydig cell tumors which are currently incidentally discovered and can benefit from monitoring or tumorectomy.We defined multiparametric US and MRI diagnostic’s criteria of burned out tumors in patients referred for US infertility screening.We demonstrated the ability of multiparametric MRI to improve the tumoral characterization using qualitative and quantitative enhancement parameters and apparent diffusion coefficient values.CEUS showed significant differences between the burned out tumors and other lesions.. Shear Wave Elastography (SWE) showed significant differences in testicular stiffness between normal, obstructive azoospermia on one side and non-obstructive azoospermic patients, but overlapped values seemed to minimize the potential clinical impact. Benign Leydig cell were softer compared to malignant tumors and burned out tumors. Association of B mode, color Doppler, and elastography allowed an optimal characterization.Ultrasensitive Doppler allowed a qualitative evaluation of the tumoral vascular architecture, a testicular vascularization assessment in case of acute scrotum, and a testicular perfusion quantification. We demonstrated a decreased testicular vascularization during the Valsalva maneuver confirming the hypoxic physiopathological explanation of the infertility process.