Η σεργλυκίνη (SG) είναι η κύρια πρωτεογλυκάνη που εκφράζεται από τα αιμοποιητικά κύτταρα και συμμετέχει στη ρύθμιση διαφόρων παραγόντων που εμπλέκονται στις αντιδράσεις φλεγμονής. Επιπλέον, φαίνεται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη βιολογία του πολλαπλού μυελώματος αφού αναστέλλει τη δραστικότητα της κλασικής οδού και της λεκτινικής οδού του συμπληρώματος και προάγει την προσκόλληση των μυελωματικών κυττάρων στο κολλαγόνο τύπου Ι. Παράλληλα, η αυξημένη έκφρασή της σχετίζεται με τον επιθετικό φαινότυπο των κυττάρων καρκίνου του ρινοφάρυγγα. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η έκφραση της SG σε κακοήθειες. Τα αποτελέσματά μας αναδεικνύουν την έντονη παρουσία της σε συμπαγείς όγκους λόγω της αυξημένης έκφρασή της είτε από τα καρκινικά κύτταρα είτε από τα κύτταρα φλεγμονής και τα κύτταρα του στρώματος τα οποία επιστρατεύονται κατά την ανάπτυξη του όγκου. Επιπλέον, η αυξημένη έκφρασή της και η έκκρισή της σχετίσθηκαν με το μεταστατικό δυναμικό των κυτταρικών σειρών διαφόρων τύπων καρκίνου. Παράλληλα, ταυτοποιήθηκε η έκφραση του μεταγράφου της SG που προκύπτει από εναλλακτικό μάτισμα με απαλοιφή του εξωνίου 2. Επιπροσθέτως, μελετήθηκε ο βιολογικός ρόλος της SG σε επιθετικά καρκινικά κύτταρα μαστού. Βρέθηκε ότι η SG αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε κυτταρικές λειτουργίες όπως η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, η μεταφορά και ανακύκλωση μορίων από και προς την κυτταρική επιφάνεια και η γονιδιακή ρύθμιση. Η ίδια πρωτεογλυκάνη εκκρίνεται ιδιοσυστατικά από αυτά τα κύτταρα. Τόσο η γλυκοζαμινογλυκανική της σύσταση όσο και η ανασταλτική της δράση έναντι της ενεργοποίησης του συστήματος του συμπληρώματος είναι παρόμοιες με τη SG που εκκρίνεται από τα μυελωματικά κύτταρα. Η συμβολή της SG στον επιθετικό φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων επιβεβαιώθηκε με την υπερέκφρασή της σε χαμηλής επιθετικότητας κύτταρα καρκίνου του μαστού. Λειτουργίες όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση και η διήθηση των καρκινικών κυττάρων σχετίσθηκαν θετικά με την αυξημένη έκφραση και έκκριση της SG από αυτά τα κύτταρα. Οι επαγωγικές της ιδιότητες καταργήθηκαν με την απαλοιφή των θέσεων πρόσδεσης των γλυκοζαμινογλυκανών από τον πρωτεϊνικό της κορμό. Επιπλέον, διερευνήθηκε το πρωτεολυτικό δυναμικό αυτών των κυττάρων με τη μελέτη της έκφρασης πρωτεολυτικών ενζύμων του εξωκυττάριου χώρου, όπως οι tPA, uPA, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, MT1-MMP και του αναστολέα των μεταλλοπρωτεϊνασών TIMP-1. Παρουσιάσθηκε ότι η υπερέκφραση του πλήρους μορίου της SG αλλά και της μη γλυκοζυλιωμένης της μορφής οδηγούν στη διαφοροποίηση της έκφρασης και της ενεργότητας των μορίων αυτών με τρόπο που ποικίλει ανάλογα με την κυτταρική πυκνότητα. Παρόλα αυτά, τα δεδομένα που προέκυψαν από τη μελέτη της έκφρασης του uPA και της MT1-MMP συσχέτισαν την αυξημένη τους ενεργότητα με την υπερέκφραση της γλυκοζυλιωμένης μορφής της SG και ανέδειξαν την πιθανή συμβολή τους στην επιθετικότητα των καρκινικών κυττάρων μαστού. Συμπερασματικά, η παρουσία της SG είναι έντονη σε πληθώρα συμπαγών όγκων και καρκινικών κυτταρικών σειρών και φαίνεται να σχετίζεται με το μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων. Η συμβολή της στον επιθετικό φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων περιλαμβάνει τόσο ενδοκυττάριες όσο και εξωκυττάριες δράσεις που μεσολαβούνται από τη γλυκοζυλιωμένη της μορφή. / Serglycin (SG) is the major proteoglycan of hematopoietic origin cells and contributes to the regulation of several inflammatory proteins. Moreover, SG has a significant role in the biology of Multiple Myeloma; It inhibits the activation of the classical and the lectin pathway of complement system. Enhanced SG expression is correlated with the aggressive phenotype of nasopharyngeal cancer cells. In the present study, the expression of SG in several malignancies was investigated. The strong presence of SG in solid tumors due to its elevated expression either by cancer cells or by inflammatory and stomal cells was revealed. Furthermore, SG elevated expression and secretion was correlated with the high metastatic potential of several cancer cell lines. The expression of the alternatively spliced SG mRNA (variant 2) was identified. This variant lacks exon 2. The role of SG in the biology of aggressive breast cancer cells was studied. SG interacts with significant mediators of actin cytoskeleton reorganization, protein transport and regulation of gene expression. This proteoglycan is constitutively secreted by aggressive breast cancer cells and shares the same glycosaminoglycan (GAG) moieties and inhibitory effects torward complement system activation as the secreted SG by myeloma cells. SG contribution in the aggressive phenotype of cancer cells was studied via the overexpression of the moleclule in the low aggressive breast cancer cells. Cellular functions such as proliferation, migration and invasion of cancer cells were positively correlated with the elevated expression and secretion of SG. These properties were abolished by the deletion of GAG binding sites from SG core protein. Moreover, the proteolytic potential of the overexpressing cells was examined via the expression of ECM degrading molecules, such as tPA, uPA, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, MT1-MMP, and TIMP-1 MMP inhibitor. Altered expression and activity rates of these enzymes correlated with the overexpression of either the full length or the truncated form of SG in a manner which depends on the cellular density. Interestingly, enhanced MT1-MMP activity followed only the overexpression of the full length molecule indicating the contribution of this MMP in breast cancer cell aggressiveness. The data above revealed the intense presence of SG in several solid tumors and cancer cell lines and the correlation of SG expression with the metastatic potential of cancer cells. Its contribution to cancer cells aggressive phenotype includes both intracellular and extracellular functions which are mediated by the glycanated form of SG.

Οι κακοήθεις όγκοι των όρχεων εμφανίζονται κυρίως σε άνδρες ηλικίας 15-35 ετών και παρουσιάζουν αυξητική τάση τα τελευταία 40 χρόνια. Περίπου 95% των νεοπλασιών προέρχονται από τα βλαστικά κύτταρα και οι περισσότεροι από τους όγκους των όρχεων είναι επιθετικοί και ικανοί για γρήγορη και ευρεία διασπορά της νόσου. Η πρόγνωση της κλινικής εξέλιξης της νόσου αποτελεί μια πρόκληση και ο ρόλος διαφόρων βιολογικών δεικτών έχει μελετηθεί προσπαθώντας να διευκρινιστούν τα ακριβή αίτια και οι παθογενετικοί μηχανισμοί της ανάπτυξης των όγκων στους όρχεις. Τόσο τα κύτταρα του στρώματος όσο και τα νεοπλασματικά κύτταρα εμπλέκονται στην αναδιοργάνωση του ECM έτσι ώστε να διευκολυνθεί ο πολλαπλασιασμός, η μετακίνηση και διήθηση των νεοπλασματικών κυττάρων. Οι PGs είναι βιοδραστικά μόρια και η έκφρασή τους τροποποιείται σημαντικά στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Μεταβολές της έκφρασης των PGs από τα κύτταρα του όγκου και τα στρωματικά κύτταρα επηρεάζουν τα σηματοδοτικά μονοπάτια των νεοπλασματικών κυττάρων, την ανάπτυξη και επιβίωσή τους, την προσκόλληση και μετανάστευσή τους καθώς και τη δημιουργία νέων αγγείων στον όγκο. Σκοπός της διδακτορικής διατριβής ήταν να μελετηθεί η παρουσία των εξωκυττάριων PGs, versican και decorin καθώς και των μεμβρανικών PGs, syndecan-4 και CD44 (standard isoform) και να διερευνηθεί η πιθανή συσχέτιση της έκφρασής τους με τη βιολογική συμπεριφορά των όγκων όρχεων που προέρχονται από βλαστικά κύτταρα. Αρχικώς, η έκφραση και ο εντοπισμός τους μελετήθηκε με ανοσοϊστοχημεία σε αρχειακό υλικό 71 ασθενών με σεμινωματώδεις και μη-σεμινωματώδεις όγκους και τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με ανοσοεντοπισμό ή με μελέτη της γονιδιακής έκφρασης μέσω RT-PCR σε περιορισμένο αριθμό δειγμάτων. Στη συνέχεια, η παρουσία των PGs συσχετίστηκε με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών και τη νεοαγγειογένεση που παρατηρείται στους όγκους. Διαπιστώθηκε ότι οι versican και decorin εκφράζονται σε μικρά ποσά στο διάμεσο συνδετικό ιστό, στα μεσολοβιώδη διαφράγματα που περιβάλλουν τα σπερματικά σωληνάρια των όρχεων και παρατηρείται σημαντική αύξηση των ποσών και των δύο PGs κυρίως στο στρώμα που περιβάλλει τόσο τους σεμινωματώδεις όσο και τους μη-σεμινωματώδεις όγκους. Οι μη-σεμινωματώδεις όγκοι χαρακτηρίζονται από μεγαλύτερη αύξηση στην έκφραση της versican σε σχέση με τους σεμινωματώδεις. Η decorin παρουσιάζει σχεδόν παρόμοια επίπεδα έκφρασης και στις δύο κατηγορίες των όγκων όρχεων. Η αυξημένη εναπόθεση της decorin στο στρώμα των όγκων δεν συσχετίζεται στατιστικά με καμία από τις κλινικοπαθολογικές μεταβλητές που μελετήθηκαν. Αντιθέτως, η αυξημένη εναπόθεση της versican τόσο στα σεμινώματα όσο και στους μη-σεμινωματώδεις όγκους συσχετίζεται στατιστικά με την παρουσία αγγειακών και λεμφαγγειακών διηθήσεων, το μέγεθος του πρωτοπαθούς όγκου (στατιστικά σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μόνο στους μη-σεμινωματώδεις όγκους), την παρουσία μεταστάσεων στους λεμφαδένες, την ύπαρξη απομακρυσμένων μεταστάσεων (συσχετίστηκε μόνο στους μη-σεμινωματώδεις όγκους) και το στάδιο της νόσου. Επιπλέον, στην παρούσα μελέτη βρέθηκε ότι η συσσώρευση της versican στο στρώμα των όγκων όρχεων σχετίζεται με την παρουσία μεγαλύτερου αριθμού νέων αγγείων. Η μελέτη της διαμεμβρανικής PG syndecan-4 ανέδειξε ότι εκφράζεται από τα τα σπερματικά κύτταρα των σπερματικών σωληναρίων, κυρίως πλησίον του βασικού υμένα, στους φυσιολογικούς ιστούς των όρχεων. Η syndecan-4 εντοπίζεται τόσο στο κυτταρόπλασμα όσο και στη μεμβράνη των φυσιολογικών κυττάρων. Αντιθέτως, δεν διαπιστώθηκε εναπόθεση της syndecan-4 στο διάμεσο συνδετικό ιστό, στα μεσολοβιώδη διαφράγματα που περιβάλλουν τα σπερματικά σωληνάρια των όρχεων. Τόσο οι σεμινωματώδεις όσο και οι μη σεμινωματώδεις όγκοι όρχεων εμφανίζουν αυξημένη έκφραση του γονιδίου της syndecan-4. Οι σεμινωματώδεις όγκοι χαρακτηρίζονται από σημαντικά πιο αυξημένη έκφραση του γονιδίου της syndecan-4 σε σχέση με τους μη-σεμινωματώδεις όγκους. Η υψηλή έκφραση της syndecan-4 στα κύτταρα του όγκου στα σεμινώματα επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση των ιστών, ενώ η έκφρασή της παρουσίαζε διακυμάνσεις στα κύτταρα των μη-σεμινωματωδών όγκων. Στους μη-σεμινωματώδεις όγκους αναγνωρίστηκαν περιπτώσεις ασθενών με ασθενέστερη έκφραση της syndecan-4 στα κύτταρα του όγκου. Η ελαττωμένη παρουσία της syndecan-4 στα κύτταρα των μη-σεμινωματωδών όγκων συσχετίστηκε με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων, αγγειακής και λεμφαγγειακής διήθησης και με το στάδιο της νόσου στους ασθενείς. Επιπλέον, η syndecan-4 εντοπίστηκε στο ινώδες στρώμα και στα στρωματικά κύτταρα στους σεμινωματώδεις και μη-σεμινωματώδεις όγκους. Η παρουσία της syndecan-4 στο στρώμα συσχετίστηκε με την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων, αγγειακών και λεμφαγγειακών διηθήσεων και το στάδιο της νόσου μόνο στα σεμινώματα. Η έκφραση της syndecan-4, στο στρώμα κακοήθων όγκων, αναδεικνύεται για πρώτη φορά σε αυτή τη μελέτη και συσχετίζεται με τον αυξημένο αριθμό αγγείων στο στρώμα των όγκων όρχεων. Η μελέτη του υποδοχέα CD44 στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας το πολυκλωνικό αντίσωμα Η-300 που αναγνωρίζει την κύρια ισομορφή CD44s. Διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη του CD44 δεν εκφράζεται από τα φυσιολογικά κύτταρα των σπερματικών σωληναρίων των όρχεων. Επίσης, δεν παρατηρήθηκε χρώση για τον CD44 στο διάμεσο συνδετικό ιστό, στα μεσολοβιώδη διαφράγματα που περιβάλλουν τα σπερματικά σωληνάρια των όρχεων. Ο CD44 βρέθηκε ότι εκφράζεται στα κύτταρα του όγκου στο 27% των ασθενών με σεμινώματα και στο 36.8% των ασθενών με μη-σεμινωματώδεις όγκους. Επίσης, βρέθηκε ότι ο CD44 εκφράζεται στο στρώμα του όγκου στο 48.5% των ασθενών με σεμινώματα και στο 26.3% των ασθενών με μη-σεμινωματώδεις όγκους. Η έκφραση του CD44 στα κύτταρα του όγκου και στο στρώμα συσχετίστηκε με το μέγεθος του όγκου, την παρουσία μεταστάσεων σε λεμφαδένες, τη διήθηση αγγείων και λεμφαγγείων και το προχωρημένο στάδιο της νόσου μόνο στους ασθενείς με σεμινώματα. Δεν παρατηρήθηκε καμία συσχέτιση της παρουσίας του CD44 στους μη-σεμινωματώδεις όγκους με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών. Η παρουσία του CD44 στα κύτταρα και τον ECM του στρώματος των όγκων συσχετίστηκε με αυξημένο αριθμό αγγείων, εύρημα που προτείνει ότι ο υποδοχέας εμπλέκεται στη νεοαγγειογένεση. Τα ευρήματα της διδακτορικής διατριβής προτείνουν ότι οι PGs versican, syndecan-4 και CD44 εμπλέκονται στην εξέλιξη των όγκων όρχεων και μπορούν να αποτελέσουν προγνωστικούς δείκτες. Για να τεκμηριωθεί η κλινική χρησιμότητα της έκφρασής τους σε όγκους όρχεων που προέρχονται από βλαστικά κύτταρα απαιτείται περαιτέρω έρευνα σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων. / Testicular tumors present in men aged 15-35 years with increasing incidence in the last 40 years. Approximately 95% of these tumors arise from germ cells. Although most of these tumors are aggressive with rapid growth and spread, the chemotherapy is very efficient and the mortality has been markedly reduced. Prognosis is a challenging issue and the role of various biological markers has been investigated in order to elucidate the mechanisms of the development and progression of the disease. Tumor and stromal cells are implicated in the remodeling of the ECM that facilitates the growth, motility and invasion of tumor cells. PGs are bioactive molecules and their expression is markedly affected in the microenvironment of the tumor. Alterations in the expression of PGs by tumor and stromal cells modulate various signaling pathways in tumor cells affecting tumor cell growth and survival, adhesion and migration as well as neoangiogenesis. The aim of the present thesis was to study the distribution of matrix secreted PGs, versican and decorin as well as that of cell surface associated PGs, syndecan-4 and CD44 and to investigate the possible association of their expression with the biological behavior in testicular germ cell tumors. Their expression and localization was studied performing immunohistochemistry in archive material in 71 patients with seminomatous and non-seminomatous germ cell tumors and the results were confirmed by western blots and study of the gene expression in limited number of tissue from patients. The presence of PGs was correlated with the clinicopathological variables of the patients and with the number of microvessels present in the tissues. The study revealed that versican and decorin present in small amounts in the interstitial connective tissue in the interlobular septa surrounding the seminiferous tubules and are markedly increased in the peritumoral and sometimes in intratumoral stroma in seminomas and non seminomatous tumors. Non seminomatous tumors exhibited increased staining for versican as compared to seminomas, whereas decorin is almost equally distributed in both types of testicular germ cell tumors. The increased accumulation of decorin in the tumor stroma was not correlated with any clinicopathological variable of the patients. In contrast, the accumulation of versican in both seminomas and non-seminomatous tumors was correlated with the presence of lymphatic and vascular invasion, the size of the tumor (only in non-seminomatous tumors), the presence of metastases in lymph nodes, the presence of distant metastases (evaluated only in non-seminomas) and the stage of the disease. Furthermore, the accumulation of versican in tumor stroma of testicular germ cell tumors was correlated with the increased number of microvessels in the tissues. The study of transmembrane PG syndecan-4 revealed that it was expressed by germ cells in the seminiferous tubules in normal tissue. Syndecan-4 presents both in the cytoplasm and the cell membrane of the cells. The interstitial connective tissue in the interlobular septa surrounding the seminiferous tubules was negative for the presence of syndecan-4. Both seminomas and non-seminomatous tumors exhibit increased expression of syndecan-4 and the highest expression of syndecan-4 is detected in seminomas. The increased expression of syndecan-4 in tumor cells in seminomas was confirmed by immunohistochemistry, whereas its expression was varied considerably in tumor cells among non-seminomas. Some cases in non-seminomatous tumors demonstrated with lower expression of syndecan-4 in tumor cells. The weaker expression of syndecan-4 in tumor cells was correlated with the presence of lymph node metastases, the presence of vascular and lymphatic invasion and the stage of the disease in the patients with non-seminomatous tumors. Furthermore, the presence of syndecan-4 in the stroma and in the stromal cells was demonstrated in both types of testicular germ cell tumors. The stromal presence of syndecan-4 was correlated with the presence of lymph node metastases, the presence of vascular and lymphatic invasion and the stage of the disease only in seminomas. The stromal staining of syndecan-4 is demonstrated for first time and it correlates with the increased number of microvessels present in testicular germ cell tumors. The study of CD44 in this thesis was conducted by immunohistochemistry using the polyclonal antibody H-300 that recognizes the main isoform CD44s. Our data indicate that CD44 is not expressed by germ cells present in the seminiferous tubules or the connective tissue in the normal testis. CD44 was found to be expressed in 27% and 36.8% of patients with seminomas and non-seminomas, respectively. Furthermore, CD44 was found in the stromal cells and / or stroma in 48.5% and 26.3% of patients with seminomas and non-seminomas, respectively. The expression of CD44 in the tumor cells as well as the presence of CD44 in stromal cells and / or stroma was correlated with the tumor size, the presence of lymph node metastases, the presence of vascular and lymphatic invasion and the stage of the disease only in seminomas. Nor the presence of CD44 in tumor cells neither the stromal staining of CD44 was correlated with any clinicopathological variable examined in non-seminomatous tumors. Overall the stromal staining of CD44 in testicular germ cell tumors was correlated with the neoangiogenesis, suggesting the implication of CD44 in the formation of new blood vessels. The data of this thesis suggest that versican, syndecan-4 and CD44 are implicated in the development of testicular germ cell tumors and may serve as prognostic biological markers. Further studies in a larger number of patients should be performed to determine the clinical utility of the expression of these PGs in testicular tumors.