Thèse Médecine Paris 1906.

Th.--Méd.--Nancy 1, 1984. N°: 234.

Thèse doctorat : Biologie moléculaire et cellulaire : Paris 12 : 2003. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. : 162 réf.

Titre de l'écran-titre (visionné le 11 septembre 2023) / Dans le testicule, il existe deux populations distinctes de cellules de Leydig, les cellules fœtales (FLC) et adultes (ALC). Elles produisent deux hormones, testostérone et INSL3 (Insulin-like 3) essentielles à la différenciation sexuelle masculine, fertilité et santé osseuse. Les mécanismes régulant la différenciation et la fonction des cellules de Leydig demeurent méconnus en raison de l'absence de modèle de souris exprimant la recombinase Cre afin de cibler exclusivement ces cellules. Puisque le gène Insl3 est exprimé uniquement dans les FLC et ALC, l'approche CRISPR/Cas9 a été utilisée pour insérer le transgène Cre recombinase améliorée (iCre) ou le transgène TdTomato dans le locus Insl3. Cependant la caractérisation de ces lignées de souris et l'expression exclusive du transgène dans les cellules de Leydig restaient à démontrer. Mon objectif était de caractériser certaines des nouvelles lignées de souris et en particulier, Insl3[exposant iCre]. Cette lignée a été croisée avec une souris rapporteuse Rosa26[exposant LoxSTOPLox-TdTomato] et la progéniture mâle issue de ces croisements a été sacrifiée à différents âges embryonnaires et postnataux. Les testicules ont été récoltés, congelés et coupés au cryostat. Des expériences d'immunofluorescence ont été réalisées. Chez la progéniture mâle, la protéine fluorescente rouge, TdTomato, a été observée dans les FLC et ALC (colocalisation avec CYP17A1, un marqueur spécifique des cellules de Leydig) aux âges fœtaux et postnataux examinés. La protéine TdTomato a été détectée dans les FLC dès E13.0, et dès P5 dans les ALC, corrélant avec le premier moment de la différenciation fonctionnelle des FLC et ALC, respectivement. Aucune fluorescence n'a été observée dans d'autres tissus examinés. Cette nouvelle lignée iCre exclusive aux cellules de Leydig représente une avancée majeure dans le domaine de l'andrologie et permettra d'aborder des questions fondamentales sur la biologie et la fonction des gènes dans les cellules de Leydig qui sont restées sans réponse pendant des décennies. / In the testis there are two populations of Leydig cells, fetal (FLC) and adult (ALC) Leydig cells. They produce two hormones, testosterone and INSL3 (Insulin-like 3) that are essential for male sex differentiation, fertility, and bone health. Our knowledge of mechanisms regulating differentiation and function of Leydig cells have remained incomplete because of the absence of a mouse model expressing Cre recombinase to exclusively target Leydig cells. Since INSL3 is uniquely expressed in both FLCs and ALCs, a CRISPR/Cas9 approach was used to knock-in the improved Cre recombinase (iCre) or TdTomato transgene into the Insl3 locus. However, the tissue and cell-specific transgene expression of the resulting mouse lines remained to be studied. My objective was therefore to characterize some of the new mice lines, particularly, Insl3[superscript iCre]. This mouse line was crossed with a Rosa26[superscript Lox-STOP-Lox-TdTomato] reporter mouse line and male off spring resulting from these crosses were euthanized at different embryonic and postnatal ages and the testes were harvested, frozen and cut in cryosections. Immunofluorescence experiments were subsequently performed. In male off spring, TdTomato red fluorescence was detected in both FLCs and ALCs at fetal and postnatal ages examined, as confirmed by immunofluorescence for CYP17A1, a marker of Leydig cells. The TdTomato protein was observed in FLCs as early as E13.0 while it was detected as early as P5 in ALCs, correlating with the earliest times of FLC and ALC differentiation, respectively. No fluorescence was observed in any other fetal or adult tissue examined. The Leydig cell-exclusive iCre line will be invaluable for generating Leydig cell-exclusive gene knockouts. These new genetic tools represent a major advance to the field of andrology that will allow us to address fundamental questions about the biology and gene function of Leydig cells that have remained unanswered for decades.

Les macrophages sont des cellules de l’immunité innée et sont localisés dans la majorité des organes du corps, présentant des fonctions spécifiques dépendant de leur lieu de résidence.Les macrophages d’origine embryonnaire sont la source majeure des macrophages tissulaires et sont capables de se maintenir à long terme dans la plupart des organes adultes.Cependant, il reste certains organes comme le testicule, où l’origine des macrophages n’est pas clairement déterminée. Le testicule est considéré comme un organe immuno-privilégié et a cette nécessité de protéger de tous contacts les spermatozoïdes des cellules immunitaires, qui pourraient induire une auto-immunité.Les macrophages testiculaires (tMφ) contribuent à maintenir ce statut d’organe immuno-privilégié en produisant des cytokines immunosuppressives. Pour ces raisons, les tMφ peuvent être considérés comme des “ gardiens de la fertilité”. Dans les testicules adultes, deux différentes populations de macrophages, nommées interstitielles et péritubulaires, ont été identifiées en se basant sur leurs morphologies et localisations distinctes, mais leur origine et leur mode de développement et de maintenance restent encore inconnus. En combinant des méthodes de traçage cellulaire et la mise au point d’un modèle de transfert adoptif dans des souriceaux, j’ai démontré que les macrophages d’origine embryonnaire contribuaient exclusivement à la population de tMφ interstitielle dès la naissance et que les tMφ péritubulaires proviennent exclusivement de la moelle osseuse. Après avoir caractérisé les tMφ, mes prochaines investigations se porteront sur l’étude des fonctions de chacune de ces deux populations. / Macrophages are innate immune cells residing in most of the organs of the body and ensure proper organ function. Traditionally, it has been known that macrophages can be derived from HSC progenitors in the bone-marrow (BM), but technology using fate-mapping tools has revealed that macrophages can already be generated from embryonic progenitors. Embryo-derived macrophages are a major source of tissue-resident macrophages and can self-maintain during adulthood. The origin of resident macrophages in the testis, however, so far has not been well studied.Importantly, the testis is considered as an immune-privileged organ by protecting the highly immunogenic spermatozoa sequestrated in the seminiferous tubules from the entrance of immune cells. In the adult testis, macrophages participate in the creation of an immune suppressive microenvironment preventing auto-immune attack. Therefore, testicular macrophages tMφ could be considered as the guardians of fertility. Recently,two different macrophage populations have been identified in the adult testis, called interstitial and peritubular, based on their distinct localization and morphology,but their developmental origin and homeostatic maintenance were unknown.Combining the genetic lineage tracing and the neonatal adoptive transfer model, I could demonstrate that the embryo-derived macrophages give rise exclusively to interstitial tMφ. Peritubular tMφ, however, only emerge postnatally from BM-derived progenitors. .My findings provide framework for future investigations into the distinct functions of these two tMφ populations in establishment of immune-privilege as well as the support of spermatogenesis and male hormone production.

Le mode de vie moderne a conduit à la contamination des lieux de vie domestique, professionnel et alimentaire par de nombreuses molécules chimiques de familles très variées (médicaments, pesticides, polluants industriels…). Ces produits peuvent jouer le rôle de perturbateurs du système hormonal, notamment au niveau du testicule. Les effets de ces produits sur la santé humaine sont très fréquemment exposés dans les médias ces dernières années, traduisant les inquiétudes et l’enjeu majeur de santé publique que représente l’étude de ces polluants chez les humains. Depuis quelques années, l’étude de certains paramètres de la fonction reproductrice masculine a montré une augmentation des cas de cancers testiculaires, malformations génitales ainsi qu’une diminution de la qualité du sperme. Afin d’expliquer ces constatations, l’hypothèse d’une exposition pendant la vie fœtal à ces perturbateurs endocriniens est la plus communément avancée. Cette thèse se propose d’étudier les conséquences d’une exposition à des mélanges de perturbateurs endocriniens présents dans l’environnement sur le testicule humain fœtal et adulte. Les résultats obtenus ont permis : 1) d’accroître la connaissance sur la santé reproductive de molécules jusqu’alors peu étudiées, 2) de mettre en évidence des effets combinés de molécules lorsqu’elles sont mélangées. Ces effets sont retrouvés de l’âge fœtal à l’âge adulte et posent ainsi la question des fenêtres critiques d’exposition. Nous avons montré pour la première fois sur un tissu humain complet que les effets des mélanges expérimentalement obtenus sont prévisibles par l’utilisation de la théorie de l’additivité des doses. Nous avons également pu mettre en évidence que l’effet anti-androgénique des molécules mélangées est potentialisé lors d’exposition multiple. Ces résultats, permette d’entrevoir une meilleure évaluation du risque cumulé pour des polluants environnementaux et chimiques. Ce travail ouvre la voie à une évaluation du risque cumulé entièrement prédictives, le test de toutes les combinaisons possibles devenant inutile. / A number of chemicals are capable of disrupting androgen production, but the possibility that they might act together to produce effects larger than those of the most effective component in the mixture has never been studied directly in human tissues. Suppression of androgen synthesis in fetal life can contribute to testis maldescent, malformations of the genitalia and poor semen quality. By using an organotypic culture system of human fetal testes, we conducted an unprecedented screening exercise in which 27 chemicals were tested for their possible anti-androgen effect. We demonstrate that several previously untested chemicals such as the pesticides imazalil and propiconazole and the industrial chemical bisphenol S (BPS), together with pharmaceuticals and pesticides, act jointly to exacerbate suppression of testosterone synthesis in the human fetal testis. This leads to considerable downward shifts of dose-response curves towards lower doses, at a particularly sensitive time when male sexual development is initiated. Our work reveals previously unrecognized risks to the developing fetus and provides the foundations of a predictive human mixture risk assessment approach. Our studies highlight concerns about the use of pharmaceutical in mixture during pregnancy and the impact on reproductive human health of multiple chemical exposure.

Plusieurs études ont démontré l’existence d’une corrélation directe entre l’exposition fœtale à des contaminants environnementaux (comme le DEHP ou les estrogènes) et la perturbation de la différenciation sexuelle chez les fœtus mâles. Ces études ont notamment mis en évidence l’existence d’une fenêtre de susceptibilité; une période pendant laquelle l’exposition des cellules de Leydig aux contaminants perturbe leurs activités et entraine une diminution de leurs sécrétions des hormones testostérone (T) et Insulin-like 3 (INSL3). Ces hormones sécrétées par les cellules de Leydig sont requises pour la différenciation sexuelle du fœtus mâle, l’adoption des caractéristiques masculines primaires et secondaires (revue de Robert Courrier, 1962). Ces hormones influencent aussi la formation des spermatozoïdes et le comportement sexuel. Les études démontrent qu’une production insuffisante de ces hormones est corrélée avec une fertilité réduite (de modérée à très grave), une sous-masculinisation, la non-descente des testicules dans le scrotum (cryptorchidie) et parfois même une féminisation des organes sexuels primaires. Selon plusieurs spécialistes, ces symptômes seraient le résultat d’une perturbation de l’ontogenèse des testicules durant le développement fœtal. Syndrome de dysgénésie testiculaire est le nom qui a été donné à cette théorie. La cryptorchidie congénitale découlerait donc d’une insuffisance d’activités hormonales et révélerait par le fait même un problème de dysgénésie testiculaire. Bien que la prévalence varie à travers le monde, il semblerait, qu’en moyenne, au moins 4 % des nouveau-nés naissent avec cette condition. La localisation des testicules cryptorchides peut être corrigée chirurgicalement par orchiopexie (orchidopexie). Néanmoins, la correction chirurgicale ne semble pas être suffisante puisque les individus cryptorchides à la naissance demeurent plus à risque de développer un cancer du testicule et de souffrir de problèmes reliés à la fertilité, et ce, même après correction chirurgicale. Bien que les preuves provenant des études épidémiologiques et animales soient de plus en plus explicites, les preuves moléculaires demeurent partielles ou peu concluantes. Des preuves de nature moléculaire pourraient permettre de mieux définir le risque réel que représente le DEHP pour la santé humaine et la fertilité masculine. Le principal objectif des recherches effectuées était d’identifier et de valider un modèle in vitro permettant l’étude de composés potentiellement toxiques en minimisant le sacrifice d’animaux. À travers ces travaux, nous démontrons que la testostérone (T) augmente les niveaux d’ARNm d’Insl3 dans une lignée de cellules de Leydig et dans des cellules de Leydig primaires. Nous démontrons aussi que la testostérone induit l’activité des promoteurs d’Insl3 de différentes espèces. De plus, nous mettons en évidence que l’effet inducteur de la T sur l’activité transcriptionnelle et l’ARNm d’Insl3 nécessite le récepteur aux androgènes (AR). Nous avons localisé l’élément de réponse à la T sur le promoteur proximal d’INSL3. Cette région est toutefois dépourvue d’un élément de réponse aux androgènes consensus, ce qui suggère un mécanisme d’action indirect. Enfin, nous démontrons que le mono-(2-éthylhexyl) phtalate, le métabolite actif du perturbateur endocrinien DEHP, réprime aussi la transcription d’Insl3 dans les cellules de Leydig en antagonisant l’action de la dyade T/AR. Nous démontrons que l’estradiol (E2) réduit le niveau d’ARNm d’Insl3 dans les cellules de Leydig MA-10. Nos résultats démontrent qu’E2 réduit l’activité des promoteurs humain et murin d’Insl3/INSL3. Nous avons circonscrit la région répondant à l’E2 sur le promoteur proximal du promoteur humain d’INSL3. Cette région ne contient pas d’élément consensus de réponse aux estrogènes. Ceci indique que le mécanisme de répression est indirect. Conformément à cela, nous avons noté que la réponse à l’E2 est perdue lorsqu’une mutation est introduite au niveau des sites de liaisons des récepteurs nucléaires NUR77 et SF1. Enfin, nous démontrons que l’effet de l’exposition à l’E2 peut être renversé par un traitement conjoint avec de la testostérone, un activateur de la transcription d’Insl3. Malheureusement, les travaux n’ont pu être complétés dans le cadre de la présente thèse puisque la lignée cellulaire utilisée comme modèle, la lignée MA-10, a cessé de répondre aux divers stimuli. Néanmoins, les données présentées procurent d’importantes nouvelles perspectives sur la régulation de la transcription d’Insl3/INSL3 dans les cellules de Leydig, sur le mode d’action des phtalates et suggèrent des pistes de recherche à venir. La présente thèse contribue ainsi à la somme des savoirs qui permettra de comprendre comment le DEHP vient inhiber la sécrétion de T et d’INSL3.

[INSL3 : Insulin-like factor 3]. / Insulin-like factor 3 (INSL3) est une hormone qui est exprimée spécifiquement dans les cellules de Leydig chez le mâle et les cellules de la thèque chez la femelle. INSL3 joue un rôle essentiel dans le développement et la fonction de l'appareil reproducteur mâle. En effet, LNSL3 contrôle la 1ère phase de la descente testiculaire pendant la vie foetale et agit comme facteur de survie des cellules germinales chez l'adulte. Malgré son rôle crucial chez le mâle, on sait peu de choses quant à sa régulation transcriptionnelle dans les cellules de Leydig. Jusqu'à présent seulement 2 facteurs de transcription ont été identifiés comme régulateur de la transcription d'Insl3 : les récepteurs nucléaires SF-1 et NUR77. Toutefois, ces récepteurs sont exprimés dans de nombreux autres tissus qui n'expriment pas Insl3, indiquant que d'autres facteurs de transcription sont requis pour l'expression spécifique d'Insl3 dans les cellules de Leydig. Afin d'identifier ces facteurs de transcription, nous avons isolé et analysé un fragment de 1.1 kb du promoteur souris d'Insl3. Grâce à des deletions 5' progressives, j'ai identifié une région de 27 pb responsable de 70% de l'activité transcriptionnelle d'Insl3.

L’étude des mécanismes moléculaires qui contrôlent la différenciation et la fonction des cellules de Leydig est déterminante pour mieux comprendre le développement sexuel et la fertilité chez le mâle. Présentement, les régulateurs transcriptionnels impliqués dans ces mécanismes sont très peu connus. Un rôle pour le récepteur nucléaire COUP-TFII dans la fonction et différenciation des cellules de Leydig a été suggéré suite à son invalidation conditionnelle chez la souris mâle. Cependant, aucun gène cible pour COUP-TFII n’avait été identifié dans ces cellules. À cet égard, durant mes travaux de doctorat je me suis intéressé à élucider les rôles et les mécanismes d’action de COUP-TFII dans les cellules de Leydig. Lors de la réalisation de mon projet de recherche, j’ai démontré que les gènes Insl3 et Star sont des cibles de COUP-TFII dans ces cellules. En effet, COUP-TFII régule positivement et directement l’activation des promoteurs Insl3 et Star en se liant aux éléments de réponse DR0-like et DR1-like localisés à respectivement -97 pb et -106 pb de ces promoteurs, . La mutation de ces éléments diminue l’activation de ces deux promoteurs par COUP-TFII. Également, une réduction des niveaux de COUP-TFII par siARN dans les cellules de Leydig diminue l’expression du gène Insl3 et l’expression basale du gène Star. Cependant, l’absence de COUP-TFII n’affecte pas l’activation hormone-dépendante de ce dernier gène. J’ai aussi démontré que COUP-TFII coopère avec GATA-4, SP1 et SF-1 dans l’activation du promoteur Star, mais seulement ce dernier collabore avec COUP-TFII dans l’activation du promoteur Insl3. Pareillement, une coopération entre COUP-TFII et CAMKI a été observée dans l’activation du promoteur Star, mais elle n’a pas été observée dans l’activation du promoteur Insl3. Enfin, j’ai identifié, par une analyse transcriptomique, plusieurs gènes dont l’expression est diminuée en l’absence de COUP-TFII. Par PCR en temps réel, j’ai confirmé la diminution de l’expression de trois gènes importants pour la fonction reproductive : Hsd3b1, Amhr2 et Inha. Ainsi, ces résultats permettent de mieux comprendre la fonction de COUP-TFII dans les cellules de Leydig et représentent une avancée importante dans la compréhension des mécanismes moléculaires régulant la différenciation sexuelle et la fertilité masculine. / The study of the molecular mechanisms that control Leydig cell differentiation and function is crucial to better understand male sexual development and fertility. Currently, few transcriptional regulators involved in these mechanisms are known. A role for the nuclear receptor COUP-TFII in Leydig cell differentiation and function has been suggested after its conditional knockout in male mice. However, no target gene for COUP-TFII had been identified in these cells. In this regard, during my PhD research project I was interested in elucidating the roles and mechanisms of action of COUP-TFII in Leydig cells. Here in my thesis, I report that Insl3 and Star genes are targets of COUP-TFII in these cells. Indeed, COUP-TFII directly activates the Insl3 and Star promoters by binding to the response elements DR0-like and DR1-like located at -97 bp and -106 bp of each promoter, respectively. Mutation of these elements decreases the activation of these two promoters by COUP-TFII. Also, a reduction of COUP-TFII expression in Leydig cells by siRNA decreases Insl3 gene expression and basal Star gene expression but does not affect the hormone-dependent activation of the latter. I also found that COUP-TFII cooperates with GATA-4, SP1 and SF-1 for Star promoter activation but only the latter cooperates with COUP-TFII on the Insl3 promoter. Cooperation between COUP-TFII and CAMKI was also observed on the Star promoter but it was not observed on the Insl3 promoter. Finally, I have identified, by transcriptomic analysis, several genes that are down-regulated in COUP-TFII knockdown Leydig cells. By real time PCR, I confirmed the decreased expression of three important genes for reproductive function: Hsd3b1, Inha and Amhr2. Thus, these results provide new insights into the function of COUP-TFII in Leydig cells and represent a significant advance in our understanding of the molecular mechanisms that regulate male sexual differentiation and fertility.

Les cellules de Leydig sont les principales cellules stéroïdogéniques dans le testicule. La stéroïdogenèse est un mécanisme crucial pour la masculinisation pendant l’embryogenèse et la puberté ainsi que pour le maintien des caractéristiques mâles durant l’âge adulte. Elle est donc finement régulée par l’axe hypothalamo-hypophysaire mais également directement dans la cellule de Leydig. Un des mécanismes majeurs, ayant lieu dans la cellule de Leydig, est la régulation de l’expression des gènes stéroïdogéniques par des facteurs de transcription. Pendant ma thèse, j’ai caractérisé la présence des facteurs de transcription MEF2 dans les cellules de Leydig. Ces facteurs font partie de la famille des facteurs de transcription MEF2 qui compte quatre membres : MEF2A, 2B, 2C et 2D. J’ai mis en évidence que les facteurs MEF2, et plus précisément les facteurs MEF2A et MEF2D, sont présents dans la lignée cellulaire de Leydig MA-10 et qu’ils activent l’expression du gène Nr4a1 ainsi que du gène Star. NR4A1 est connu comme un régulateur de l’expression de gènes stéroïdogéniques et STAR comme réalisant une étape limitante de la stéroïdogenèse. De plus, MEF2 régule l’expression de ces gènes en coopération avec la CAMKI, la forskoline ou l’AMPc. Ces molécules sont connues pour mimer l’activation par la LH ou faire partie d’une des voies activées par la LH. De plus, MEF2 est exprimé dans le testicule tout au long du développement embryonnaire et de la vie adulte mais à aucun de ces stades dans l’ovaire. Ceci suggère un/des rôle(s) bien particulier(s) de MEF2 dans le développement et la fonction de la gonade mâle. Afin de mieux comprendre son (ses) rôle(s), des expériences de micropuces ont été réalisées à partir de cellules de Leydig dans lesquelles l’expression de MEF2 a été diminuée par des petits ARN interférents. Ces expériences ont permis d’identifier des nouveaux gènes cibles de MEF2 dans les cellules de Leydig. Ma thèse a donc permis d’identifier un nouveau facteur de transcription dans les cellules de Leydig et de commencer à décrypter son rôle dans ces cellules. / Leydig cells are the main steroidogenic cells in the testis. Steroidogenesis is an essential mechanism for the development of male characteristics during embryogenesis and puberty and their maintenance throughout adulthood. Therefore, steroidogenesis is tightly regulated by the hypothalamo-pituitary axis, but also directly within the Leydig cell. One mechanism that occurs in Leydig cells is the regulation of steroidogenic gene expression by transcription factors. During my PhD, I have identified MEF2 as new transcription factors present in Leydig cells. These factors are member of the MEF2 family of transcription factors which contains four members: MEF2A, 2B, 2C and 2D. MEF2 factors and more specifically MEF2A and MEF2D factors are present in the MA-10 Leydig cell line and they activate Nr4a1 and Star gene expression. NR4A1 is known as a key regulator of several steroidogenic genes and STAR is essential for the rate-limiting step in steroidogenesis. Furthermore, MEF2 was found to regulate expression of these genes in cooperation with CAMKI, cAMP or forskolin. These molecules are known to mimic the LH activation pathways. Moreover, MEF2 is present in the testis throughout embryonic development and into adulthood whereas MEF2 expression was not detected at any stage in the ovary. This suggests broad roles for MEF2 factors in male gonadal formation and function. To better understand the role(s) of MEF2, microarray experiments were performed using Leydig cells in which MEF2 expression was downregulated by siRNA. These experiments lead to the identification of several new MEF2 target genes in Leydig cells. In conclusion, during my doctoral work, I was able to identify a novel transcription factor in Leydig cells and to characterize its role in these cells.