Note sur les annexes : 3 documents de format excel accompagnant le chapitre 7: Identification of MEF2A, MEF2C, and MEF2D Interactomes in Basal and Stimulated MA-10 Leydig Cells. «The complete list of identified proteins is provided in Supplementary Table S1. Proteins that passed all cutoff criteria are presented in Supplementary Table S2.» «To explore the biological roles of MEF2-interacting proteins, an enrichment analysis was next performed using the ShinyGO 0.80 platform (Ge et al., 2020). The proteins were classified by Gene Ontology (GO) terms and KEGG pathways, using the complete set of proteins identified by LC-MS/MS in our TurboID experiments as the background to reduce selection bias, as recommended by the platform developers. Detailed results are provided in Supplementary Table S3.» / Les cellules de Leydig des mammifères, situées dans l'espace interstitiel des testicules, sont la principale source de testostérone chez les mâles, une hormone nécessaire au développement et au maintien des caractéristiques sexuelles masculines et à la fertilité. Parmi les principaux facteurs de transcription régulant l'expression génique et la stéroïdogenèse dans les cellules de Leydig se trouvent les protéines MEF2 (myocyte enhancer factor 2), qui jouent un rôle important dans la fonction testiculaire, depuis le développement gonadique précoce jusqu'à l'âge adulte. Cependant, les mécanismes d'action par lesquels MEF2 exerce ses effets, notamment par ses interactions avec d'autres protéines dans les cellules de Leydig, restent en grande partie inexplorés. Cette thèse comble cette lacune en étudiant les rôles fonctionnels de MEF2 dans la régulation de l'expression génique et la fonction des cellules de Leydig, en mettant un accent particulier sur l'identification et la caractérisation de ses partenaires moléculaires. La première partie de ce travail, présentée dans le Chapitre 6, a exploré la relation entre MEF2 et la signalisation ERK5 dans les cellules de Leydig, démontrant pour la première fois qu'ERK5 est présent dans ces cellules et joue un rôle clé dans la régulation de la stéroïdogenèse. Nous avons révélé qu'ERK5 coopère avec les facteurs MEF2 dans les cellules de Leydig et, plus spécifiquement, qu'il augmente la transcription du gène *Nr4a1* par MEF2C. Cette coopération dépend de deux motifs de reconnaissance de MEF2 au sein du promoteur de *Nr4a1*. Cette étude identifie ERK5 comme un nouveau régulateur de l'activité de MEF2 dans les cellules de Leydig et fournit de nouvelles pistes potentielles sur les mécanismes régulant l'expression génique et la fonction des cellules de Leydig. La deuxième partie de la thèse, présentée dans le Chapitre 7, implique une analyse approfondie de l'interactome de MEF2 dans les cellules de Leydig dans des conditions basales et stéroïdogéniquement actives. En utilisant la méthode de marquage de proximité TurboID, nous avons identifié des réseaux d'interactions protéine-protéine distincts pour MEF2A, MEF2C et MEF2D. Cette analyse comparative des interactions de MEF2 dans deux états physiologiques différents a fourni de nouvelles perspectives sur la diversité fonctionnelle et les mécanismes régulateurs de MEF2 dans les cellules de Leydig. En résumé, les résultats présentés dans cette thèse élargissent de manière significative notre compréhension des rôles et des mécanismes des facteurs MEF2 dans la biologie des cellules de Leydig, notamment en ce qui concerne leurs réseaux d'interaction. / Leydig cells, located in the interstitial space of the mammalian testes, are the primary source of testosterone in males, a hormone required for the development and maintenance of male sex characteristics and fertility. Among the key transcription factors regulating gene expression and steroidogenesis in Leydig cells are the MEF2 (myocyte enhancer factor 2) family, which have been shown to play an important role in testis function from early gonadal development through adulthood. However, the mechanisms of action by which MEF2 exerts its effects, particularly through interactions with other proteins in Leydig cells, remain largely unexplored. This thesis addresses this gap by investigating the functional roles of MEF2 in regulating gene expression and function in Leydig cells, with a particular focus on identifying and characterizing its molecular partners. The first part of this work, presented in Chapter 6, explores the relationship between MEF2 and ERK5 signaling in Leydig cells, and demonstrates for the first time that ERK5 is present in these cells and plays a key role in the regulation of steroidogenesis. We revealed that ERK5 cooperates with MEF2 factors in Leydig cells and more specifically, enhances MEF2C-driven transcription of the *Nr4a1* gene. This cooperation is dependent on two specific MEF2 binding elements within the *Nr4a1* promoter. This study identifies ERK5 as a new regulator of MEF2 activity in Leydig cells and provides potential new insights into mechanisms that regulate Leydig cell gene expression and function The second part of the thesis, presented in Chapter 7, involves a comprehensive analysis of the MEF2 interactome in Leydig cells under basal and steroidogenically stimulated conditions. Using TurboID-based proximity labeling, we identified distinct protein-protein interaction networks for MEF2A, MEF2C, and MEF2D. This comparative analysis of MEF2 interactions across the two different physiological states has provided novel insights into the functional diversity and regulatory mechanisms of MEF2 in Leydig cells. In summary, the findings presented in this thesis significantly expand our understanding of the roles and mechanisms of MEF2 factors in Leydig cell function, and particularly with regard to their interaction networks.

Les cellules de Leydig sont les principales cellules stéroïdogéniques dans le testicule. La stéroïdogenèse est un mécanisme crucial pour la masculinisation pendant l’embryogenèse et la puberté ainsi que pour le maintien des caractéristiques mâles durant l’âge adulte. Elle est donc finement régulée par l’axe hypothalamo-hypophysaire mais également directement dans la cellule de Leydig. Un des mécanismes majeurs, ayant lieu dans la cellule de Leydig, est la régulation de l’expression des gènes stéroïdogéniques par des facteurs de transcription. Pendant ma thèse, j’ai caractérisé la présence des facteurs de transcription MEF2 dans les cellules de Leydig. Ces facteurs font partie de la famille des facteurs de transcription MEF2 qui compte quatre membres : MEF2A, 2B, 2C et 2D. J’ai mis en évidence que les facteurs MEF2, et plus précisément les facteurs MEF2A et MEF2D, sont présents dans la lignée cellulaire de Leydig MA-10 et qu’ils activent l’expression du gène Nr4a1 ainsi que du gène Star. NR4A1 est connu comme un régulateur de l’expression de gènes stéroïdogéniques et STAR comme réalisant une étape limitante de la stéroïdogenèse. De plus, MEF2 régule l’expression de ces gènes en coopération avec la CAMKI, la forskoline ou l’AMPc. Ces molécules sont connues pour mimer l’activation par la LH ou faire partie d’une des voies activées par la LH. De plus, MEF2 est exprimé dans le testicule tout au long du développement embryonnaire et de la vie adulte mais à aucun de ces stades dans l’ovaire. Ceci suggère un/des rôle(s) bien particulier(s) de MEF2 dans le développement et la fonction de la gonade mâle. Afin de mieux comprendre son (ses) rôle(s), des expériences de micropuces ont été réalisées à partir de cellules de Leydig dans lesquelles l’expression de MEF2 a été diminuée par des petits ARN interférents. Ces expériences ont permis d’identifier des nouveaux gènes cibles de MEF2 dans les cellules de Leydig. Ma thèse a donc permis d’identifier un nouveau facteur de transcription dans les cellules de Leydig et de commencer à décrypter son rôle dans ces cellules. / Leydig cells are the main steroidogenic cells in the testis. Steroidogenesis is an essential mechanism for the development of male characteristics during embryogenesis and puberty and their maintenance throughout adulthood. Therefore, steroidogenesis is tightly regulated by the hypothalamo-pituitary axis, but also directly within the Leydig cell. One mechanism that occurs in Leydig cells is the regulation of steroidogenic gene expression by transcription factors. During my PhD, I have identified MEF2 as new transcription factors present in Leydig cells. These factors are member of the MEF2 family of transcription factors which contains four members: MEF2A, 2B, 2C and 2D. MEF2 factors and more specifically MEF2A and MEF2D factors are present in the MA-10 Leydig cell line and they activate Nr4a1 and Star gene expression. NR4A1 is known as a key regulator of several steroidogenic genes and STAR is essential for the rate-limiting step in steroidogenesis. Furthermore, MEF2 was found to regulate expression of these genes in cooperation with CAMKI, cAMP or forskolin. These molecules are known to mimic the LH activation pathways. Moreover, MEF2 is present in the testis throughout embryonic development and into adulthood whereas MEF2 expression was not detected at any stage in the ovary. This suggests broad roles for MEF2 factors in male gonadal formation and function. To better understand the role(s) of MEF2, microarray experiments were performed using Leydig cells in which MEF2 expression was downregulated by siRNA. These experiments lead to the identification of several new MEF2 target genes in Leydig cells. In conclusion, during my doctoral work, I was able to identify a novel transcription factor in Leydig cells and to characterize its role in these cells.

Chez l’homme, les cellules de Leydig sont les principales productrices d’hormones stéroïdiennes dans le testicule. Ces hormones, dont font partie la testostérone, la dihydroprogestérone (DHP) et la dihydrotestostérone (DHT), sont indispensables à la spermatogenèse, au développement des caractéristiques sexuelles primaires et secondaires ainsi qu'au maintien de la fertilité masculine. Les niveaux d’hormones stéroïdiennes produits par ces cellules doivent être étroitement régulés au cours du développement. En outre, la stéroïdogenèse est source de formation d'espèces réactives de l'oxygène (ERO). La présence d'ERO en excès dans les cellules de Leydig, inhibe la stéroïdogenèse. Notre laboratoire a récemment identifié un nouveau facteur de transcription, myocyte enhancer factor 2 (MEF2), présent dans le testicule, tout au long de la vie. Ce facteur, premièrement identifié dans le cœur et le cerveau, est essentiel à l'organogenèse ainsi qu'à la différenciation cellulaire. Dans un premier temps, mon travail de doctorat met en évidence le rôle clé du facteur MEF2 dans la régulation de l’expression génique dans la lignée de cellules de Leydig MA-10. Dans un second temps, ce travail caractérise le rôle de MEF2 dans la régulation de l’expression des gènes impliqués dans les mécanismes de détoxification cellulaire, qui permettent l’élimination des ERO produites par la stéroïdogenèse. Le facteur MEF2 régule, seul ou en coopération avec la Ca2+/calmoduline-dependent protein kinase I (CAMKI), l’expression du gène Gsta1 qui code pour une enzyme antioxydante, la glutathion-S transférase A1. De plus, MEF2 n’est pas le seul facteur de transcription présent dans les cellules de Leydig et la coopération entre différents facteurs de transcription permet la régulation de l’expression des gènes. Ainsi, dans un troisième temps, mon travail de doctorat met en évidence une nouvelle coopération entre les facteurs de transcription MEF2 et COUP-TFII dans les cellules de Leydig MA-10. MEF2 et COUP-TFII régulent l’expression du gène Akr1c14 codant pour une 3α-hydroxystéroïde déshydrogénase, permettant la régulation des niveaux de DHP et DHT qui sont des stéroïdes métaboliquement très actifs. En conclusion, mes travaux mettent en évidence le rôle du facteur MEF2 sur l’expression des gènes impliqués dans le maintien et la régulation des fonctions stéroïdogéniques des cellules de Leydig. / In male, the Leydig cells are the main producer of steroid hormones in the testis. These steroids, including testosterone, DHT and DHP, are essential for spermatogenesis, for the development of primary and secondary male sexual characteristics and for the maintenance of male fertility. The steroid levels produced by these cells must be tightly regulated throughout fetal and adult life. In addition to synthesizing steroids, steroidogenesis produces a significant amount of reactive oxygen species (ROS), which in turn disrupt steroid production. Our lab has recently identified the presence of a novel transcription factor, myocyte enhancer factor 2 (MEF2), in the mouse testis, throughout fetal and adult life. MEF2 factor is an important regulator of organogenesis and cell differentiation in various tissues and was first identified in the heart and the brain. Initially, my Ph.D. work highlights the key role of MEF2 factor in the regulation of gene expression in the MA-10 Leydig cell line. Secondly, my work characterized the role of MEF2 in the regulation of genes involved in cellular detoxification mechanisms, which seek the elimination of ROS produced by steroidogenesis. The transcription factor MEF2 regulates, alone or in cooperation with the Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase I (CAMKI), the expression of Gsta1 gene that encodes for an antioxidant enzyme, glutathione S-transferase A1. Furthermore, MEF2 is not the sole transcription factor present in Leydig cells and the cooperation between different transcription factors allows for proper regulation of steroidogenic gene expression. Thereby, the third part of my Ph.D. work highlighted a new cooperation between two transcription factors, MEF2 and COUP-TFII in MA-10 Leydig cells. In these cells, MEF2 and COUP-TFII cooperate to regulate Akr1c14 gene expression. This gene encode for a 3α-hydroxysteroid dehydrogenase that regulates the bioavailabilities of DHP and DHT, which are potent steroids. In conclusion, my work identifies novel important roles for MEF2 factor in the expression of genes involved in the maintenance and regulation of Leydig cell functions.

Des cellules de Leydig fonctionnelles sont indispensables au maintien du phénotype mâle et à la spermatogenèse. Le bon développement des cellules de Leydig dépend d'une expression génique spécifique à chaque stade de développement. Cette expression génique est finement régulée par différents facteurs de transcription. Dans les cellules de Leydig, on retrouve 3 des 4 facteurs de transcription MEF2 (MEF2A, 2C et 2D). Leurs rôles dans ces cellules demeurent peu étudiés. Sachant que ces facteurs sont primordiaux pour le développement et le maintien d'autres tissus, nous proposons que les facteurs de transcription MEF2 seraient impliqués dans le développement et la fonction des cellules de Leydig. Une analyse transcriptomique de cellules de Leydig déficientes en facteurs MEF2 avait identifié des gènes dont l'expression était réduite. Une étude in vitro impliquant des essais d'activité promotrice d'un de ces gènes, le gène Bmal1, a permis d'étudier l'implication des MEF2 dans l'expression de ce gène. Les mécanismes de régulation et d'activation des facteurs MEF2 suite à une stimulation des cellules de Leydig ont également été étudiés. Ainsi, les niveaux d'ARNm et de protéines des facteurs MEF2 ont été quantifiés suite à divers traitements hormonaux. Les résultats préliminaires révèlent que les niveaux des facteurs MEF2 ne sont pas affectés par les différents traitements. Un autre aspect du projet visait à mettre au point une approche qui permettra éventuellement d'étudier les rôles des facteurs MEF2 in vivo chez la souris. Puisque trois facteurs MEF2 sont présents dans les cellules de Leydig, une approche d'invalidation génique classique des trois gènes simultanément est difficilement envisageable. Nous avons donc choisi d'utiliser une approche de dominant négatif actif qui permettrait d'établir l'importance des facteurs MEF2 dans le développement des cellules de Leydig. Les résultats préliminaires obtenus lors de validations dans des cellules de Leydig démontrent l'utilité de cette approche. / Functional Leydig cells are indispensable for spermatogenesis and for the development and maintenance of a male phenotype. Proper development of Leydig cells depends on specific gene expression. Gene expression is finely regulated by different transcription factors. In Leydig cells, we have identified 3 of the 4 MEF2 transcription factors (MEF2A, 2C and 2D). Their role in these cells remains to be fully characterized. Considering that these factors are indispensable for the development and function of other tissues, we propose that MEF2 factors play similar roles in the development and function of Leydig cells. Transcriptomic analysis of MEF2-deficient Leydig cells revealed several down regulated genes. An in vitro study of the activity of a promoter for one of those genes, Bmal1, allowed the study of the implication of MEF2 in the expression of that gene. The regulation of MEF2 expression and activation in response to different treatments of Leydig cells in culture was also studied. The mRNA and protein levels for MEF2 factors were quantified following various treatments. Preliminary results indicated that MEF2 levels are not affected by these treatments. Another aspect of the project was to develop an approach that would eventually be used to study the roles of MEF2 transcription factors in Leydig cell development and function in a mouse model. Since three MEF2 transcription factors are present in Leydig cells, a conventional knockout approach of all three genes simultaneously was difficultly achievable. Therefore, we chose an inducible, conditional, active dominant negative MEF2 model, in order to allow us to establish the importance of MEF2 factors in Leydig cells. Preliminary results obtained during validation in a Leydig cell line support the usefulness of this approach.