Le mode de vie moderne a conduit à la contamination des lieux de vie domestique, professionnel et alimentaire par de nombreuses molécules chimiques de familles très variées (médicaments, pesticides, polluants industriels…). Ces produits peuvent jouer le rôle de perturbateurs du système hormonal, notamment au niveau du testicule. Les effets de ces produits sur la santé humaine sont très fréquemment exposés dans les médias ces dernières années, traduisant les inquiétudes et l’enjeu majeur de santé publique que représente l’étude de ces polluants chez les humains. Depuis quelques années, l’étude de certains paramètres de la fonction reproductrice masculine a montré une augmentation des cas de cancers testiculaires, malformations génitales ainsi qu’une diminution de la qualité du sperme. Afin d’expliquer ces constatations, l’hypothèse d’une exposition pendant la vie fœtal à ces perturbateurs endocriniens est la plus communément avancée. Cette thèse se propose d’étudier les conséquences d’une exposition à des mélanges de perturbateurs endocriniens présents dans l’environnement sur le testicule humain fœtal et adulte. Les résultats obtenus ont permis : 1) d’accroître la connaissance sur la santé reproductive de molécules jusqu’alors peu étudiées, 2) de mettre en évidence des effets combinés de molécules lorsqu’elles sont mélangées. Ces effets sont retrouvés de l’âge fœtal à l’âge adulte et posent ainsi la question des fenêtres critiques d’exposition. Nous avons montré pour la première fois sur un tissu humain complet que les effets des mélanges expérimentalement obtenus sont prévisibles par l’utilisation de la théorie de l’additivité des doses. Nous avons également pu mettre en évidence que l’effet anti-androgénique des molécules mélangées est potentialisé lors d’exposition multiple. Ces résultats, permette d’entrevoir une meilleure évaluation du risque cumulé pour des polluants environnementaux et chimiques. Ce travail ouvre la voie à une évaluation du risque cumulé entièrement prédictives, le test de toutes les combinaisons possibles devenant inutile. / A number of chemicals are capable of disrupting androgen production, but the possibility that they might act together to produce effects larger than those of the most effective component in the mixture has never been studied directly in human tissues. Suppression of androgen synthesis in fetal life can contribute to testis maldescent, malformations of the genitalia and poor semen quality. By using an organotypic culture system of human fetal testes, we conducted an unprecedented screening exercise in which 27 chemicals were tested for their possible anti-androgen effect. We demonstrate that several previously untested chemicals such as the pesticides imazalil and propiconazole and the industrial chemical bisphenol S (BPS), together with pharmaceuticals and pesticides, act jointly to exacerbate suppression of testosterone synthesis in the human fetal testis. This leads to considerable downward shifts of dose-response curves towards lower doses, at a particularly sensitive time when male sexual development is initiated. Our work reveals previously unrecognized risks to the developing fetus and provides the foundations of a predictive human mixture risk assessment approach. Our studies highlight concerns about the use of pharmaceutical in mixture during pregnancy and the impact on reproductive human health of multiple chemical exposure.

Les écosystèmes aquatiques constituent la destination finale des contaminants. Les organismes aquatiques sont ainsi impactés par un cocktail de molécules, dont les produits phytosanitaires. Le caractère perturbateur endocrinien (PE) de certains d’entre eux est particulièrement préoccupant. La présente étude explore les effets de pesticides modèles à potentiel PE – la chlordécone (CLD) et le pyriproxyfène (PXF), seuls et en mélange – chez le copépode estuarien Eurytemora affinis par des approches écotoxicogénomiques innovantes. En réponse aux PE, l’accent a été porté sur les effets de ces composés sur la reproduction, la croissance ou le développement. En parallèle, l’affinité des pesticides aux récepteurs aux oestrogènes et aux androgènes humains d’une part, et aux ecdystéroïdes d’autre part, a été étudiée grâce à des outils bio analytiques afin d’évaluer la pertinence de l’utilisation du potentiel PE défini par les tests cellulaires comme critère d’exclusion dans la réglementation européenne des pesticides. Ces travaux de thèse présentent, pour la première fois, les transcriptomes et protéomes d’E. affinis après exposition aux PE. Un effet sexe-dépendant a été observé par les deux approches « omics » révélant un plus fort impact des composés sur les copépodes mâles. Des gènes et protéines, impliqués dans le processus de mue et dans la gamétogénèse ont été identifiés comme candidats pour le développement de biomarqueurs moléculaires de PE chez les crustacés. Les tests cellulaires ont permis de mettre en évidence des interactions entre les contaminants et les récepteurs hormonaux. Toutefois, le screening de molécules par les tests YES/YAS/anti-YES/anti-YAS s’est heurté à quelques limites d’interprétations. Enfin, les résultats du test S2 EcR, souligne la pertinence de l'utilisation couplée de tests spécifiques d’un système endocrinien de vertébrés et d’invertébrés dans l’évaluation du risque des composés PE. / Aquatic ecosystems constitute the chemicals’ final destination. Among the xenobiotics, endocrine disruptors (ED) are compounds of major concern. In this context, ED pesticides effects were investigated in the widespread copepod Eurytemora Affinis using ecotoxicogenomics technics. In response to PE pesticides, focus was made on reproduction, growth and development. In order to evaluate the endocrine activity, in vitro tests (YES/YAS/anti-YES/anti-YAS and S2 EcR) were used to screen the compounds alone and in mixtures. These results were discussed to evaluate the “cut off criterion” used in European assessment. This work presents for the first time, transcriptomes and proteomes of E. affinis after PXF and CLD –alone and in binary mixture- exposure. A sex dependent effect was observed by the two “omics” approaches. Male copepods were more impacted by contaminants than female copepods. Genes and proteins (e.g. chitin deacetylase, kelch protein) were identified as candidates for the development of ED molecular biomarkers. In vitro tests highlighted binding of pesticides with both vertebrate and invertebrate receptors. However, a toxicity for the highest concentrations tested and some limits for the interpretation of mixtures results were limiting in YES/YAS/anti-YES/anti-YAS assays. The last observation represents particularly a major concern for interpretation of the ED mode of action of environmental matrix. S2 EcR highlighted some complementary results about the mode of action of chemicals alone and in binary mixtures. These results accentuate the need to combine vertebrate specific test and invertebrate specific test in ED risk assessment.

L’alimentation peut être à l’origine d’une exposition aux xénobiotiques. Les différentes étapes entre la production et la consommation peuvent être sources de contaminations de cet aliment. L’objectif de ce travail de thèse est de vérifier deux toxicités s’exprimant à faible dose : la génotoxicité et la perturbation endocrinienne. Les xénobiotiques étudiés sont une dioxine (la TCDD, polluant de l’environnement), le glyphosate et ses formulations de Roundup (pesticides), le 5-hydroxyméthylfurfural (molécule néoformée) et le bisphénol F (contaminant d’emballage). Le modèle cellulaire choisi est la lignée cellulaire HepG2, issue d’un hépatocarcinome d’origine humaine. Ces cellules sont un modèle pertinent car elles possèdent des capacités métaboliques bien caractérisées et que les contaminants étudiés sont tous hépatotoxiques. Les résultats ont permis de montrer, avec un test d’activation transcriptionnelle, que les quatre formulations de Roundup étaient antioestrogèniques et antiandrogèniques. Le glyphosate ne présentait que des effets antiandrogèniques. De plus, les formulations modifient l’activité de l’aromatase dans les cellules HepG2. Après quatre heures de contact, le Roundup à 400 g/L présente des effets génotoxiques mais non liés à un stress oxydatif, dans le test des comètes. Il présente également des effets apoptotiques. Les différences observées entre les formulations et les différents éléments de la formulation (le glyphosate et l’adjuvant POEA) suggèrent un « effet mélange ». Le modèle HepG2 a également permis de montrer que le 5-HMF est une molécule progénotoxique à des concentrations non cytotoxiques dans le test des comètes. De plus, il a permis de mettre en évidence le fait que le BPF est la molécule la plus active en matière de génotoxicité et de perturbation endocrinienne, par comparaison avec ses métabolites. Parallèlement, la mise en place d’un modèle stablement transfecté issu des cellules HepG2 a été initiée pour vérifier les potentiels effets (anti)oestrogèniques. Parallèlement, les mécanismes cellulaires et moléculaires à l’origine des effets toxiques observés ont été étudiés. Ainsi, il a été montré que les cellules HepG2 métabolisent le BPF (30% à 25 μM) en sulfoconjugué alors que les hépatocytes humains le métabolisent en sulfoconjugué et/ou glucuroconjugué (100% à 25 μM) avec une différence interindividuelle. Enfin, il a été vérifié, in vitro et dans les conditions expérimentales de l’étude le rôle de ERalpha dans les effets toxiques de la TCDD. Ainsi, un effet anti-oestrogènique de la TCDD sur ERE et un effet potentialisateur de E2 sur l’effet de la TCDD sur XRE ont été mis en évidence. Les tests in vitro ont permis la mise en évidence d’effets toxiques de contaminants de l’alimentation et ont ainsi leur place dans l’évaluation du risque. / Food can expose Human to xenobiotics. Indeed, the various steps between production and consumption can be at the origin of food contaminations, either with natural or chemical substances. The objective of this work was to test two toxicities exhibited at low doses: genotoxicity and endocrine disruption. Xenobiotics studied are a dioxin (TCDD, environmental pollutant), glyphosate and different Roundup formulations (pesticides), 5-hydroxymethylfurfural (neoformed compound) and bisphenol F (food packaging contaminant). The model is the HepG2 cell line derived from a human hepatocarcinoma. These cells are chose because they have well-characterized metabolic capacities and all contaminants studied are hepatotoxic. Using transcriptional activation assay, we have shown that the four formulations of Roundup were anti-estrogenic and anti-androgenic. Glyphosate was only anti-androgenic. Furthermore, formulations were able to modify the aromatase activity in HepG2 cells. After 4 hours of contact, the formulation at 400g/L induced genotoxic effect (comet assay) which was not correlated to an oxidative stress or an apoptotic effect (caspase 3,7 activation). The differences observed between the formulation and its components (glyphosate and POEA) suggest a “mixture effect”. We have shown that 5-HMF is a progenotoxic molecule at noncytotoxic concentrations in the comet assay. Also, we have demonstrated that BPF is the most active molecule in genotoxicity and endocrine disruption assays compared to its metabolites. In parallel, the establishment of a stably transfected HepG2 cell line in order to assess the potential (anti)estrogenic effects was initiated.Cellular and molecular mechanisms involved in the toxic effects was also studied. Thus, HepG2 cells metabolized BPF to sulfate metabolite (30% at 25μM), whereas human hepatocytes produced the sulfate and / or glucuronide conjugates (100% at 25μM) with aninterindividual difference. Finally, in vitro and in our experimental conditions, the role of ERin the toxic effects of TCDD was investigated. Using transcriptional activity, TCDD was shown anti-estrogenic on ER. Furthermore, a potention of E2 on transcriptional activity of TCDD induced via AhR was demonstrated. Finally, in vitro assays was used to assess xenobiotic toxicity. They are relevant to in risk assessment.

L’objectif de cette thèse était de développer des biomarqueurs de neurotoxicité (l’activité des cholinestérases) et de perturbations endocriniennes en lien avec la reproduction (la synthèse de vitellogénine) chez l’amphipode d’eau douce Gammarus fossarum. G. fossarum ne possède qu’une isoforme de cholinestérase de type acétylcholinestérase (AChE). Les facteurs biotiques ont été montrés comme la principale source de variabilité naturelle de l’activité AChE chez cette espèce. Ainsi, la sélection d’organismes de phénotype mâle avec un poids de 15-20 mg a permis de proposer une méthodologie de dosage fiable et robuste. Une valeur de référence et une valeur seuil ont été décrites. Ces travaux ont également permis de montrer qu’il n’existe aucune relation entre l’inhibition de cette activité enzymatique et la mortalité. En revanche, une relation directe a été observée entre l’activité AChE et le comportement. Enfin, l’utilisation couplée de tests in situ et de la mesure de l’activité AChE s’est révélée être un outil pertinent pour évaluer l’impact de composés anti-cholinestérasiques. La description des processus physiologiques, liés au cycle de reproduction des femelles (cycle de mue, croissance des ovocytes et développement embryonnaire), a apporté les bases pour le développement de l’expression de la Vtg comme biomarqueur. Cela nous a également permis de développer un bio-essai de reprotoxicité reproductible et robuste avec une faible variabilité des valeurs de base. Les niveaux d’expression du gène Vtg observés chez les femelles étaient de 200 à 700 fois plus élevés que chez les mâles. Les femelles présentent une importante élévation de la synthèse de Vtg au cours de leur cycle de reproduction, concordante avec la mise en place de la vitellogénèse secondaire. L’induction de l’expression du gène Vtg a été observée chez des mâles exposés, en laboratoire, à des perturbateurs endocriniens modèles et chez des individus exposés in situ sur des sites anthropisés / The aim of this works was to develop specific biomarkers of neurotoxicity (cholinesterase activity) and endocrine disruptions linked to reproduction (vitellogenine synthesis) in freshwater amphipod Gammarus fossarum. G. fossarum owns only an isoforme of cholinesterase of type acetylcholinesterase (AChE). Biotic factors have been shown as the main source of natural variability of the activity AChE in this species. Therefore, the selection of organisms with male phenotype and a body-weight of 15-20 mg allowed to propose a methodology of reliable and strong dosage. A reference value and a threshold value were described. Our works on the AChE, also demonstrated that there is no relation between the inhibition of this enzymatic activity and the mortality. On the other hand, a direct relation was observed between the activity AChE and behaviours. Finally, the coupled use of in situ bioassays and measure of the activity AChE showed to be a relevant tool for the environmental assessment of anti-ChE compound impact. The description of the physiological processes, bound to the reproduction cycle of females (moult cycle, oocyte growth and embryonic development), brought bases for the development of the Vtg gene expression as biomarker. It also allowed to develop a robust and reproducible reprotoxicity-test displaying a very weak variability of the basic values observed in the non-impacted organisms. Females present an important rise of the Vtg synthesis during their reproduction cycle, corresponding with the implementation of the secondary vitellogenesis process. The induction of the Vtg gene expression was observed in males exposed in laboratory to model endocrine disrupters and in organisms exposed in situ, in areas subjected to an anthropological pressure

Depuis plusieurs décennies, le rôle des expositions environnementales dans l’apparition des anomalies de la reproduction suscite l’intérêt de la communauté scientifique. La période prénatale est une phase critique du développement et l’exposition à des substances chimiques au cours de la grossesse pourrait avoir des conséquences sur la santé de l’enfant et de l’adulte. De nombreuses études chez l’animal ont mis en évidence que diverses molécules chimiques étaient toxiques pour la reproduction et le développement et que certaines d’entre elles étaient capables d’interférer avec le système endocrinien. Chez l’Homme, les effets de l’exposition prénatale à des substances susceptibles d’altérer l’équilibre hormonal du fœtus restent mal documentés. L’objectif de ce travail de thèse est d’étudier l’effet de l’exposition prénatale à certains polluants chimiques en s’intéressant à deux indicateurs d’anomalie du développement du système reproducteur à la naissance : les niveaux d’hormones sexuelles et les malformations congénitales de l’appareil génital du garçon. Ce travail s’appuie sur les données issues de cohortes mère-enfants françaises ayant recruté des femmes enceintes au cours de leur grossesse et pour lesquelles des prélèvements biologiques ont permis la mesure de l’exposition. Les classes chimiques plus spécifiquement étudiées dans cette thèse comprennent les polluants organiques persistants (polychlorobiphényles, pesticides organochlorés et retardateurs de flamme bromés) et les éthers de glycol, une classe de solvants oxygénés. Les études menées mettent en évidence des effets sur le développement du système reproducteur, potentiellement associés à des mécanismes de perturbation endocrinienne, en lien avec l’exposition prénatale aux deux familles de polluants étudiées. Des modifications des niveaux d’hormones sexuelles sont observées en association avec l’exposition prénatale à divers polluants organiques persistants. L’exposition prénatale à certains éthers de glycol est associée à une augmentation du risque d’hypospade ainsi qu’à des modifications des niveaux d’hormones sexuelles. Ces résultats mettent en évidence les effets d’expositions prénatales à des polluants chimiques ubiquitaires, sur le système endocrinien du fœtus. / From last decades, researchers had increased interest about the impact of environmental exposure on reproductive impairments. The fetal life is a crucial period of development and exposure to chemical during gestation may lead to adverse health outcomes at birth or later in life. Several toxicological studies have reported that some chemicals are reproductive and developmental toxicants and that some of them are able to interact with the endocrine system. In humans, evidence about the endocrine effects of these molecules is limited. The aim of this thesis is to study the effect of prenatal exposure to chemicals on two endocrine-sensitive endpoints at birth: sex hormone levels and congenital anomalies of the genitalia. This work is based on data collected in two French mother-child cohorts that included pregnant women during pregnancy and collected biological samples to perform exposure assessment. Two chemicals classes are studies including persistent organic pollutants (polychlorinated biphenyls, organochlorine pesticides, and polybrominated diphenyl ethers) and glycol ethers, a class of oxygenated solvent. The studies conducted show effects of prenatal exposure to both classes of chemicals on endocrine-sensitive endpoints related to reproductive health. Modifications of sex hormone levels are observed in association with exposure to various persistent organic pollutants. Prenatal exposure to some glycol ethers is associated with an increased risk of hypospadias and with modifications of sex hormone levels. These results highlight the effect of prenatal exposure to ubiquitous chemicals, on the endocrine system of the fetus.

L'utilisation en routine de biomarqueurs pour la biosurveillance environmentale présente plusieurs limitations, en particulier chez les invertébrés. Parmis ces limitations, la manque de biomarqueurs spécifiques et de approches multibiomarqueurs sont des contraintes majeurs. En se basant sur les catalogues de gènes et protéines obtenus à partir des études proteogénomiques réalisées antérieurement chez l'espèce clé en écotoxicologie Gammarus fossarum, cette thèse a visé l'identification et validation de biomarqueurs moléculaires pour le diagnostic de perturbations toxiques chez cette espèce. À la suite des méthodologies récentes pour le développement de biomarqueurs en santé humaine, nous avons mis en place un dosage multiplexé rapide et spécifique (en utilisant la spectrométrie de masse Selected Reaction Monitoring) pour quantifier simultanément des dizaines de candidats biomarqueurs protéiques. L'éssai a été appliqué pour l'évlauation de l'importance physiologique des candidats et de sa pertinence comme biomarqueurs à travers des expositions à des polluants chimiques au laboratoire et sur le terrain. Le deuxième axe de cette thèse a visé le développement de biomarqueurs spécifiques d'une perturbation endocrinienne via deux approches. La première approche, basée sur un étude de protéomique comparative avec un perturbateur endocrinien connu chez les arthropodes, a permis d'augmenter l'exhaustivité dans le suivi du protéome avec la détection d'environ 4000 protéines (dont 53 modulés par l'exposition). La deuxième approche a compris des recherches d'homologies de séquence, des analyses phylogénétiques, et des études d'expression de gènes pour proposer des candidats biomarqueurs / The routine use of biomarkers in environmental biomonitoring faces several drawbacks, especially in invertebrates. Among these limitations, the lack of validated species-specific biomarkers and multibiomarker methodologies comprise major constraints. Based on gene and protein catalogs obtained from proteogenomics experiments previously performed on the ecotoxicological-relevant species Gammarus fossarum, this thesis aimed at identifying and validating molecular biomarkers for the diagnostic of toxic perturbations in this species. Following recent methodologies for the development of biomarkers in human disease diagnosis, we implemented a fast, specific, quantitative multiplexed targeted proteomics assay (using Selected Reaction Monitoring mass spectrometry) to study dozens of protein biomarker candidates simultaneously. The assay was applied to assess the physiological importance of protein candidates, and to assess their pertinence as biomarkers after laboratory and field exposures to chemical contamination. The second part of this thesis aimed at the development of specific endocrine disruption biomarkers, through two complementary approaches. The first approach, based on a comparative shotgun proteomic analysis using a known endocrine disruptor for arthropods, allowed exhaustively increasing the whole-proteome analysis through the detection of roughly 4000 proteins (53 modulated by the exposure). The second comprised sequence homology searches, phylogenetic analyses, and gene expression studies for proposing new biomarker candidates identified from literature searches

De façon à maximiser leur valeur sélective, les individus doivent prendre différentes décisions qui doivent concorder aux conditions environnementales (se reproduire ou pas ? quand ? quel investissement parental ?). Ces décisions sont fortement influencées par la sécrétion de certaines hormones comme l’hormone lutéinisante (LH) déclencheur de la reproduction, l’hormone de stress (CORT) et la prolactine (PRL), pour l’expression des soins parentaux. Les contaminants chimiques et naturels sont omniprésents et ont même été retrouvés en zones polaires. De nombreux contaminants sont des perturbateurs endocriniens et pourraient altérer les décisions de reproduction, mais les preuves manquent pour la faune sauvage. Cette thèse vise donc à identifier les liens entre certains polluants organiques persistants dits ‘d’héritage’ (POPs : PCBs, pesticides organochlorés), le mercure (Hg) et les hormones LH, CORT et PRL chez plusieurs espèces d’oiseaux marins arctiques et antarctiques. Les résultats obtenus ont démontré que ces contaminants interagissent avec ces hormones, et de façon spécifique : le Hg réprimerait la sécrétion d’hormones hypophysaires (LH, PRL) tandis que les PCBs stimuleraient la production de CORT. Plus précisément, le Hg pourrait affecter la sécrétion de LH en réprimant l’apport de GnRH à l’hypophyse et les PCBs pourraient stimuler le nombre de récepteurs à l’ACTH au niveau des glandes surrénales. Le Hg et les PCBs peuvent donc altérer les décisions de reproduction et impacter la valeur sélective : des taux élevés de Hg sont associés à la suppression de la reproduction et à un moindre investissement parental, tandis que la présence de PCBs pourrait exacerber la susceptibilité au stress environnemental. Les conséquences à long terme de l’exposition des oiseaux marins à ces contaminants sont discutées dans le cadre des changements globaux qui affectent les pôles. / In order to maximise fitness, individuals will have to take several decisions that shall match with environmental conditions (whether to breed or not, when to breed, what level of parental investment). These decisions are mediated by hormones : such as luteinizing hormone (LH), a pituitary hormone involved in the onset of breeding, stress hormones (corticosterone, CORT) and prolactin (PRL) a pituitary hormone involved in the expression of parental care. Environmental contaminants are present world-wide, and also in Polar Regions. Since many contaminants are endocrine disruptors, they may impair breeding decisions, but evidences are scarce for wildlife. The aim of this thesis was to assess the relationships between some legacy persistent organic pollutants (POPs : PCBs, organochlorine pesticides), mercury (Hg) and hormones (LH, CORT, PRL) in different Arctic and Antarctic seabird species. Results show that POPs and Hg clearly interact with LH, CORT and PRL secretion. These contaminants appear to target different hormones : increasing Hg was related to decreasing pituitary hormone secretion (LH and PRL) ; whereas increasing PCBs were linked to an exacerbated CORT response to an acute stress. Hg disrupted LH secretion by probably suppressing GnRH input to the pituitary ; PCBs seem to act at the adrenal level by probably stimulating ACTH receptors. Legacy POPs and Hg are therefore able to disrupt reproductive decisions and to impact fitness : elevated Hg levels were linked to skipped reproduction and poor incubation behavior ; elevated PCB levels may make individuals more susceptible to environmental perturbations. The long-term consequences of contaminant exposure for seabirds are discussed in the context of the environmental challenges affecting polar regions.