Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται παγκοσμίως επιδείνωση των επιδη­μιο­λογικών δεικτών της φυματίωσης με αποτέλεσμα την αναζοπύρωση του διε­θνούς ενδιαφέροντος έρευνας που αφορά τη διακοπή μετάδοσης της αλυσί­δας των μυκοβακτηριδιακών λοιμώξεων. Κύριο στοιχείο ελέγχου και περιστολής της νόσου αποτελεί η αναζήτηση και θεραπεία των πασχόντων με θετικά πτύελα έτσι ώστε να καταστεί δυνατή η διακοπή μετάδο­σης των μυκοβακτη­ριδίων. Τα μικρά ποσοστά της άμεσης μικροβιο­λο­γι­κής επιβεβαίω­σης μιας κλινικής διάγνωσης, η καθυστέρηση των καλλιεργειών λόγω μεγάλου χρόνου επώασης καθώς και το χρονοβόρο και ανεπαρκές των κλασσικών μεθόδων ελέγχου ευαισθησίας στα διάφορα αντιφυματικά φάρμα­κα επιβάλ­λουν συνεχή έρευνα προς ανεύρεση γρήγορων και ευαίσθητων διαγνωστικών μεθόδων. Στην παρούσα μελέτη μελετήθηκαν 3.500 δείγματα προερχόμενα από ασθε­νείς της πενταετίας 1999-2003 που προσήλθαν στο Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Πατρών καθώς και στο Ειδικό Νοσοκομείο Νοσημάτων Θώ­­ρακος Δυτικής Ελλάδος με σκοπό την ανεύρεση μυκοβακτηριδίων (Myco­bacterium spp.). Η μελέτη περιελάμ­βα­νε: α) άμεσο έλεγχο σε παρασκεύα­σμα μετά από οξεάντο­χη χρώση Ziehl-Neelsen (ΖΝ) για ανεύρεση οξεά­ντοχων και αλκοολάντοχων βακτηρίων (Acid Fast Bacteria –AFB) σε ποι­κίλα δείγματα του αναπνευ­στικού, αλλά και από άλλα στείρα υγρά σώ­μα­τος, και β) τη μο­ριακή μέθοδο COBAS AMPLICOR αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (CA PCR). Η ευαισθησία, η ειδικότητα, η θετική και αρνητική προγνωστική αξία της CA PCR καθο­ρίστηκε μεταξύ AFB-θετικών και AFB-αρνητικών δειγ­μάτων. Υψηλή ευαισθησία της CA PCR παρατηρήθηκε μεταξύ όλων των AFB-θετικών δειγμάτων, ενώ τα δείγματα πτυέλων που ελήφθησαν μετά από βρογχοσκό­πη­ση (ΜΤΒ-πτύελα) θεωρήθηκαν τα πλέον κατάλληλα δείγματα με ευαισθη­σία 70% και ειδικότητα 98,6% μεταξύ των AFB-αρνητικών δειγμάτων. Η αύξηση τα τελευταία χρόνια της ανθεκτικότητας στελεχών του Μ. tuberculosis καθιστά αναγκαία την καλλιέργεια και την ευαισθησία στα αντιφυ­μα­­τικά φάρ­μακα. Για το σκοπό αυτό, μετά από ειδική επεξεργασία των κλινι­κών δειγ­μά­των (ρευστοποίηση και εμπλουτισμό) σύμφωνα με το πρωτόκολλο της εται­ρείας Becton Dickinson BBL MycoPrep, ακολούθησε καλλιέργεια η οποία έγινε ταυτόχρονα με δυο μεθόδους: α) σε στερεό θρεπτικό υλικό Löwentein-Jensen (L-J BioMerieux, SA Lyon, France), και β) σε φιαλίδια BACTEC MYCO/F Becton-Dickinson για γρήγορη ανί­χνευση με το αυτόματο σύ­στημα BACTEC 9000 ΜΒ. Θετικές καλλιέργειες προερχόμενες και από τις δύο μεθό­δους επιβεβαιώθηκαν με τρεις τρόπους: α) χρώση (Ζ-Ν) του παρασκευά­σματος για οξεάντοχα και αλκοολάντοχα βακτηρίδια (AFB) β) ανακαλλιέργεια σε L-J και γ) CA PCR. Ακολούθησε ταυτο­ποίηση ειδών Mycobacterium spp: α) με βιο­χημικές δοκιμασίες (παραγωγή νιασίνης – παραγωγή θερμοανθεκ­τι­κής καταλάβης), και β) με μεθόδους μοριακής βιολογίας (PCR και υβριδισμό Genotype Mycobacteria). Σε 88 ΜΤΒ απομονωθέντα στελέχη από διαφο­ρε­τι­κούς ασθενείς τα οποία ταυτοποιήθηκαν με PCR και υβρι­δι­σμό, εφαρμό­στηκε δοκιμασία ευαισθησίας στα τέσσερα πρώτης επιλο­γής αντιφυματικά φάρμακα (INH, RIF, STR, EMB) με τρεις διαφορετικές μη αυτόματες μεθόδους: τη μέθοδο αναλογιών σε άγαρ (ΜΟΡ), την MGIT και το E-test. Καλή συμφωνία αποτελεσμάτων σημειώθηκε μεταξύ E-test και ΜΟΡ για την ΙΝΗ και RIF, ενώ μεταξύ των μεθόδων MGIT και ΜΟΡ παρατηρήθηκε καλή συμφωνία για την ΙΝΗ, RIF και STR. Έτσι, ενώ η ΜΟΡ παραμένει μέθοδος εκλογής, αν και χρο­νο­βόρα, εν τούτοις η MGIT παρουσιάζει μεγάλη ευαισθησία και είναι τα­χύ­τερη. Η εφαρμογή νέων αξιόπιστων τεχνικών μειώνει εντυπωσιακά το χρό­­νο έκδοσης αποτελεσμάτων όσον αφορά τις λοιμώξεις από Mycobacterium spp., την ταυτοποίηση και τον έλεγχο αντοχής στα αντιφυ­μα­τικά φάρμακα έτσι ώστε η πρόγνωση της νόσου όσον αφορά την εργα­στη­ριακή διάγνωση της φυμα­τίω­σης και την παρακολούθηση της θεραπείας βελτιώνεται σημαντικά. / Re-emergence of tuberculosis in combination with the appearance of multidrug-resistant strains in recent yearsintensifies the need for application of rapid methods for the identification of mycobacteria. Even though staining for acid-fast bacilli (AFB) to identify Mycobacterium tuberculosis complex (MTB) is usually performed in the first 24 h of specimen receipt, it is considered a method of low sensitivity. Although time consuming, the standard detection method remains the culture of specimens with optimum results obtained after application of both solid and liquid media.The use of nucleic acid amplification techniques provides a sensitive and specific approach for the identification of MTB directly in clinical specimens. The Cobas Amplicor polymerase chain reaction for MTB (CA PCR, Roche Diagnostic Systems, Inc., Branchburg, N.J., USA) is a system that combines specimen processing with automated amplification and detection, easily adopted by a clinical laboratory. In the present study, the sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of CA PCR and culture results of AFB-positive and AFB-negative respiratory specimens obtained by different means (expectoration, bronchoscopy, expectoration after broncho­scopy, lavages and aspirations), as well as in samples from normally sterile body fluids, were evaluated. A total of 3414 specimens from 2365 patients (1 to 3 specimens/patient) with clinical suspicion of tuberculosis were processed during the study period (1999-2003) by the Microbiology Laboratory at the University Hospital of Patras. The respiratory specimens consisted of 684 sputa, 1473 bronchoalveolar lavages (BAL), 625 sputa expectorated after bronchoscopy (SAB), 296 tracheal aspirations (TA) and 189 pleural fluids. Furthermore,23 gastric aspirates and 124 samples ofsynovial, pericar­dial, peritoneal and cerebrospinal fluids (CSF) were also examined in the present study. All specimens were processed according to conventional procedures for identification of mycobacteria; cultures were performed by inoculation of sediments directly on Löwenstein-Jensen slants (L-J, bioMerieux, SA Lyon, France) and in BACTEC MYCO/F-Sputa and BACTEC MYCO/F LYTIC culture vials (Becton Dickinson). Statistical analysis was conducted using the SPSS v.12.0 software package for Windows (SPSS Inc.). Comparison of Z-N and PCR results were expressed by means of percent agreement and Kappa statistic. Highest sensitivity of CA PCR was observed among all positive AFB samples, whereas sputa collected after bronchoscopy were the most appropriate specimens, showing 70% sensitivity and 98.6% specificity, among the AFB-negative samples. The increase of M. tuberculosis infections is a global health problem in terms of both the disease and resistance to commonly used drugs. For the reason of continuing develop­ment of resistance and especially multidrug-resistance of M. tuberculosis (MDR), Microbiology Laboratories should provide reliable antibiotic suscep­tibility testing results in the minimum of time. In the present study, antimy­co­bacterial drug susceptibility testing (AST) was performed on 88 non-replicate M. tuberculosis clinical isolates, using the Mycobacterium Growth Indicator Tube (MGIT) System and Etest as compared to the method of proportion (MOP), in order to evaluate the potential application of these manual methods in the routine diagnostic laboratory. Obtained results among four antituberculous agents, isoniazid (INH), rifampin (RIF), ethambutol (EMB) and streptomycin (STR) were compared. Isolates were recovered from different patients and were identified at species level by PCR and hybridization. Resistance to INH was detected in 20.5%, 29.5% and 12.5% of the isolates, followed by STR resistance (19.3% 26.1% and 1.1%), RIF (9.1%, 4.5% and 5.7%) and EMB (2.3%, 11.4% and 2.3%) as showed by the MOP, MGIT and Etest, respe­ctively. Sensitivity of the manual MGIT ranged from 37.5% for RIF resistance to 100% for EMB, while sensitivity of Etest ranged from 5.9% for STR to 62.5% for RIF. In conclusion, whilesputum samples and BAL are the preferable clinical specimens for MTB recovery, sputa expectorated after bronchoscop are those showing the highest sensitivity by PCR, both among Z-N-positive and negative specimens. The combination of Z-N and CA PCR including internal control of collected after bronchoscopy from a patient with clinical signs of infectionundoubtedly contribute to the early diagnosis of tuberculosis. According to our data, the sensitivity of the manual MGIT is higher in testing resistant isolates compared to Etest, with the exception of rifampin. On the other hand, Etest shows higher specificity as well as higher positive predictive values and it may be used for testing rifampin resistance. However, for a routine Clinical Microbiology Laboratory, among the manual methods tested, the method of proportion remains the “gold standard” even though a longer incubation period is needed.