Η χρήση των πολυμερών στον τομέα της ιατρικής βιομηχανίας κερδίζει ολοένα και μεγαλύτερο έδαφος τα τελευταία χρόνια έχοντας ήδη κάνει ισχυρή την παρουσία τους σε ένα ευρύ πεδίο κλάδων της βιοϊατρικής όπως στη μηχανική ιστών, στην εμφύτευση ιατρικών συσκευών και τεχνητών οργάνων, στην προσθετική και την οφθαλμολογία, στην οδοντιατρική και την αποκατάσταση οστών, στη χημειοθεραπεία και σε ποικιλία άλλων ιατρικών εφαρμογών. Με τη χρήση πολυμερικών συστημάτων μεταφοράς δραστικών ουσιών καθίσταται ικανή η ελεγχόμενη αργή αποδέσμευση φαρμάκων στο σώμα καθώς και η στοχευμένη απελευθέρωσή τους σε σημεία όπου υπάρχουν φλεγμονές ή όγκοι. Τοιουτοτρόπως, χημειοθεραπείες με χρήση βιοπολυμερών ως διαμεσολαβητές, προβάλλουν ως δυνητικές υποψήφιοι στην αντιμετώπιση του καρκίνου του εγκεφάλου με ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Συγκρινόμενη με την τυπική συστημική χημειοθεραπεία, η ενδοογκική απελευθέρωση φαρμάκου με τη χρήση βιοπολυμερών θεωρητικώς παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήματα: τα βιοπολυμερή μπορούν να μεταφέρουν το φάρμακο απευθείας στον όγκο-στόχο αυξάνοντας τη συγκέντρωση τοπικά και παράλληλα μειώνοντας τη συστημική τοξικότητα· μπορούν έτσι να χρησιμοποιούνται στη θεραπεία ανοσοκατασταλμένων ασθενών που δεν μπορούν να υποβληθούν σε συστημική χημειοθεραπεία. Από τη στιγμή που είναι απαραίτητη η ποσοτικοποίηση των φαρμάκων για τον χαρακτηρισμό των συστημάτων αποδέσμευσης και για μελέτες φαρμακοκινητικής, θα πρέπει να επιλέγεται η καταλληλότερη μέθοδος ποσοτικοποίησης παρέχοντας υψηλή ευαισθησία και ακρίβεια, εξασφαλίζοντας μεγάλη ανιχνευτική ικανότητα ακόμη και για πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις. Στην παρούσα εργασία δύο αναλυτικές τεχνικές, η απορρόφηση υπεριώδους-ορατού και η επιφανειακή ενίσχυση της σκέδασης Raman (Surface Enhanced Raman Scattering, SERS), χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτική εκτίμηση του αντινεοπλασματικού φαρμάκου Mitoxantrone και του αντιμυκητιακού παράγοντα Ambisome (Αμφοτερισίνη Β) που αποδεσμεύτηκαν από βιοσυμβατές πολυμερικές μήτρες συμπολυμερούς αιθυλενίου-οξικού βινυλεστέρα, συμπολυμερούς γλυκολικού-γαλακτικού οξέος και πολυπροπυλενίου. Το SERS είναι ένα νέο, εναλλακτικό, ταχύ και μη καταστροφικό εργαλείο που μπορεί να βρεί εφαρμογή και στην ποσοτική εκτίμηση ουσιών πάρα πολύ χαμηλών συγκεντρώσεων. Χάρις στην ενίσχυση που παρέχεται στο σήμα Raman από τα νανο-εκτραχυμένα υποστρώματα ευγενών μετάλλων ή τα νανο-συσσωματώματα κολλοειδών διαλυμάτων ευγενών μετάλλων, έχει αναφερθεί ακόμη και συλλογή φάσματος SERS από ένα μόνο μόριο. Συνεπώς, η εφαρμογή του SERS σε μελέτες ουσιών εξαιρετικά χαμηλών συγκεντρώσεων φαίνεται να είναι πολύ ενδιαφέρουσα. Κατασκευάστηκαν πολυμερικά υμένια με εγκλωβισμένες τις δραστικές ουσίες και η μελέτη αποδέσμευσης πραγματοποιήθηκε σε νερό. Ποσοτικές μετρήσεις με τη χρήση του SERS σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις έδειξαν μεγαλύτερη ανιχνευτική ευαισθησία σε σχέση με αυτές που πραγματοποιήθηκαν με την απορρόφηση UV-Vis. Συμπερασματικά, το SERS δείχνει ικανό στον ποσοτικό προσδιορισμό ενεργών ουσιών που αποδεσμεύονται από βιοσυμβατά πολυμερικά συστήματα μεταφοράς δραστικών ουσιών σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις. / The application of polymeric materials for medical purposes is growing very fast. Polymers have found applications in such diverse biomedical fields as tissue engineering, implantation of medical devices and artificial organs, prosthesis, ophthalmology, dentistry, bone repair, chemotherapy and many other medical fields. Polymer-based delivery systems enable controlled slow release of drugs into the body and also they make possible targeting of drugs into sites of inflammation or tumors. Thus, biopolymer-mediated chemotherapy has shown promising results in the treatment of brain tumors. When compared to conventional systemic chemotherapy, intratumoral biopolymer-mediated drug delivery has several theoretical advantages: Biopolymers can deliver drugs into the tumor bed, thus maximizing local concentration while minimizing systemic toxicity. They may therefore be employed in the treatment of immunodepressed patients etc. Since drugs need to be quantified for drug delivery system characterization, intracellular distribution studies, free or vehicular, and for pharmacokinetic assays, the most suitable quantification method must be chosen. It should have a high sensitivity, specificity and reproducibility and should be capable of measuring at very low concentration range, as well. In the present study, two analytical techniques are utilized to quantitatively evaluate the antineoplastic drug Mitoxantrone and the antifungal agent Ambisome (Amphotericin b) released from active agents-loaded biocompatible polymer matrices poly(propylene), poly(ethylene-co-vinyl acetate), poly(lactic-co-glycolic acid); the UV-Vis absorption and the Surface Enhance Raman Scattering (SERS). SERS is a new, versatile, fast and non destructive tool for the estimation of extremely small amounts of substances. Due to the enhancement provided to the Raman signal by the nano-rough noble-metal substrates or the nano-structured colloidal clusters of noble metals, even single molecule detection has been reported. Therefore, applying SERS to extremely low concentration measurements proves to be challenging. Drug loaded polymer specimens were prepared and the in vitro drug release was determined in water. Fast SERS quantitative measurements showed enhanced sensitivity compared to the UV-Vis absorption; SERS may enable low concentration quantitative assessment of controlled release of drugs from biopolymer-based delivery systems.

Η φασματοσκοπία Raman θεωρείται αξιόπιστη μέθοδος χαρακτηρισμού της μοριακής δομής της ύλης. Τελευταία δε καταβάλλεται μεγάλη προσπάθεια να αναδειχθεί και ως μη επεμβατική τεχνική ανίχνευσης ουσιών φαρμακευτικού και βιολογικού ενδιαφέροντος. Επειδή όμως το φαινόμενο Raman είναι ασθενές και τα όρια ανίχνευσης των ουσιών αυτών ιδιαίτερα χαμηλά, η συμβατική φασματοσκοπία Raman ανταποκρίνεται με μεγάλη δυσκολία στις απαιτήσεις μιας μη επεμβατικής τεχνικής. Τα τελευταία χρόνια με την ανακάλυψη της επιφανειακής ενίσχυσης της σκέδασης Raman (Surface Enhanced Raman Scattering) και την ανάπτυξη της ομώνυμης τεχνικής SERS αυξήθηκε η πιθανότητα του φαινομένου κατά τάξεις μεγέθους. Στο πλαίσιο αυτό, έχουν αναφερθεί και μελέτες SERS με ανίχνευση σκέδασης Raman ακόμη και από ένα μόνο μόριο (single molecule detection). Προϋπόθεση όμως ανάπτυξης φαινομένου SERS είναι η γειτνίαση της εξεταζόμενης ουσίας με νανοσωματίδια αργύρου (Ag) ή χρυσού (Au). Τα νανοσωματίδια αυτά χρησιμοποιούνται κυρίως είτε υπό μορφή κολλοειδών διαλυμάτων είτε υπό την μορφή νανοδομημένων επιφανειών. Μια επιπλέον παράμετρος που πρέπει να συνυπολογισθεί ώστε η μέθοδος αυτή να χαρακτηριστεί αναλυτική είναι η δυνατότητα πραγματοποίησης με SERS ποσοτικών μετρήσεων. Στην παρούσα εργασία ως “υπόστρωμα” εμφάνισης του φαινομένου SERS χρησιμοποιήθηκαν κολλοειδή διαλύματα Au και Ag (~2 mL), στα οποία προστίθεντο 25-100 μL διαλύματος της προς ανίχνευσης ουσίας. Η χρησιμοποίηση της γεωμετρίας σκέδασης 90ο, της πλέον ενδεδειγμένης για λήψη φασμάτων Raman από υγρά και κολλοειδή διαλύματα νανομετρικής κλίμακας (10-100 nm), έδωσε τη δυνατότητα ανίχνευσης συγκεντρώσεων ουσιών-στόχων ακόμη και της τάξης των fg/mL. Επιπλέον, η χρησιμοποίηση μιας κυψελίδας με συνεχή ταλάντωση σε κάθετη ως προς το επίπεδο σκέδασης διεύθυνση (oscillating or shaking cell), επέτρεψε την πραγματοποίηση ποσοτικών μετρήσεων SERS σε συγκεντρώσεις της τάξης των (sub)-ng & (sub)-pg/mL. Η διάταξη αυτή φωταψίας δείγματος και συλλογής σκεδαζόμενης ακτινοβολίας εφαρμόστηκε σε αντικαρκινικά φάρμακα (Novantrone® & Doxorubicin), αντιβιοτικό (Ciproxin®) και βάσεις του DNA. Στην περίπτωση του αντιβιοτικού με ενεργή ουσία το Ciprofloxacin ελήφθησαν ποσοτικά αποτελέσματα σε διαλύματα τεχνητών δακρύων της τάξης των ng/mL, κάτω από την συνολική κλίμακα της μέσης ανασταλτικής πυκνότητας (minimum inhibitory concentration range) του φαρμάκου. Στόχος και φιλοδοξία είναι η τεχνική αυτή να αναδειχθεί ως μια ταχεία μη επεμβατική αναλυτική μέθοδος μέτρησης φαρμακευτικών ή/και βιολογικών ουσιών σε σωματικά υγρά (π.χ. σίελος, δάκρυα, …), για την μελέτη της φαρμακοκινητικής, την έγκαιρη διάγνωση ασθενειών καθώς και τη μελέτη ελεγχόμενης αποδέσμευσης ενεργών ουσιών από πολυμερικές μήτρες σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις. Επιπλέον, έγινε προσπάθεια μελέτης/ανίχνευσης μορίων Ε18 primary rat cortical cells με την χρήση του SERS σε συνθήκες προσομοίωσης ηλεκτροχημικού εμφυτεύματος. Για τον λόγο αυτό σχεδιάστηκε και αναπτύχθηκε ένας μικρο-επωαστής (micro-incubator) που επιτρέπει αφ’ ενός μεν τη συντήρηση των κυττάρων σε περιβάλλον κατάλληλο για τη μελέτη τους (layer of Neurobasal-culture medium with a 95% air & 5% CO2 gas flow at 37oC), αφ’ ετέρου δε την προσαρμογή του σε χώρο υποδοχής δείγματος ενός φασματοφωτόμετρου μικρο-Raman για τη λήψη φασματοηλεκτροχημικών μετρήσεων Raman/SERS. Το κύριο σημείο ενδιαφέροντος στο οποίο εστιάσαμε στην παρούσα εργασία αναφέρεται στην διερεύνηση ανίχνευσης βασικών/θεμελιωδών μορίων των κυττάρων στo θρεπτικό υγρό του πειράματος για την ταχεία εκτίμηση ενδεχόμενης αποδέσμευσης DNA που θα αντικατόπτριζε την κατάσταση των κυττάρων. / Laser Raman spectroscopy plays an increasing important role in polymer science, biophysics/biochemistry and life science. Based on vibrational transitions, it has long been regarded as a valuable non destructive tool for the identification of chemical and biological samples as well as the elucidation of molecular structure, surface processes and interface reactions. Spontaneous Raman scattering is however an inherently weak process characterized by extremely small cross sections. Even so, the Raman signal can be highly enhanced when the analyte is placed on or near either to nano-rough noble-metal substrates or to nano-structured colloidal clusters of noble metals. This nano-enhanced scattering process is known as Surface Enhanced Raman Scattering, SERS. With SERS, extremely small amounts of substances can be detected; even single molecule detection has been reported. This constitutes a challenge of applying SERS to extremely low concentration measurements. Nevertheless, the quantitative evaluation by means of SERS was proved difficult, due largely to lack of nano-sized noble metal structures with analytically suitable stability and reproducibility. The commonly used SERS substrates are nanostructured colloids or roughened surfaces of mainly silver and gold undergoing visible or NIR excitation. A note is made of the fact that the Raman scattering geometry that is actually largely used is the backscattering geometry. For solids this is better achieved via a microscope objective, while for liquids via a macro lens. However, the best scattering geometry for Raman light collection from liquids and nanostructured colloids is the right angle scattering; that is, the scattered light is collected at 90o from the excitation light. Having all above in mind, in order to perform quantitative SERS measurements we have designed and developed an oscillating cell making use of the right angle Raman scattering geometry. Originally, the development of the oscillating or “shaking” cell allows large sample sectional surface monitoring, better mixing and homogeneity giving rise to SERS signal reproducibility. In addition, the application of the advantageous for nanocolloidal solutions right angle Raman scattering collection geometry enables SERS measurements at extremely low concentrations. We demonstrated the use this new surface enhanced Raman scattering excitation/collection configuration to monitor the level of the antitumor drugs mitoxantrone and doxorubicin as well as the antibiotic ciprofloxacin at very low concentrations performing fast SERS & SERRS measurements. We have also quantified the concentration of the active agents in aqueous solutions as well as in artificial tears by a partial least-squares (PLS) chemo metric regression algorithm. All above reveal the potential of this technique in the monitoring of the controlled release of active agents from polymeric matrices as well as in the quantitative analysis of drugs in corporal fluids. The only need is to add in a test tube containing 0.5 mL of a nanocolloidal noble metal solution3 about 25-100 μL of a sampling fluid. Finally, in an attempt to detect “living” cells by SERS, to identify DNA components released in a cell culture medium as a “touch mark” of cell death and to perform even single molecule detection, a home-made micro-incubator was designed to allow Raman measurements of neuron cells under the microscope. Commercial micro incubators feature higher optical path between coverslips than the required (<1-1,5 cm) for typical micro-Raman systems even bearing long working distance objectives. It was at that sense a prerequisite to design, construct and optimize a micro-incubator to fit a conventional micro-Raman configuration. The designed micro-incubator meets well-defined stable conditions (temperature, culture solution and atmosphere).