Στο πλαίσιο της παρούσης διατριβής, αξιοποιήθηκαν οι αλληλουχίες γνωστών γονιδιωμάτων, αλλά και γονιδιωμάτων που αποκρυπτογραφήθηκαν πρόσφατα, για να μελετηθεί η εξελικτική ιστορία τριών λειτουργικά σημαντικών πρωτεϊνικών οικογενειών: (α) των φυτικών DNA μεθυλομεταφορασών και (β) των ευκαρυωτικών RNA μεθυλομεταφορασών, οι οποίες είναι ένζυμα που επιφέρουν μεθυλίωση στις νουκλεοτιδικές αλληλουχίες, καθώς και (γ) των πεπτιδασών συγγενών της καλλικρεΐνης (KLKs), οι οποίες είναι γνωστές σερινοπρωτεϊνάσες με δράση τύπου θρυψίνης ή χυμοθρυψίνης. Οι εξελικτικές σχέσεις των χαρακτηρισμένων και καινοφανών πρωτεϊνών των τριών οικογενειών διερευνήθηκαν με κατασκευή φυλογενετικών δένδρων. Επίσης, αναλύθηκε η δευτεροταγής και τριτοταγής δομή των ομόλογων πρωτεϊνών, η δομή των γονιδίων που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες αυτές, και κατασκευάσθηκαν διαγνωστικά πρωτεϊνικά μοτίβα από τις αλληλουχίες των τριών οικογενειών ενζύμων. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων οδήγησαν στην εξαγωγή σημαντικών συμπερασμάτων σχετικά με την πιθανή βιολογική λειτουργία των καινοφανών πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα, ομόλογες φυτικές DNA μεθυλομεταφοράσες και καινοφανείς ευκαρυωτικές RNA μεθυλομεταφοράσες ταυτοποιήθηκαν σε δημόσιες βάσεις δεδομένων. Λεπτομερής φυλογενετική ανάλυση οδήγησε στην ταυτοποίηση των τεσσάρων ήδη γνωστών οικογενειών φυτικών DNA μεθυλομεταφορασών και μιας καινοφανούς υποοικογένειας (Pavlopoulou and Kossida, 2007). Επίσης, ταυτοποιήθηκαν πέντε υποοικογένειες ευκαρυωτικών RNA μεθυλομεταφορασών. Πέραν των τριών ήδη γνωστών υποοικογενειών (NOP2, NCL1 και YNL022C), ταυτοποιήθηκε μια καινοφανής υποοικογένεια (RCMT9), και μια υποοικογένεια, FMU, η οποία εθεωρείτο ότι απαντάται αποκλειστικά σε προκαρυωτικούς οργανισμούς (Pavlopoulou and Kossida, 2009). Επιπλέον, κατασκευάσθηκαν πρωτεϊνικά αποτυπώματα της οικογένειας (και των επιμέρους υποοικογενειών) των RNA μεθυλομεταφορασών, τα οποία καταχωρήθηκαν στη δευτερογενή πρωτεϊνική βάση δεδομένων PRINTS (http://www.bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/PRINTS). Στα πλαίσια της διατριβής, αναπτύχθηκε το υπολογιστικό πρόγραμμα RCMTHMM, με σκοπό τη διάκριση/ταυτοποίηση των ευκαρυωτικών RNA μεθυλομεταφορασών, το οποίο διατέθηκε για δημόσια χρήση στη διεύθυνση URL: http://www.bioacademy.gr/bioinformatics/RCMTHMM. Σημαντική συνεισφορά της παρούσας μελέτης είναι η αναδιατύπωση της εξελικτικής ιστορίας των καλλικρεϊνών (Pavlopoulou et al., 2010). Οι καλλικρεΐνες είναι σημαντικά πρωτεολυτικά ένζυμα που δρουν ατομικά ή σε πρωτεολυτικούς καταρράκτες και ρυθμίζουν σημαντικές φυσιολογικές λειτουργίες, ενώ η απορρυθμισμένη δράση τους έχει συνδεθεί με σοβαρές ασθένειες (καρδιοαγγειακές, νευροεκφυλιστικές, φλεγμονώδεις, δερματικές, διάφορους τύπους καρκίνου). Για την απομόνωση νέων καλλικρεϊνών αξιοποιήθηκε το γεγονός ότι τα KLK γονίδια συνεντοπίζονται στο ίδιο χρωμόσωμα υπό μορφή μη διακοπτόμενης συστάδας γονιδίων. Σε προηγούμενες μελέτες είχε προταθεί ότι οι καλλικρεΐνες απαντώνται μόνον στα θηλαστικά και ότι εμφανίσθηκαν πριν από περίπου 150 εκατομμύρια χρόνια. Στην παρούσα μελέτη, ομόλογες καινοφανείς ακολουθίες καλλικρεϊνών ανιχνεύθηκαν in silico στα γονιδιώματα διάφορων οργανισμών. Ορθόλογα των καλλικρεϊνών ταυτοποιήθηκαν για πρώτη φορά στα ερπετά, στα πτηνά και στα αμφίβια, υποδεικνύοντας την εξελικτική καταγωγή των καλλικρεϊνών πριν από 330 εκατομμύρια χρόνια. Επιπροσθέτως, πέραν των 15 γνωστών KLKs (KLΚ1-15), ταυτοποιήθηκαν τρία καινοφανή μέλη (ορφανές Klks) και με σύγκριση των προβλεπόμενων δομών δείχθηκε ότι τα δομικά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με την καταλυτική δράση είναι συντηρημένα στις καινοφανείς πρωτεϊνικές αλληλουχίες KLK. Σημειωτέον, δείχθηκε ότι στα γονιδιώματα όλων των υπό εξέταση οργανισμών, τα ορθόλογα γονίδια KLK χαρτογραφούνται στην ίδια χρωμοσωμική περιοχή, διευθετημένα εν σειρά με τον ίδιο προσανατολισμό και χωρίς παρεμβολή μη καλλικρεϊνικών γονιδίωνΠροτείναμε ότι η οικογένεια των καλλικρεϊνών προέκυψε από μια σειρά γονιδιακών διπλασιασμών και μεταλλάξεων, και ότι οι καλλικρεΐνες έχουν συνεξελιχθεί με τα ειδικά υποστρώματά τους (Pavlopoulou et al., 2010). / In the present thesis, the availability of an increasing number of complete or almost complete genomes, including those that were completed recently, enabled the study of the evolutionary history of three functionally important protein families: (a) the plant DNA methyltransferases and (b) the eukaryotic RNA methyltransferases, which are enzymes that catalyze the transfer of a methyl group to nucleotide sequences, as well as (c) the kallikrein-related peptidases or KLKs, which are trypsin- or chymotrypsin-like serine proteases. The evolutionary relationships of the already known and the novel proteins of the three families that were identified here were investigated using phylogenetic trees. Moreover, the secondary and tertiary structures of the homologous proteins were analyzed, as well as the structure of the protein-encoding genes, and diagnostic protein motifs were constructed based on the sequences of the three enzyme families. Our results led to suggestions pertaining to the biological function of the identified novel proteins. In particular, homologous plant DNA methyltransferases and novel eukaryotic RNA methyltransferases were identified in publicly accessible sequence databases. Detailed phylogenetic analysis of plant DNA methyltransferases identified four already known families and a novel subfamily in addition (Pavlopoulou and Kossida, 2007). Moreover, five distinct eukaryotic RNA methyltransferase subfamilies were identified; apart from the three already known subfamilies (NOP2, NCL1 and YNL022C), one novel subfamily (RCMT9) and the FMU which hitherto was considered to exist exclusively in prokaryotes were also identified (Pavlopoulou and Kossida, 2009). Furthermore, protein fingerprints were constructed from the generic family of RNA methyltransferases (and the individual subfamilies), which were deposited in the PRINTS database (http://www.bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/PRINTS). We developed the computational program RCMTHMM, in order to discriminate/identify eukaryotic RNA methyltransferases from other proteins. The RCMTHMM program has been made publicly available in the URL: http://www.bioacademy.gr/bioinformatics/RCMTHMM. Finally, the evolutionary history of KLKs was reconstructed. Kallikreins are important proteolytic enzymes which are involved in proteolytic cascade pathways and their dysregulated expression has been associated with major human pathologies (cardiovascular diseases, neurodegenerative disorders, inflammatory diseases, skin diseases, different cancer types). The prominent feature of the kallikrein family is that it consists of tandemly and uninterruptedly arrayed genes on a single locus at human chromosome 19q13.3-13.4. This unique feature was used in order to identify novel KLKs and KLK-like genes/proteins. Previous studies on the evolution of kallikreins were restricted to mammals and the emergence of the kallikrein genes was suggested approximately 150 million years ago. In the present study, homologous novel kallikrein protein sequences were detected in silico in the genomes of various species. For the first time, novel KLK orthologues were identified in reptiles, aves and amphibia, which allowed us to trace the evolutionary origin of kallikreins 330 million years ago. In addition, apart from the 15 already known KLK genes (KLK1-15), three novel members were identified (orphan Klks). All the defining structural features which are related to the catalytic activity of KLKs were found to be conserved in the novel KLK protein sequences. Of particular interest, the synteny of the KLK-encoding genes was analyzed and it was shown that these genes are co-localized in contiguous, uninterrupted clusters maintaining the same orientation in all species under investigation. We suggest that a series of gene duplication and mutation events gave rise to the family of KLK enzymes and KLKs have co-evolved with their specific substrates (Pavlopoulou et al., 2010).

Το σύστημα του Συμπληρώματος απαρτίζεται από μια ομάδα πρωτεϊνών του πλάσματος και κυτταρικών υποδοχέων που παίζουν σημαντικό ρόλο στην άμυνα του ξενιστή μέσω της αλληλεπίδρασής τους τόσο με συστατικά της φυσικής, όσο και της προσαρμοστικής ανοσίας. Παράλληλα, μια ομάδα από ρυθμιστικές πρωτεΐνες του πλάσματος και της κυτταρικής μεμβράνης προστατεύει τα κύτταρα του ξενιστή από την αυτόλογη δράση του Συμπληρώματος. Η σύνθεση του τελικού λυτικού συμπλόκου MAC, που οδηγεί σε κυτταρόλυση, ρυθμίζεται από τις ρυθμιστικές πρωτεΐνες : CD59, vitronectin και clusterin. Μέχρι σήμερα οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες της λυτικής οδού του Συμλπηρώματος έχουν ελάχιστα χαρακτηριστεί σε σπονδυλωτά πέραν των θηλαστικών. Οι οστεϊχθύες αποτελούν ένα σημαντικό μοντέλο, καθώς είναι οι μόνοι οργανισμοί που εμφανίζουν ένα πλήρως αναπτυγμένο και διευρυμένο σύστημα συμπληρώματος, μέσω διπλασιασμού πολλών γονιδίων του Συμπληρώματος. Προκειμένου να μελετηθεί η παρουσία και η φυλογενετική εξέλιξη του ρυθμιστικού μορίου της clusterin, το οποίο παρεμποδίζει την πρόσδεση του συμπλόκου C5b-7 στην μεμβράνη του κυττάρου-στόχου, με αποτέλεσμα την αναστολή της κυτταρόλυσης, έγινε κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός του γονιδίου της clusterin στην ιριδίζουσα πέστροφα (Oncorhynchus mykiss irideus). Απομονώθηκαν δύο ισομορφές του γονιδίου της clusterin, clusterin-1 (TCLU-1) και clusterin-2 (TCLU-2) από cDNA βιβλιοθήκη ήπατος πέστροφας, με χρήση ειδικών ολιγονουκλεοτιδίων. Οι προκύπτουσες αμινοξικές αλληλουχίες των ισομορφών clusterin-1 και clusterin-2 παρουσιάζουν 89% ταυτοσημία μεταξύ τους, καθώς και 40 και 38% ταυτοσημία με την clusterin του ανθρώπου, αντίστοιχα. Η μοριακή δομή των συναγομένων πρωτεϊνών αντιστοιχεί στην α΄ αλυσίδα της clusterin και ομοιάζει με εκείνη των θηλαστικών. Γονιδιωματικοί κλώνοι απομονώθηκαν και για τις δύο ισομορφές και μελετήθηκε η οργάνωση εξωνίων-εσωνίων των αντίστοιχων γονιδίων. Η οργάνωση των γονιδίων clusterin-1 και clusterin-2, με τα μέχρι στιγμής δεδομένα, δείχνει αντιστοιχία εξωνίων - εσωνίων με το γονίδιο της clusterin του ανθρώπου, στην περιοχή ομολογίας τους. Ως προς το μέγεθος, τα αντίστοιχα εξώνια φαίνονται συντηρημένα, ενώ τα εσώνια ποικίλουν, εμφανίζοντας μικρότερο μέγεθος συγκριτικά με εκείνα της clusterin του ανθρώπου. Ανάλυση κατά Southern έδειξε ότι η clusterin απαντάται σε δύο τουλάχιστον αντίγραφα στο γονιδίωμα της πέστροφας. Τα γονίδια clusterin-1 και clusterin-2 εμφανίζουν διαφορική έκφραση στο επίπεδο του mRNA σε διάφορους ιστούς πέστροφας, όπως διαπιστώθηκε με RT-PCR. Παρατηρήθηκαν υψηλά επίπεδα mRNA του γονιδίου TCLU-1 στο ήπαρ και στο σπλήνα, ενώ η έκφραση του γονιδίου TCLU-2 παρατηρήθηκε αυξημένη στην καρδιά και στο έντερο, χαμηλή στο ήπαρ και στο σπλήνα δεν ανιχνεύτηκε. Τέλος, η φυλογενετική ανάλυση των πρωτεϊνών της clusterin από διάφορους οργανισμούς εμφάνισε την TCLU-1 να ομαδοποιείται με την TCLU-2, ενώ η όλη υποομάδα προηγείται φυλογενετικά των ορθόλογων πρωτεϊνών του pufferfish και του zebrafish και αυτές των ορθόλογων των άλλων οργανισμών που αναλύθηκαν. Συμπερασματικά, το γονίδιο της clusterin ανιχνεύεται στην ιριδίζουσα πέστροφα, σε δύο τουλάχιστον ισομορφές και παρουσιάζει ομολογία με την clusterin του ανθρώπου, τόσο στο επίπεδο οργάνωσης του γονιδίου, όσο και στο επίπεδο της αμινοξικής αλληλουχίας και της προκύπτουσας δομής. Η παρουσία ισομορφών από εναλλακτικό μάτισμα που ισχύει στην clusterin του άνθρωπου δεν έγινε δυνατόν να πιστοποιηθεί. / The complement system consists of a group of plasma proteins and cell receptors that play a critical role in host defense, by interacting with components of both innate and adaptive immunity. Α group of plasma and cell membrane regulatory proteins protects the host cells from the autologous complement activation. The conformation of the lytic complex MAC, which results to the cytolysis, is regulated by the regulatory proteins: CD59, clusterin και vitronectin. Up to date, the regulatory proteins of MAC complex are not well characterized in low vertebrates. Bony fish represent an attractive model for studies on complement system, as they are, the only organisms that reveal a completely developed and extended system, via duplication and functional differentiation of many genes of the complement system. In order to elucidate the presence and the evolution of the clusterin regulatory molecule, which impedes the binding of C5b-7 complex to the membrane of the target cell, inhibiting cytolysis, we report here the cloning and characterization of the clusterin gene in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss irideus). Two isoforms of clusterin gene, clusterin-1 (TCLU-1) and clusterin-2 (TCLU-2) were isolated from a trout liver cDNA library, by PCR using specific oligonoucleotides. The deduced amino-acid sequences of the isoforms TCLU-1 and TCLU-2 show 89% identity to each other, as well as 40 and 38% identity to human clusterin, respectively. The domain structure of the deduced proteins corresponds to the α΄ chain of clusterin and resembles to that of mammalian. Genomic clones were isolated for the two isoforms and intron-exon organization of corresponding genes was clarified. The organization of the clusterin genes TCLU-1 and TCLU-2, as the partial data have shown, is in line with the intron-exon organization of the human clusterin gene, at their homology region. Regarding the length, the corresponding exons seem to be conserved, but the introns in trout clusterin genes are shorter than human clusterin. Southern blot analysis has shown that clusterin can be found as two copies at least, in the trout genome. Also, the genes TCLU-1 and TCLU-2 reveal differential expression, at mRNA level, among several trout tissues, as it was found out by RT-PCR analysis. High levels of TCLU-1 mRNA are detected in liver and spleen. On the other hand, TCLU-2 is expressed mainly in heart and intestine, while is not detected any expression in spleen. Finally, the phylogenetic analysis of the clusterin proteins from various organisms, showed grouping of TCLU-1 and TCLU-2, while this subgroup precedes evolutionary the clusterin orthologs of pufferfish, zebrafish and the other examined organisms, afterwards. Conclusively, the clusterin gene in rainbow trout is detected as two isoforms and shows homology with human clusterin, not only at the level of gene organization, but also at the level of amino-acid sequence and domain architecture. The alternative splicing of human clusterin was not able to be certified in trout.