Η διαδικασία της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA περιλαμβάνει αρχικά το σχηματισμό του προ-αντιγραφικού συμπλόκου στις αφετηρίες της αντιγραφής, με τελικό αποτέλεσμα την προσέλκυση των ελικασών MCM2-7 (Mini Chromosome Maintenance Complex) και την έναρξη της αντιγραφής. Ο παράγοντας Cdt1 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία αδειοδότησης και για τον λόγο αυτό ρυθμίζεται αυστηρά κατά την διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, εκτός από την αποικοδόμησή του, υπάρχει ένας επιπλέον τρόπος ρύθμισής του, μέσω της πρωτεΐνης της Geminin. Η Geminin προσδένεται στο Cdt1 και με αυτόν τον τρόπο αναστέλλει τη στρατολόγηση των MCM2-7 στη χρωματίνη και επομένως, την αδειοδότηση της αντιγραφής. Εκτός από την δράση της στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, η Geminin παίζει σημαντικό ρόλο και στην κυτταρική διαφοροποίηση, αλληλεπιδρώντας με μεταγραφικούς παράγοντες και πρωτεϊνικά σύμπλοκα αναδιοργάνωσης της δομής της χρωματίνης. Η γονιδιωματική αστάθεια είναι χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων, στην οποία συντελεί απορύθμισης παραγόντων του συστήματος αδειοδότησης της αντιγραφής και συγκεκριμένα των κύριων ρυθμιστών του, Geminin και Cdt1. Η υπερέκφραση του Cdt1 οδηγεί σε επαναντιγραφή και, συνεπώς, υπερδιπλασιασμό του DNA, ενώ την ίδια επίπτωση εμφανίζει και η αποσιώπηση της Geminin. Η σημαντικότητα της αλληλεπίδρασης των δυο αυτών μορίων οδήγησε στην αναζήτηση συνθετικών χημικών ουσιών με την ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου Geminin-Cdt1. Οι συνθετικές αυτές χημικές ενώσεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μοριακά εργαλεία για την περαιτέρω μελέτη της in vivo αλληλεπίδρασης των Geminin και Cdt1 στις διαδικασίες του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης, καθώς επίσης και ως φαρμακολογικές ουσίες με πιθανή αντικαρκινική δράση. Η παρούσα εργασία εστιάστηκε στη μελέτη της συνθετικής χημικής ένωσης XIV, η οποία είχε ταυτοποιηθεί σε έναν προηγούμενο μαζικό έλεγχο υψηλής απόδοσης (High throughput Screening - HTS). Αρχικά καθορίστηκαν τα επίπεδα κυτταροτοξικότητάς της. Στη συνέχεια μελετήθηκε η ικανότητά της να μεταβάλλει την ενδοκυτταρική κατανομή της Geminin και τέλος, εξετάστηκε η επίδρασή της στον κυτταρικό κύκλο. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συνθετική χημική ένωση XIV παρουσιάζει περιορισμένη κυτταροτοξικότητα. Επιπλέον, αυξάνει τον πυρηνικό εντοπισμό της εξωγενώς εκφρασμένης Geminin, υποδεικνύοντας ότι μπορεί να ανταγωνίζεται το Cdt1 για την πρόσδεσή του στη Geminin. Πειράματα ανοσοφθορισμού και ανάλυσης περιεχομένου του DNA, μέσω FACS, έδειξαν ότι η συνθετική χημική ένωση XIV προκαλεί αναστολή του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων κατά τα αρχικά στάδια της S φάσης. Συμπερασματικά, η συνθετική χημική ένωση XIV ενδέχεται να επηρεάζει την αλληλεπίδραση των Geminin και Cdt1. Χημικές ενώσεις ικανές να παρεμβαίνουν στην ειδικότητα αλληλεπίδρασης των δυο αυτών μορίων και συνεπώς στο σύστημα αδειοδότησης της αντιγραφής, μπορούν να αποτελέσουν τη βάση για την ανάπτυξη μια νέας γενιάς αντικαρκινικών φαρμάκων με βελτιστοποιημένες ιδιότητες. / The replication licensing begins with the formation of the pre-Replicative Complex (preRC) on the origins of replication (ori), leading to the recruitment of the MCM2-7 helicases onto chromatin and the initiation of DNA replication. Cdt1 plays a crucial role in the licensing and is therefore strictly regulated during the cell cycle. Cdt1 is primarily regulated via proteolytic degradation, while in higher eukaryotes, is also negatively regulated by Geminin. Geminin’s binding to Cdt1 inhibits the loading of the MCMs to chromatin and thus licensing of DNA replication. Geminin also has an additional role in differentiation processes by multiple interactions with transcriptional factors and chromatin remodeling complexes. Cancer cells are characterized by genomic instability. Deregulation of the components of the licensing system and especially of Geminin and Cdt1, leads to genomic instability and promotes malignant transformation. Geminin and Cdt1 complex could be used as could serve as target for the identification of chemical compounds that would be able to modulate proliferation. These chemical compounds can be used as molecular tools for further studying the in vivo interaction of these two molecules during the processes of cellular proliferation and differentiation, and ultimately serve as potential pharmacological agents with anti-cancer properties. In this study, we aimed to characterize the chemical compound XIV, which was identified in a previous High Throughput Screening (HTS). Specifically, we examined compound XIV in cellular assays in order to determine cytotoxity, its ability to alter the subcellular localization of Geminin and cell cycle profile of cancer cells. Our results, suggest that the chemical compound XIV exhibits limited cytotoxicity. It increases the nuclear localization of transiently expressed Geminin, suggesting that it might act by antagonizing Cdt1 for the binding of Geminin. Additionally, immunofluorescence and FACS experiments showed that chemical compound XIV causes cell cycle arrest during early S phase. Overall, in this study we propose that chemical compound XIV interferes with the Geminin and Cdt1 complex and affects proliferation of tumorigenic cells.

- / -

Σκοπός της εργασίας αυτής είναι η ανάλυση του νέου νομικού καθεστώτος διαχείρισης και ελέγχου των χημικών ουσιών σε ευρωπαϊκό επίπεδο και η ανάδειξη των ποικίλων διακυβευμάτων που αυτό θέτει. Το νέο αυτό νομικό καθεστώς, παρά την μακροχρόνια διαβούλευση του, δεν είναι τελικά απαλλαγμένο από αδυναμίες και προβλήματα εφαρμογής. Πρόκειται για τον νέο κανονισμό REACH (αρχικά του Registration, Evaluation and Authorisation of Chemicals) ή κανονισμό 1907/2006/ΕΚ. Ο κανονισμός REACH αποτελεί ένα ενιαίο ευρωπαϊκό νομοθέτημα για την καταχώριση, την αξιολόγηση, την αδειοδότηση και τους περιορισμούς των χημικών ουσιών, αντικαθιστώντας 40 διαφορετικά υφιστάμενα νομοθετικά μέτρα. Η εργασία χωρίζεται στην εισαγωγή, σε έξι κεφάλαια και τέλος τα συμπεράσματα. Στην εισαγωγή παρουσιάζεται η υφιστάμενη νομοθεσία της ευρωπαϊκής ένωσης για τις χημικές ουσίες, τα προβλήματα από την εφαρμογή της καθώς και η ανάγκη για ένα νέο νομοθετικό πλαίσιο το οποίο θα αντικαταστήσει το υφιστάμενο και θα έχει ως πρωταρχικό σκοπό την προστασία της ανθρώπινης υγείας και του περιβάλλοντος. Αναφορά γίνεται στην βιώσιμη ανάπτυξη και την πράσινη χημεία, καθώς αποτελούν βασικούς πυλώνες του κανονισμού. Επίσης παρουσιάζονται οι βασικές αρχές του κανονισμού (αρχή της προφύλαξης, της υποκατάστασης κλπ) καθώς και οι επιδιωκόμενοι στόχοι από την εφαρμογή του. Στο πρώτο κεφάλαιο γίνεται μια αναλυτική παρουσίαση της αρχής της προφύλαξης, η οποία αποτελεί βασική και θεμελιώδης αρχή του κανονισμού. Γίνεται αναφορά στην σχέση της με την αρχή της πρόληψης, στην πορεία της μέσα στο ευρωπαϊκό δίκαιο και στη διατροφική πολιτική της ευρωπαϊκής ένωσης καθώς και η αντιμετώπισή της από το ελληνικό δικαιικό σύστημα. Στο δεύτερο κεφάλαιο παρουσιάζεται αναλυτικά η οικοδόμηση του κανονισμού REACH, μέσω των σημαντικότερων χρονολογικών γεγονότων που άλλοτε ενίσχυσαν και άλλοτε αποδυνάμωσαν το κανονισμό, ικανοποιώντας κάθε φορά και διαφορετικά συμφέροντα ή απαιτήσεις, έως την οριστικοποίηση του τελικού του κειμένου. Ειδική αναφορά γίνεται στο ρόλο του Παγκόσμιου Οργανισμού Εμπορίου για τη διαμόρφωση του τελικού κειμένου του κανονισμού. Στη συνέχεια, στο τρίτο κεφάλαιο, παρουσιάζονται αναλυτικά το πεδίο εφαρμογής του κανονισμού, τα θεσμικά όργανα και οι αρμοδιότητές τους καθώς και οι βασικές διατάξεις του κανονισμού, η καταχώριση, η αξιολόγηση, η αδειοδότηση και περιορισμοί των χημικών ουσιών. Ακολουθεί το τέταρτο κεφάλαιο, όπου παρουσιάζεται ο κανονισμός CLP (αρχικά του Classification, Labelling, Packaging) για την ταξινόμηση, την επισήμανση και συσκευασία χημικών ουσιών και μειγμάτων ή κανονισμός 1272/2008/EK. Ο κανονισμός CLP συμπληρώνει και τροποποιεί τον κανονισμό REACH στο κενό που παρουσιάζει όσον αφορά την ταξινόμηση, την σήμανση και τη συσκευασία των χημικών ουσιών και τον εναρμονίζει με το Παγκόσμιο Εναρμονισμένο Σύστημα ταξινόμησης και επισήμανσης για τις χημικές ουσίες και τα μείγματα των Ηνωμένων Εθνών. Στο πέμπτο κεφάλαιο γίνεται μια αναλυτική αποτίμηση του κανονισμού REACH, καθώς παρουσιάζονται και αναλύονται τόσο οι θετικές του όψεις όσο και οι αδυναμίες του. Αναλυτική αναφορά γίνεται στο κόστος εφαρμογής του κανονισμού καθώς και στα οικονομικά οφέλη που προκύπτουν από την εφαρμογή του. Επίσης παρουσιάζοντα τα προβλήματα ερμηνείας και εφαρμογής του κανονισμού. Ακολουθεί το έκτο κεφάλαιο, στο οποίο γίνεται αναφορά στην εφαρμογή του κανονισμού REACH στην Ελλάδα καθώς παρουσιάζεται η υπεύθυνη αρμόδια αρχή για την εφαρμογή του κανονισμού και ο ρόλος της, το πεδίο εφαρμογής του κανονισμού (επιχειρήσεις χημικών προϊόντων) καθώς και ο ρόλος του Συνδέσμου Ελληνικών Χημικών Βιομηχανιών. Τέλος στα συμπεράσματα γίνεται μια συγκεντρωτική παρουσίαση και σύγκριση των αρνητικών και θετικών χαρακτηριστικών του κανονισμού και αποτιμάται ο βαθμός της επίτευξης των αρχικών στόχων του μέσα στο χρονικό διάστημα από την ημερομηνία εφαρμογής του έως σήμερα. Επίσης παρουσιάζεται πως ο κανονισμός REACH αποτελεί καινοτόμο νομοθετικό εργαλείο στα χέρια της διοίκησης αν και αποδυναμωμένος σε σχέση με το αρχικό του κείμενο και την αρχική πεποίθηση για ολοκληρωμένη και υψηλού επιπέδου προστασία της ανθρώπινης υγείας και του περιβάλλοντος. / Aim of this work is the analysis of new legal regime of management and control of chemical substances in European level and the emergence of diverse implications that this poses. This new legal regime, despite its long-lasting consultation, is not finally exempted from weaknesses and problems of application. This is the new REACH Regulation (initials of the Registration, Evaluation and Authorisation of Chemicals) or regulation 1907/2006/EC. REACH is a uniform European legislation on the registration, evaluation, authorisation and restriction of chemicals, replacing 40 different existing legislative measures. The work is divided into the introduction, six chapters and finally conclusions. The introduction presents the existing EU legislation on chemicals, the problems of implementation as well as the need for a new legal framework which will replace the existing and will have as fundamental aim the protection of human health and environment. Reference is made to sustainable development and green chemistry, which are key pillars of the regulation. It also presents the basic principles of the regulation (precautionary principle, substitution principle, etc) as well as the objectives pursued by its application. In the first chapter becomes an analytic presentation of precaution principle, which constitutes basic and fundamental principle of regulation. Reference is made in relation to the prevention principle, in European law and food policy in the European Union as well as its confrontation from Greek law system. In the second chapter is presented in detail the construction of REACH regulation, by means of the most important chronological facts that sometimes reinforced and sometimes watered down regulation, satisfying each time and different interests or requirements, until the finalization of the final text. Special reference to the role of the World Trade Organization is made for the configuration of final text of regulation. Afterwards, in the third chapter, are presented in detail the field of application of regulation, the institutional bodies and their competences as well as the basic provisions of regulation, the registration, evaluation, authorisation and restriction of chemicals. Fourth chapter follows, where regulation CLP is presented (initials of the Classification, Labeling and Packaging) for the classification, labeling and packaging of substances and mixtures or regulation 1272/2008/EC. Regulation CLP supplements and modifies regulation REACH in the void that it presents with regard to the classification, labeling and packing of chemical substances and it harmonizes REACH with the World Harmonized System of classification and labeling for the chemical substances and mixtures of United Nations. In the fifth chapter becomes an analytic assessment of regulation REACH, while are presented and analyzed both positive aspects and weaknesses. A detailed reference becomes in the cost of implementing the regulation and to the economic benefits arising from its application. Also the problems in the interpretation and application of the regulation are presented. Following the sixth chapter, in which reference is made in the implementation of reach in Greece as the responsible authority for the application of the regulation and its role, the field of application of regulation (enterprises of chemical products) as well as the role of the Association of Greek Chemical Industries. Finally, in the conclusions is a summary and comparison of negative and positive characteristics of regulation and evaluation of the extent of the initial objectives within the period from the date of application until now. It also shows that REACH is an innovative legislative tool in the hands of the administration, although weak compared to the initial text, and the initial conviction for integrated and high level of protection of human health and environment.