本研究主要在於設計一種新式生物反應器，並應用於生產豬瘟病毒疫苗。首先根據所培養細胞的生長特性與原有生物反應器之缺點，改良成新式的生物反應器，並評估此新式生物反應器適用性、效能，以及所培養豬腎細胞之生長代謝情形與豬瘟病毒力價。整個實驗過程大致分為兩個部分，第一個部分探討細胞固定化培養之最適化培養條件與生長代謝情形，第二個部分探討豬瘟病毒培養之最適化培養條件與生長代謝情形。實驗結果發現豬腎細胞(PK-15)以批次方式培養於新式生物反應器，搭配著FIBRA-CEL®載體，成功的進行擴大培養，豬腎細胞最高的生長量達到2.29×109cells/300mL的細胞量。因此，改良之新式生物反應器可提供細胞優越的生長環境，具有擴大規模培養之潛力，可藉由此簡單設備、操作容易、成本低且低能源消耗之新式生物反應器達成細胞製品之生產基座。 / In this study, the production of PK-15 cell using immobilized animal cell culture in a novel bioreactor was investigated.We evaluated the serviceability and efficiency of a design-improved novel bioreactor for the growth and metabolic states of cultured PK-15 cells and the production of HC virus. The entire experiment includes two major stages: (1) investigation of the optimal conditions and metabolic states for the growth of immobilized cells, (2) investigation of the optimal conditions for the production of HC virus. Our results showed that immobilized PK-15 cells on the fibra-cell carries in the design-improved novel bioreactor exhibited their best growth of 2.29×109 cells/300mL.The immobilized conditions for cell culture, can provide a shearing stress of growth state, easy separation of cells from the culture mediu, and a operation of continuously feeding medium, leading to possibility growth of the high density cell and a long period of production;as a result, the efficiency of producing process is promoted. Here,our design-improved novel bioreactor is expected to provide an optimal growth environment of both the cells and viruses for the production of high-yielded, stable, and consistent cellular biological preparations. Furthermore, it will also provide the basis for the production of cell products with advantages of simple-equipped, easy-to-operate, low cost, and low energy consumption. / 致謝 i 中文摘要 ------------------------------------------------------------------------ ii 英文摘要 ------------------------------------------------------------------------ iii 目錄 ------------------------------------------------------------------------ iv 表目錄 ------------------------------------------------------------------------ vi 圖目錄 ------------------------------------------------------------------------ vii 第一章 緒論------------------------------------------------------------------ 1 第二章 文獻回顧------------------------------------------------------------ 3 2-1 豬腎傳代細胞(PK-15 cell) -------------------------------------- 3 2-2 豬瘟病毒------------------------------------------------------------ 4 2-2.1 豬瘟之歷史背景--------------------------------------------------- 4 2-2.2 豬瘟病毒之特性--------------------------------------------------- 7 2-2.3 豬瘟發生原因之探討--------------------------------------------- 11 2-3 生物反應器--------------------------------------------------------- 12 第三章 實驗材料與方法--------------------------------------------------- 21 3-1 細胞------------------------------------------------------------------ 21 3-2 細胞繼代培養------------------------------------------------------ 21 3-3 細胞冷凍保存------------------------------------------------------ 22 3-4 解凍細胞培養------------------------------------------------------ 22 3-5 病毒感染------------------------------------------------------------ 23 3-6 收集病毒------------------------------------------------------------ 24 3-7 豬瘟病毒力價測試------------------------------------------------ 24 3-8 細胞滾瓶培養------------------------------------------------------ 26 3-9 生物反應器操作--------------------------------------------------- 27 3-10 載體上細胞數的測定--------------------------------------------- 33 3-11 葡萄糖的測定------------------------------------------------------ 33 3-12 培養過程中pH值測定------------------------------------------- 34 第四章 結果與討論--------------------------------------------------------- 35 4-1 測試細胞貼附的材料--------------------------------------------- 35 4-2 細胞固定時間的比較--------------------------------------------- 36 4-3 測試不同比例的載體量培養豬腎細胞------------------------ 37 4-4 測試不同接種量--------------------------------------------------- 40 4-5 測試培養基流速對豬腎細胞生長的影響--------------------- 44 4-6 測試培養基停留於培養槽時間對豬腎細胞生長的影響--- 45 4-7 測試豬腎細胞暴露空氣時間對於生長的影響--------------- 47 4-8 測試Bellocell培養豬腎細胞(PK-15)可行性----------------- 49 4-9 測試利用新式生物反應器培樣豬瘟病毒--------------------- 50 第五章 結論與建議--------------------------------------------------------- 53 參考文獻 ------------------------------------------------------------------------ 55 表目錄 表1. 兔化豬瘟疫苗與組織培養豬瘟疫苗的比較------------------ 6 表2. 急性、慢性與遲發型豬瘟比較---------------------------------- 10 表3. .Growth of Various cell Lines in bellocell-500----------------- 18 表4. Comparison of SF-9 cell Growth and BEV production in Various Laboratory bioreators------------------------------------ 19 表5. Comparison of HEK293 Cell growth and Receptor X production in Cell Factory®/20 roller bottles and BelloCell-500Bioreactor------------------------------------------ 20 表6. Reed-Muench Methods法計算方法----------------------------- 26 表7. 比較不同材料培養PK-15 cell所用的載體量---------------- 50 表8. 細胞固定時間的比較所接細胞量與載體量------------------ 51 圖目錄 圖1. Liau提出以潮汐生物反應器圖--------------------------------- 17 圖2. Operation principle of Bellocell system------------------------- 18 圖3. 新式生物反應器(novel reactor)-潮汐式生物反應器(tidal typereactor)之運作流程圖--------------------------------------- 30 圖4. 比較不同材料培養PK-15 cell ---------------------------------- 63 圖5. 比較不同時間細胞的貼附量------------------------------------ 64 圖6. 測試的不同比例載體量培養豬腎細胞生長曲線------------ 65 圖7. 測試的不同比例載體量培養豬腎細胞培養過程glucose消耗趨勢------------------------------------------------------------ 66 圖8. 測試的不同比例載體量培養豬腎細胞培養過程pH變化------------------------------------------------------------------------ 67 圖9. 測試不同接細胞量培養在10g carrier生長曲線------------- 68 圖10. 測試不同接細胞量培養在10g 載體glucose消耗趨勢----- 69 圖11. 測試不同接細胞量培養在10g carrier pH趨勢--------------- 70 圖12. 測試流速對豬腎細胞生長的影響------------------------------ 71 圖13. 測試流速對細胞影響的葡萄糖消耗--------------------------- 72 圖14. 測試流速對豬腎細胞生長影響pH值-------------------------- 73 圖15. 測試培養基停留時間對豬腎細胞生長影響------------------ 74 圖16. 測試培養基holding時間對豬腎細胞生長的影響之葡萄糖趨勢--------------------------------------------------------------- 75 圖17. 測試培養基holding時間對細胞的影響之pH值趨勢------- 76 圖18. 測試豬腎細胞暴露空氣時間對生長的影響------------------ 77 圖19. 測試豬腎細胞暴露空氣對生長的影響葡萄糖消耗趨勢--- 78 圖20. 測試豬腎細胞暴露空氣對細胞生長的影養pH值趨勢---- 79 圖21. Bellocell反應器培養豬腎細胞---------------------------------- 80 圖22. Bellocell培養豬腎細胞葡萄糖消耗趨勢---------------------- 81 圖23. Bellocell培養豬腎細胞pH值趨勢----------------------------- 82 圖24. 測試利用新式生物反應器培養豬瘟病------------------------ 83

摘 要 本研究主要是探討利用新式生物反應器以固定化細胞培養技術生產日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus；JEV)之研究，首先根據所培養細胞的生長特性與原有生物反應器之缺點，利用已改良設計之新式生物反應器，評估此新式生物反應器適用性、效能，以及所培養細胞之生長代謝情形與病毒力價。整個實驗過程大致分為幾個階段，第一個階段探討細胞固定化培養之最適化培養條件與生長代謝情形，第二個階段找出細胞固定化培養於此新式生物反應器中最佳生長狀態，最後一個階段為病毒的培養。實驗後發現Vero細胞經固定化貼附於FIBRA-CEL®載體上，可擴大培養於新式生物反應器，Vero細胞最佳生長量達到6.6×106cells/mL。希望藉由此改良之新式生物反應器提供細胞與病毒一個良好之生長培養環境，獲得高產量、品質穩定一致之細胞生物製品，以提供ㄧ設備簡單與製程操作容易、低成本、低能源消耗之細胞製品生產基座。 / Abstract In this study, we investigated the production of Japanese encephalitis virus (JEV) by the immobilized cell technology in a novel bioreactor. According to the disadvantages of original bioreactor and growth characteristics of cell culture, we evaluated the suitability and efficiency of a design-improved novel bioreactor as well as the growth and metabolic situation of cultured cells and titers of JEV. All studies including three major stages: (1) investigation of the optimal conditions and metabolic situation for the growth of immobilized cells, (2) finding the optimal conditions for the growth of immobilized cells in this novel bioreactor, and (3) growth of JEV using immobilized cells in this novel bioreactor. Our results showed that after immobilization on the FIBRA-CEL® carries, Vero cells can grow on the novel bioreactor up to the density of 6.6 × 106 cells/mL. Hopefully, the improvement of the novel bioreactor will provide an optimal growth condition for both the cells and viruses. Furthermore, it will also provide the basis for the production of cell products with advantages of simple-equipped, easy-to-operate, low cost, and low energy consumption. / 目 錄 誌謝------------------------------------------------- i 中文摘要 -------------------------------------------- ii 英文摘要 -------------------------------------------- iii 目錄 -------------------------------------------- iv 表目錄 -------------------------------------------- v 圖目錄 -------------------------------------------- vi 第一章 緒論---------------------------------------- 1 第二章 文獻探討------------------------------------ 3 第一節 日本腦炎病毒疫苗---------------------------- 3 第二節 動物細胞的培養------------------------------ 4 第三節 載體上動物細胞的培養------------------------ 5 第四節 動物細胞培養於生物反應器-------------------- 7 第三章 材料與方法---------------------------------- 10 一 細胞株的培養-------------------------------- 10 二 細胞冷凍保存與解凍培養---------------------- 10 三 細胞滾瓶培養-------------------------------- 11 四 病毒株的培養-------------------------------- 12 五 固定化載體材料製備-------------------------- 12 六 載體上細胞數的測定-------------------------- 12 七 細胞貼壁率的計算---------------------------- 13 八 生物反應器結構特性與固定化細胞培養---------- 13 九 日本腦炎病毒力價測定------------------------ 19 十 葡萄糖的測定-------------------------------- 19 第四章 結果與討論---------------------------------- 20 一 固定化載體材料比例對Vero細胞生長的影響------ 20 二 細胞貼附固定化時間對Vero細胞生長的影響------ 23 三 細胞接種量對Vero細胞生長的影響-------------- 24 四 生物反應器培養系統對Vero細胞生長的影響------ 25 五 新鮮培養基更換對Vero細胞生長的影響---------- 27 六 最適化細胞生長條件培養日本腦炎病毒---------- 29 第五章 結論與建議---------------------------------- 30 參考文獻 -------------------------------------------- 31 附錄一 PBS配製方法--------------------------------- 62 附錄二 Medium 199配製方法-------------------------- 62 附錄三 MEM medium配製方法-------------------------- 62