Hannover, Univ., Diss., 2009

Universiẗat, Diss., 1998--Konstanz.

Zugl.: Giessen, University, Diss., 2008.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Akute periphere Nervenschädigungen, durch Traumata oder als Folge von Entzündungen, stellen ein häufiges klinisches Problem dar, denn die sensorischen, motorischen und/oder autonomen Funktionsverluste bestehen oftmals dauerhaft (Panagopoulos et al., 2017). Die zugrundeliegende inadäquate und unvollständige Nervenregeneration beruht auf einem fehlerhaften oder ausbleibenden Wachstum regenerierender Axone und der mit der Zeit verblassenden Kapazität des distalen Nervenstumpfs, die regenerierenden Axone zu unterstützen (Jessen & Mirsky, 2019). Die Anwendung derzeit verfügbarer Therapiestrategien, dabei fast ausschließlich chirurgischer Verfahren, ist zumeist nicht ausreichend, um den Prozess der Nervenreparatur zu verkürzen und eine adäquate Funktion der Nerven wiederherzustellen (Panagopoulos et al., 2017). Im Fokus aktueller Forschung und der vorliegenden Doktorarbeit steht daher die Entwicklung pharmakologischer Therapieansätze, die die chirurgische Versorgung von Nervenläsionen ergänzen könnten. Der schon während der Entwicklung des Nervensystems essentiellen symbiotischen Einheit von Axonen und Schwannzellen kommt im Zuge der Nervenregeneration erneut eine große Bedeutung zu. Nach einer akuten Nervenschädigung wechseln Schwannzellen vom Instandhalten der Axone zum Abbau dieser, bis hin zur Unterstützung des erneuten Aufbaus von Axonen und deren Remyelinisierung (Stassart & Woodhoo, 2021). Vorarbeiten der AG Fledrich haben erstmals eine Beeinflussung der Nervenregeneration über den Leptin-Rezeptor in Schwannzellen aufgezeigt. So ist die Nervenregeneration im Mausmodell nach experimenteller Nervenläsion infolge der konditionalen Ablation des Leptin-Rezeptors in Schwannzellen beeinträchtigt (Manuskript Sundaram & Schütza et al., 2023, siehe Anlagen). Basierend auf dieser Entdeckung wurde für die vorliegende Arbeit in einem loss-of-function-Ansatz eine konditionale Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten durchgeführt, wodurch ein Mangel an Leptin induziert wurde, und dessen Einfluss auf die periphere Nervenregeneration nach akuter Nervenschädigung untersucht. Die elektrophysiologischen und histologischen Analysen zeigten eine verminderte Anzahl regenerierter, funktionsfähiger Axone und somit eine beeinträchtigte periphere Nervenregeneration unter Leptin-Mangel. Demgegenüber wurden wildtypische Mäuse im Anschluss an eine experimentelle Nervenläsion mit pharmakologisch appliziertem Leptin behandelt. Dies resultierte in einer verbesserten Nervenregeneration. Erkennbar wurde dies sowohl in der funktionellen Ganganalyse als auch in den elektrophysiologischen und histologischen Untersuchungen durch die erhöhte Anzahl regenerierter Axone mit verstärkter Remyelinisierung unter Leptin Behandlung. Die Ergebnisse sind neben den Vorarbeiten und erbrachten Folgeexperimenten der AG Fledrich Bestandteil des in den Anlagen beigefügten zur Publikation eingereichten Manuskripts Sundaram & Schütza et al., 2023. In der Zusammenschau lässt sich ableiten, dass Leptin über eine gliale Signalwirkung den Prozess der Nervenreparatur positiv beeinflusst, indem es die Autophagie innerhalb des distalen Nervenstumpfs und das neue Auswachsen der Axone sowie deren Remyelinisierung fördert. Mechanistisch könnte Leptin die Energieversorgung der Reparatur-Schwannzellen durch eine erhöhte Leistung der oxidativen Phosphorylierung und Myelinophagie begünstigen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bilden eine Grundlage für zukünftige Studien mit dem Ziel, das gewonnene Wissen in die klinische Praxis zu überführen und eine pharmakologische Behandlung akuter peripherer Nervenschädigungen zu etablieren.:Abkürzungsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis V Tabellenverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Das periphere Nervensystem 1 1.2 Neurone und Gliazellen 1 1.2.1 Signaltransduktion und Myelinisierung 3 1.2.2 Entwicklung der Schwannzelle und axo-gliale Interdependenz 6 1.3 Akute periphere Nervenschädigungen 9 1.3.1 Degenerationsprozesse 11 1.3.2 Regeneration peripherer Nerven und Remyelinisierung 14 1.3.3 Veränderungen im Metabolismus peripherer Nerven nach akuter Nervenschädigung 17 1.4 Leptin und der Leptin-Rezeptor 20 1.4.1 Physiologische Funktionen von Leptin 20 1.4.2 Leptin und das periphere Nervensystem 23 1.5 Zielsetzung und Fragestellung 25 2 Material und Methoden 27 2.1 Material 27 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien 27 2.1.2 Puffer und Pufferlösungen 29 2.1.3 Antikörper 33 2.1.4 Inhibitoren, Enzyme und Hormone 34 2.1.5 Kits 34 2.1.6 Genotypisierungs-Primer 35 2.1.7 Verbrauchsmaterialien 35 2.1.8 Geräte 36 2.1.9 Software 37 2.2 Methoden 39 2.2.1 Versuchstiere 39 2.2.1.1 Identifikation der Tiere 39 2.2.1.2 Tamoxifen-Behandlung 39 2.2.1.3 Implantation der ALZET®-Pumpen und Leptin-Behandlung 40 2.2.1.4 Nervenläsion 42 2.2.1.5 Narkotisierung und Tötung der Versuchstiere 43 2.2.1.6 Probenentnahme und Verarbeitung des biologischen Materials 44 2.2.2 Phänotypisierung mittels DigiGaitTM-Ganganalyse 44 2.2.3 Elektrophysiologische Untersuchung 46 2.2.4 Gewebekultur 47 2.2.5 Histologische Methoden 48 2.2.5.1 Einbettung in Agar 100 Resin 48 2.2.5.2 Anfertigung, Aufnahme und Auswertung von Semidünnschnitten 50 2.2.6 Proteinbiochemische Methoden 51 2.2.6.1 Proteinisolation und -quantifizierung 51 2.2.6.2 SDS-Gelelektrophorese 52 2.2.6.3 Western Blotting und Immundetektion 53 2.2.6.4 Nachweis von Serum-Leptin mittels ELISA 55 2.2.7 Nukleinsäure-Analyse 57 2.2.7.1 Isolation genomischer DNA aus Schwanzproben 57 2.2.7.2 Genotypisierung der DNA mittels PCR 57 2.2.7.3 Agarose-Gelelektrophorese der genomischen DNA 59 2.2.8 Statistik 59   3 Ergebnisse 61 3.1 Ex vivo-Untersuchungen geben Aufschluss über Leistungen der oxidativen Phosphorylierung, Autophagie und β-Oxidation während der Nervendegeneration 61 3.1.1 Die ex vivo-Behandlung mit Leptin steigert die Autophagie-Leistung im degenerierenden Nerv 61 3.1.2 Während der Nervendegeneration ist die Expression von Proteinen der oxidativen Phosphorylierung erhöht 63 3.1.3 Die Blockade der Autophagie reduziert die Expression von Proteinen der oxidativen Phosphorylierung im degenerierenden Nerv 64 3.1.4 Die Inhibition des Komplex I der oxidativen Phosphorylierung führt zur Verminderung der Autophagie-Leistung während der Nervendegeneration 65 3.1.5 Die Blockade der Fettsäureoxidation inhibiert die Autophagie 66 3.2 Die Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten beeinträchtigt die Nervenregeneration 68 3.2.1 Die Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten vermindert den Leptin-Spiegel im Blutserum und erhöht das Körpergewicht der Tiere 68 3.2.2 Die Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten resultiert in einem verringerten Muskelsummenaktionspotential von regenerierenden Nerven 69 3.2.3 Die Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten führt zu einer verminderten Anzahl remyelinisierter Axone in regenerierenden Nerven 71 3.3 Die pharmakologische Behandlung mit Leptin fördert die Nervenregeneration in vivo 73 3.3.1 Die Applikation von Leptin über ALZET®-Pumpen führt zu einer Erhöhung des Leptin-Spiegels im Blutserum und zu einer Reduzierung des Körpergewichts der Tiere 73 3.3.2 Die Gabe von Leptin beschleunigt die Wiederherstellung motorischer Funktionen nach akuter Nervenschädigung 74 3.3.3 Die pharmakologische Gabe von Leptin optimiert die Nervenleitgeschwindigkeit und das Muskelsummenaktionspotential von regenerierenden Nerven 78 3.3.4 Die Behandlung mit Leptin verbessert die Remyelinisierung nach akuter Nervenschädigung 79 4 Diskussion 81 4.1 Die während der Nervendegeneration ablaufenden metabolischen Prozesse stehen in einem Abhängigkeitsverhältnis zueinander und lassen sich durch die Gabe von Leptin beeinflussen 82 4.2 In vivo resultiert die Abwesenheit von zirkulierendem Leptin durch Ablation des Leptin-Gens in Adipozyten in einer beeinträchtigten Nervenregeneration 84 4.3 Pharmakologisch appliziertes Leptin fördert den Prozess der Nervenregeneration in vivo 85 5 Zusammenfassung 88 Literaturverzeichnis VIII Danksagung XVII Lebenslauf XVIII Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XX Anlagen XXI

Als Therapieversuch bei Plexusläsionen wird die Replantation ausgerissener Vorderwurzelfasern durchgeführt. Voraussetzung für die erfolgreiche Regeneration von Motoneuronaxonen sind 1. Überleben einer ausreichenden Anzahl von Motoneuronen 2. erfolgreiche Wiederherstellung der Kontuität ausgerissener Axone mit dem Rückenmark und 3. funktionelle Hochwertigkeit regenerierter Axone. Neurotrophe Faktoren können Überleben und Regenerationsfähigkeit von Motoneuronen fördern. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Analyse des Einflusses von CNTF und BDNF auf die Regeneration von Motoneuronaxonen nach Ausriss und Replantation im Segment C7 nach einer Überlebenszeit von 3 Wochen bzw. 6 Monaten. Vervollständigt wurden diese Untersuchungen durch detaillierte morphologische Analysen von Spinalganglien, durchtrennter Hinterwurzel und verletztem Hinterhorn. In verschiedenen Gruppen von adulten Kaninchen wurden CNTF, BDNF, oder beide Faktoren auf die ventrolaterale Replantationsstelle appliziert, Kontrollen wurden ohne Faktor belassen (n>5). Die Überlebenszeit der Versuchstiere lag bei 3 Wochen (n=3 Kontrollen) und 6 Monaten (n=27). Aus dem perfundiertem Gewebe wurden Semidünnschnitte durch Vorderwurzel/Spinalganglien und Kryostatserienschnitte durch das Segment C7 angefertigt. DiI-Fluoreszenztracing, Markscheidenfärbung, eine modifizierte Klüver-Barrera-Färbung der Kryostatschnitte sowie eine Touloidinblaufärbung der Semidünnschnitte ermöglichte die morphologische und morphometrische Analyse des Gewebes. Die Anzahl der überlebenden Motoneurone lag nach sechs Monaten bei allen Versuchsgruppen bei etwa 30%. Fluoreszenz-Tracing und Markscheidenfärbungen von Serienschnitten zeigten, dass Axone sowohl über die ursprünglichen ventralen Austrittstellen als auch über die ventrolaterale Replantationsstelle das Rückenmark verließen und im Bereich des Spinalganglions eine kompakte Vorderwurzel bildeten. Ventral austretende Axone zeigten signifikant größere Durchmesser als lateral austretende. Ausmaß und Art der Regeneration waren interindividuell unterschiedlich, die besten Ergebnisse zeigte die Replantation nah am ursprünglichen Austrittsort der Vorderwurzel. Unterschiede zwischen den Gruppen waren nicht deutlich. In Semidünnschnitten durch die regenerierte Vorderwurzel fanden sich nach drei Wochen kaum intakte, myelinisierte Axone, nach sechs Monaten war die Zahl der Axone auf etwa 45% der Zahl der gesunden Seite angestiegen. Regenerierte Axone waren dünn, typische Motoneuronaxone stellten nur einen kleinen Teil der regenerierten Axone. Gruppenunterschiede fanden sich im Axon-Myelinverhältnis, das bei Kontrollen der replantierten Seiten signifikant erniedrigt war. Diese Erniedrigung war noch vorhanden, jedoch nicht mehr signifikant bei Tieren, die mit CNTF- und BDNF-behandelt wurden. Die replantierten Vorderwurzeln der CNTF+BDNF-Gruppe zeigte überwiegend eine signifikant bessere Myelinisierung als die replantierten Kontrollen. An der früheren Hinterwurzeleintrittszone am Rückenmark wurden in Tieren mit geringem Verletzungsausmaß kleine ZNS-Gewebsprotrusionen beobachtet, in denen sich myelinisierte Axone befanden. Diese Axone zeigten eine Wachstumsrichtung in die Peripherie, was auf eine Sprossung der sensorischen Rückenmarksneurone schließen lässt. Innerhalb des Spinalganglions waren Neuron- und Axondichte auf den verletzten Seiten nicht wesentlich verändert. Eine leichte Abnahme des relativen Anteils großer Neurone und Axone wurde in den verletzten Seiten der Kontrollgruppe beobachtet. Für Axone war diese Abnahme statistisch signifikant. Im Gegensatz dazu war dies in Tieren, die mit neurotrophen Faktoren behandelt wurden, nicht zu beobachten. Bei allen Tieren zeigte sich ein beträchtliches Auswachsen von Hinterwurzelaxonen aus dem Spinalganglion. Diese Axone fanden keine spontane Verbindung mit dem proximalen Rest der Wurzel, sondern waren durch Bindegewebe eingehüllt. Bei etwa der Hälfte der Tiere zeigte sich, dass einer Untergruppe dieser Axone in Richtung des Narbengewebes der replantierten Vorderwurzel gewachsen war und über Defekte in der Bindegewebshülle teilweise sogar in die Vorderwurzel einwuchsen. Ein möglicher Einfluss der applizierten neurotrophen Faktoren auf das quantitative Regenerationsergebnis scheint also in diesem Modell gering zu sein. Auf eine qualitative Verbesserung deutet die Normalisierung des Axon-Myelinverhältnisses großer regenerierter Axone bei Kombinationsbehandlung hin. Die im vorliegenden Modell beträchtliche Regenerationskapazität der Hinterwurzel scheint bisher unterschätzt worden zu sein. Das unerwartete Einwachsen von Hinterwurzelaxonen in die Vorderwurzel könnte mit einer funktionellen Beeinträchtigung der regenerierten Vorderwurzel verbunden sein. / Treatment of brachial plexus lesions is attempted by surgical replantation of avulsed nerve roots. Prerequisites for successful regeneration of motoneuron axons are 1. survival of a large number of motoneurons, 2. restoration of connectivity between avulsed nerve roots and spinal cord and 3. high quality of regenerated axons. Regeneration and survival of motoneurons can be supported by neurotrophic factors. In the present study, the influence of CNTF and BDNF on regeneration of motoneurons after C7 ventral root avulsion and replantation after 3 weeks and 6 months was analysed. Additionally, detailed morphological analyses of dorsal root ganglia (DRG), severed dorsal roots and injured dorsal horns were performed. In adult rabbits C7 dorsal roots were severed, ventral roots were avulsed and replanted ventrolaterally. CNTF, BDNF, or both was applied to the replantation site, controls were replanted without application of neurotrophic factors (n>5). After 3 weeks (n= 3 controls) and 6 months (n= 27) after avulsion and replantation semi-thin sections of ventral roots and DRGs as well as cryostat serial sections from C7 spinal cord segment were prepared. DiI-fluorescence tracing, myelin-sheath staining, modified Klüver-Barrera staining of cryostat section and touloidinblue staining of semi-thin sections served for morphological and quantitative analyses. Six months after lesion, a survival of 30% of the C7 motoneurons was found without differences between the experimental groups. Retrograde fluorescent tracing and histological analysis documented that many axons had regrown through the original ventral exit zones or had exited the spinal cord at the lateral replantation site. However, many laterally exiting axons had not grown out directly from the ventral horn through the lateral white matter but had elongated vertically before leaving the spinal cord. The mean axonal diameter was significantly higher in regenerated axons that had exited through the original ventral exit zones in comparison with axons which had grown out laterally. Application of BDNF and/or CNTF did not show any effects on the pathways of regeneration into the replanted root. Three weeks after ventral root avulsion and replantation the number of axons was rare. After six months, the number of myelinated axons increased to 45% compared to unlesioned sides. Regenerated axons were mainly of small caliber with few axons showing typical properties of motoneuron axons. In controls myelination was significantly reduced compared to the unlesioned sides. This was not observed after CNTF, BDNF and CNTF+BDNF treatment. In CNTF+BDNF treated animals myelination was significantly increased compared to replanted controls in the majority of cases. At the dorsal root entry zone, small myelinated axons extended into central tissue protrusions, in cases with well-preserved morphology. This suggested sprouting of spinal neuron processes into the central dorsal root remnant. In lesioned DRGs, the density of neurons and myelinated axons was not significantly altered, but a slight decrease in the relative frequency of large neurons and an increase of small myelinated axons was noted (significant for axons). Unexpectedly, differences in the degree of these changes were found between control and neurotrophic factor-treated animals. Central axons of DRG neurons formed dorsal root stumps of considerable length which were attached to fibrous tissue surrounding the replanted ventral root. In cases where gaps were apparent in dorsal root sheaths, a subgroup of dorsal root axons entered this fibrous tissue. Continuity of sensory axons with the spinal cord was never observed. Some axons coursed ventrally in the direction of the spinal nerve. In summary, the number of surviving motoneurons and regenerating axons appeared not to be influenced by a single- dose application of neurotrophic factors in this model. However, improvement of myelination indicated that the quality of regeneration can be increased especially by CNTF+BDNF- treatment. Moreover, the considerable capacity of dorsal root regeneration we observed in this study has possibly been underestimated previously. The unexpected ingrowth of dorsal root axons into the regenerated ventral roots could be harmful for ventral root regeneration.

Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss.

No abstract available

Konstanz, University, Diss., 2005.