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Caracterização estrutural e bioquí­mica de LsfA, uma 1-Cys Prx envolvida na virulência de Pseudomonas aeruginosa / Structural and biochemical characterization of LsfA, a 1-Cys Prx related with Pseudomonas aeruginosa virulence

Silva, Rogério Luis Aleixo 30 May 2018 (has links)
Pseudomonas aeruginosa é uma gamma-proteobacteria ubíqua, sendo a principal causa de infecção hospitalar dentre todos os patógenos relacionados com pneumonia em UTI. A defesa do hospedeiro se dá por vários mecanismos como a liberação, por fagócitos, de espécies reativas de oxigênio, como o ânion superóxido (O2?-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxila (OH?) para combater o patógeno. LsfA pertence à família das peroxirredoxinas (Prx) e ao sub-grupo de Prxs que contém somente uma cisteína catalítica (denominadas 1-Cys Prx). Prxs são enzimas capazes de remover peróxidos (incluindo peroxinitrito) em velocidades muito elevadas. Além disso, LsfA está relacionada a patogenicidade de P. aeruginosa. Dentro desse contexto, o objetivo do presente trabalho é a caracterização bioquímica e estrutural de LsfA; que pode possibilitar a identificação de inibidores dessa enzima antioxidante. Por outro lado, caracterizando cineticamente reações de oxido-redução de LsfA e caracterizando seus mecanismos de ação, podemos identificar seus substratos biológicos. Dessa maneira, utilizando diferentes técnicas, determinamos as constantes de segunda ordem de LsfA com H2O2 (na ordem de 107 M -1.s -1); para terc-butilhidroperóxido (na ordem de 106 M-1.s-1) e peroxinitrito (na ordem de 107 M-1.s-1). A redução de LsfA por ascorbato foi descrita previamente por nosso grupo (na ordem de 103 M-1.s-1); e aqui apresentamos dados preliminares sobre a redução dessa 1-Cys Prx por GSH. Além disso, fomos capazes de determinar a estrutura cristalográfica de LsfA em sua forma oxidada e superoxidada, com resolução de 2.6 e 2.0 ? respectivamente; que, como esperado, se apresentou no estado dimérico, em ambos os casos. Descrevemos aqui características sobre a estrutura do sítio ativo de LsfA, que apresenta mais eletronegativo, com a cisteína peroxidásica desprotonada, e mais hidrofóbico. Na estrutura de LsfA superoxidada, observamos a co-cristalização dessa enzima com uma molécula de polietileno glicol que pode estar mimetizando um substrato. Portanto, esses estudos levantaram importantes informações estruturais e bioquímicas de uma enzima antioxidante envolvida com a virulência de P. aeruginosa / Pseudomonas aeruginosa is a ubiquous gamma-proteobacteria that is the main cause of hospitalar infections among all pathogens related with pneumonia. Host defenses against pathogens are mainly by phagocytes, which releases reactive oxygen species, such as superoxide (O2?-), hydrogen peroxide (H2O2) and hydroxyl radical (OH?) to fight against pathogen. LsfA belongs to peroxiredoxins (Prx) family; and to the 1-Cys Prx sub-group (Prx6 sub-family) that possess only one catalytic cysteine. Prx are enzymes can remove peroxides with extremely high efficiency. LsfA was already related with P. aeruginosa virulence. So, the aim of the present work is the structural and biochemical characterization of LsfA, which may enable the discovery of inhibitors. Furthermore, the investigation of the kinetics and the mechanism of catalysis of LsfA may give insights on the chemical nature of its biological substrates. Therefore, using different techniques; the second order rate constants of LsfA with H2O2 (107 M -1.s -1), tert-butylhydroperoxide (106 M -1.s -1) and peroxynitrite (107 M -1.s -1) were determined. Our group has already determined the rate constant between ascorbate and LsfA (103 M -1.s -1) and preliminary data on the reduction of this 1-Cys Prx by glutathione is described. Furthermore, two crystallographic structures of LsfA were elucidated in distinct oxidative states (sulfenic and sulfonic acid in the CP), both in the dimeric state; at 2.6 and 2.0 ? resolution respectively. Features in the LsfA active site are also described here, such as poor exposure to the solvent. In the LsfA crystal structure where Cp is hyperoxidized to sulfinic acid, we observed the presence of an electronic density compatible with a PEG molecule that might be mimicking one of the possible substrates. Therefore, relevant structural and biochemical information were gained with our studies about an antioxidant enzyme involved with P aeruginosa virulence
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Caracterização bioquí­mica e estrutural de peroxirredoxinas de Aspergillus fumigatus, fungo patógeno oportunista humano / Biochemical and structural characterization of peroxiredoxins from Aspergillus fumigatus, human opportunistic pathogen

Fernandes, Renata Bannitz 27 March 2019 (has links)
Peroxirredoxinas (Prxs) são peroxidases muito eficientes que dependem de uma tríade catalítica composta por uma Thr (ou Ser em alguns casos), uma Cys e uma Arg para decompor peróxidos. Elas podem ser classificadas em 1-Cys Prx e 2-Cys Prx, de acordo com o número de Cys envolvidas na catálise, ou de acordo com características estruturais que dividem as Prxs em 6 subfamílias. A grande maioria das enzimas da subfamília Prx6 é composta por 1-Cys Prx. As Prx6 são ainda pouco caracterizadas e a identidade biológica de seu (s) redutor (es) ainda é controversa. Alguns dos redutores candidatos são a Trx e o ascorbato. As Prx6 de mamíferos também possuem atividade de fosfolipase do tipo A2 (PLA2), que depende de uma tríade catalítica composta por uma His, uma Ser e um Asp. Nessa tese, investigamos aspectos bioquímicos e estruturais de duas enzimas da subfamília Prx6 de Aspergillus fumigatus: a AfPrx1 citossólica e a AfPrxC mitocondrial. A. fumigatus é o mais importante fungo patogênico transmitido pelo ar. Inicialmente, caracterizamos as cinéticas de oxidação de AfPrx1 e AfPrxC por H2O2, t-BOOH, CuOOH, LAOOH e ONOO-, monitorando alterações redox-dependentes das fluorescência intrínseca dessas proteínas. Adicionalmente, avaliamos as reduções de AfPrx1 e AfPrxC por Trx, Grx, ascorbato, ergotioneína, GSH e H2S. Apenas H2S reduziu eficientemente AfPrx1 e AfPrxC (κAfPrx1 ≈ 103 M-1 s-1 e κAfPrxC ≈ 104 M-1 s-1). Além da atividade peroxidásica, utilizamos lipossomos radioativos para caracterizar pela primeira vez atividade fosfolipásica (PLA2) para uma Prx de não-mamífero que AfPrx1 e AfPrxC possuem. Esta atividade (≈ 200 nmol/ h/ mg de proteína) pode ser inibida por MJ33 (aproximadamente 75 %) e aumentada pela fosforilação através de MAPK. Adicionalmente, estas proteínas estão envolvidas na sobrevivência do fungo durante interação com macrófagos. Utilizando microeletrodo, pudemos verificar que AfPrx1 é importante para detoxificar o fungo de H2O2 exógeno. A caracterização bioquímica destas atividades catalíticas das Prxs pode abrir novas perspectivas para tratamentos, já que pelo menos AfPrx1 está envolvida na virulência de A. fumigatus em ensaios com camundongos / Peroxiredoxins (Prxs) are highly efficient peroxidases that depend on a catalytic triad composed of Thr/Ser, Cys and Arg residues. These enzymes can be classified as 2-Cys Prx and 1-Cys Prx, according to the number of Cys residues involved in catalysis or according to structural characteristics that divide the Prxs in 6 subfamilies. The Prx6 subfamily is almost exclusively composed by 1-Cys Prx enzymes. This subfamily is still poorly characterized and the identities of their biological reductants are still controversial. Some of the reductant candidates are thioredoxin (Trx) and ascorbate. The mammalian members of this subfamily possess an additional phospholipase A2 (PLA2) activity that relies on another catalytic triad that is composed by His, Ser and Asp residues. In this thesis, we investigated biochemical and structural aspects of two enzymes belonging to the Prx6 subfamily from Aspergillus fumigatus: the cytosolic AfPrx1 and the mitochondrial AfPrxC. A. fumigatus is the most important pathogenic fungus transmitted through the air. Initially, we characterized the oxidation of AfPrx1 and AfPrxC by H2O2, t-BOOH, CuOOH, LAOOH and ONOO-, monitoring redox dependent changes in the intrinsic fluorescence of these enzymes. Additionally, we characterized the reduction of AfPrx1 and AfPrxC by Trx, Grx, ascorbate, ergothioneine, GSH and H2S. Interestingly, only H2S reduced these proteins efficiently κAfPrx1 ≈ 103 M-1 s-1 and κk;AfPrxC ≈ 104 M-1 s-1). In addition to the peroxidase activity, we determined for the first time the phospholipase activity (PLA2) for a non-mammalian Prx, using liposomes radioactive-labeled. AfPrx1 and AfPrxC displayed PLA2 activity (≈ 200 nmol/ h/ mg of protein) that was inhibited by MJ33 (about 75 %) and enhanced after phosphorylation by MAPK. Moreover, we also showed that these proteins were important for fungus survival during studies co-cultures with macrophages. Furthermore, AfPrx1 was important to detoxify A. fumigatus from exogenous added H2O2 as observed through an electrochemical approach. The biochemical and structural characterization of these Prxs described herein can open new therapeutic strategies, since at least AfPrx1 is involved in fungus virulence in a mouse model

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