Os conhecimentos sobre a regulação dos níveis de cálcio e manganês no Aspergillus fumigatus são bastante limitados, sendo que a homeostase destes íons pode ser diretamente controlada pela ação de ATPases específicas, dentre elas as cálcio ATPases da subfamília PMR1. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi a expressão, caracterização e validação como alvo quimioterapêutico do gene Afpmr1 de A. fumigatus. Inicialmente, foi realizada a complementação funcional, de uma cepa de S. cerevisiae nocaute para a PMR1, em meios de cultura suplementados com EGTA ou manganês, revertendo o fenótipo da cepa nocute. Além disto, após expressão do gene Afpmr1, foi verificada uma reversão na intensa distribuição de quitina na parede celular da cepa nocaute. Paralelamente, para a RNAi, um fragmento do gene Afpmr1 apresentando baixa identidade com outros genes de cálcio ATPases de diferentes espécies foi clonado em vetor de expressão em A. fumigatus (pALB1). Após indução da expressão, a construção de RNA dupla fita para RNAi silenciou tanto o gene alb1 isoladamente (clone controle), quanto o duplo silenciamento com o gene de interesse Afpmr1, conferindo à ambas construções coloração branca às colônias. Uma vez confirmado o silenciamento gênico, por técnicas de RT-PCR quantitativo, os clones selecionados foram utilizados em ensaios de fagocitose e killing de macrófagos. O clone com o gene Afpmr1 silenciado apresentou diminuição na porcentagem de fagocitose, no número médio de conídios fagocitados e na eficiência de eliminação destes conídios quando comparados com seus controles. Estes resultados mostram que o gene Afpmr1 pode ser expresso funcionalmente em sistemas heterólogos e seu silenciamento, em A. fumigatus, influencia processos celulares que podem estar relacionados à manutenção da estrutura e composição da parede celular, além de desencadear alterações na fagocitose e killing de macrófagos. / The knowledge about the regulation of Aspergillus fumigatus calcium and manganese levels are very limited, while these ions homeostasis could be directly controlled by the function of specific ATPases, like the PMR1 calcium ATPase. In this way, the aim of the present work was the expression, characterization e validation, as chemotherapeutic target, of the A. fumigatus Afpmr1 gene. Initially, the functional complementation of a PMR1 knock-out strain phenotype was analyzed in EGTA or manganese supplemented culture media. Besides, after Afpmr1 expression, an intense distribution of chitin through the cell wall of the knock-out strain was reversed. At the same time, a fragment of the Afpmr1 gene, showing low identity values for another calcium ATPase genes, was cloned in an A. fumigatus expression vector (pALB1) for RNAi. After the induction of gene expression, a double strand RNA construct for RNAi has properly silenced either the alb1 gene alone (control clone), or the double silencing with the gene of interest Afpmr1, leading to both constructions white colored colonies. After confirmation of the gene silencing by quantitative RT-PCR techniques, the selected clones were used in macrophages killing and phagocytosis assays. The Afpmr1 silenced clone showed a decrease in the phagocytosis percentage, in the mean number of internalized conidia and in the killing percentage when compared with control groups. These results show that the Afpmr1 gene can be functionally expressed in eukaryotic heterologous systems and its silencing, in A. fumigatus, alters cellular processes that can be related with the maintenance of the cell wall structure and composition, as well as promote alterations in the macrophages phagocytosis and killing.

Os conhecimentos sobre a regulação dos níveis de cálcio e manganês no Aspergillus fumigatus são bastante limitados, sendo que a homeostase destes íons pode ser diretamente controlada pela ação de ATPases específicas, dentre elas as cálcio ATPases da subfamília PMR1. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi a expressão, caracterização e validação como alvo quimioterapêutico do gene Afpmr1 de A. fumigatus. Inicialmente, foi realizada a complementação funcional, de uma cepa de S. cerevisiae nocaute para a PMR1, em meios de cultura suplementados com EGTA ou manganês, revertendo o fenótipo da cepa nocute. Além disto, após expressão do gene Afpmr1, foi verificada uma reversão na intensa distribuição de quitina na parede celular da cepa nocaute. Paralelamente, para a RNAi, um fragmento do gene Afpmr1 apresentando baixa identidade com outros genes de cálcio ATPases de diferentes espécies foi clonado em vetor de expressão em A. fumigatus (pALB1). Após indução da expressão, a construção de RNA dupla fita para RNAi silenciou tanto o gene alb1 isoladamente (clone controle), quanto o duplo silenciamento com o gene de interesse Afpmr1, conferindo à ambas construções coloração branca às colônias. Uma vez confirmado o silenciamento gênico, por técnicas de RT-PCR quantitativo, os clones selecionados foram utilizados em ensaios de fagocitose e killing de macrófagos. O clone com o gene Afpmr1 silenciado apresentou diminuição na porcentagem de fagocitose, no número médio de conídios fagocitados e na eficiência de eliminação destes conídios quando comparados com seus controles. Estes resultados mostram que o gene Afpmr1 pode ser expresso funcionalmente em sistemas heterólogos e seu silenciamento, em A. fumigatus, influencia processos celulares que podem estar relacionados à manutenção da estrutura e composição da parede celular, além de desencadear alterações na fagocitose e killing de macrófagos. / The knowledge about the regulation of Aspergillus fumigatus calcium and manganese levels are very limited, while these ions homeostasis could be directly controlled by the function of specific ATPases, like the PMR1 calcium ATPase. In this way, the aim of the present work was the expression, characterization e validation, as chemotherapeutic target, of the A. fumigatus Afpmr1 gene. Initially, the functional complementation of a PMR1 knock-out strain phenotype was analyzed in EGTA or manganese supplemented culture media. Besides, after Afpmr1 expression, an intense distribution of chitin through the cell wall of the knock-out strain was reversed. At the same time, a fragment of the Afpmr1 gene, showing low identity values for another calcium ATPase genes, was cloned in an A. fumigatus expression vector (pALB1) for RNAi. After the induction of gene expression, a double strand RNA construct for RNAi has properly silenced either the alb1 gene alone (control clone), or the double silencing with the gene of interest Afpmr1, leading to both constructions white colored colonies. After confirmation of the gene silencing by quantitative RT-PCR techniques, the selected clones were used in macrophages killing and phagocytosis assays. The Afpmr1 silenced clone showed a decrease in the phagocytosis percentage, in the mean number of internalized conidia and in the killing percentage when compared with control groups. These results show that the Afpmr1 gene can be functionally expressed in eukaryotic heterologous systems and its silencing, in A. fumigatus, alters cellular processes that can be related with the maintenance of the cell wall structure and composition, as well as promote alterations in the macrophages phagocytosis and killing.