Oι COUP-TFs (Chicken Ovalvumin Upstream Promoter – Transcription Factors) είναι ορφανοί πυρηνικοί υποδοχείς που ανήκουν στην υπεροικογένεια των υποδοχέων στεροειδών/θυρεοειδών ορμονών. Εμφανίζουν μεγάλη ομολογία σε όλα τα μετάζωα και εκφράζονται κατά προτίμηση στο νευρικό σύστημα. Εκτός της συντηρημένης αλληλουχίας τους, επίσης συντηρημένες είναι και οι θέσεις των εσoνίων στους διάφορους οργανισμούς ενώ, μέχρι πρόσφατα, δεν είχε παρατηρηθεί εναλλακτικό μάτισμα. Ωστόσο έχουμε δείξει ότι στα εχινόδερμα, υπάρχουν δύο μετάγραφα, αποτέλεσμα εναλλακτικού ματίσματος ενός μικρού εξονίου 63 bps. Τα δύο mRNAs παράγουν δύο πρωτεΐνες, η μεγαλύτερη εκ των οποίων περιέχει 21 επιπρόσθετα αμινοξέα στην κάρβοξυ-τελική επέκταση της περιοχής πρόσδεσης στο DNA (DBD). Πειράματα EMSA έδειξαν ότι η μικρή ισομορφή του COUP-TF, ως ομοδιμερές, προσδένεται με διαφoρετική συγγένεια σε όλα τα στοιχεία απόκρισης που εξετάστηκαν. Η μεγάλη ισομορφή εν αντιθέσει, δεν προσδένεται αποτελεσματικά σε κανένα από αυτά τα στοιχεία απόκρισης, ούτε ως ομοδιμερές ούτε ως ετεροδιμερές με τη μικρή ισομορφή. Επίσης, πειράματα ανοσοφθορισμού, έχουν δείξει ότι σε έμβρυα αχινού στο στάδιο των 16 κυττάρων, η μεγάλη πρωτεΐνη εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, ενώ για τη μικρή πρωτεΐνη είναι γνωστή η παρουσία της στον πυρήνα. Ο σκοπός της εργασίας αυτής είναι η μελέτη του ρόλου της ένθεσης των 21 αμινοξέων στην μεγάλη ισομορφή, όσον αφορά στην κυτταρική διαμερισματοποίηση και στη συγγένεια πρόσδεσης στο DNA. Στην ένθεση αυτή υπάρχουν δύο προλίνες και τρείς θρεονίνες. Η προλίνη γενικότερα βρίσκεται σε σημεία όπου μία πρωτεΐνη κάμπτεται. Η υπόθεσή μας είναι ότι οι προλίνες αυτές παίζουν σημαντικό ρόλο στη στερεοδιαμόρφωση της πρωτεΐνης, που με τη σειρά της είναι υπεύθυνη για τις αλλαγές που παρατηρούνται στη μεγάλη ισομορφή, ως προς την συγγένεια πρόσδεσης στο DNA και την κυτταρική διαμερισματοποίηση, σε σχέση με την μικρή. Επίσης η θρεονίνη είναι ένα αμινοξύ που μπορεί να δεκτεί φωσφορυλίωση. Γεγονότα φωσφορυλίωσης και αποφοσφωρυλίωσης μπορεί να επηρεάζουν την ικανότητα πρόσδεσης και την κυτταρική διαμερισματοποίηση του υποδοχέα. 2 Για να ελεχθούν οι υποθέσεις αυτές, μεταλλάχθηκαν οι δύο προλίνες και οι τρεις θρεονίνες της μεγάλης ισομορφής σε αλανίνες, παράχθηκαν in vitro οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες και προσδιορίστηκε η συγγένεια πρόσδεσης τους στο DNA με πειράματα EMSA. Οι ίδιες μεταλλάξεις πραγματοποιήθηκαν και σε ένα κατασκεύασμα το οποίο κωδικοποιεί για τη χιμαιρική πρωτεΐνη που αποτελείται από τη μεγάλη ισομορφή και τη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη. Τα in vitro παραχθέντα RNAs ενέθηκαν σε έμβρυα αχινού ώστε να μελετηθεί η ενδοκυτταρική κατανομή της μεγάλης COUP-TF ισομορφής. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι δύο προλίνες δεν φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο όσον αφορά την πρόσδεση της μεγάλης COUP-TF ισομορφής ως ομοδιμερές. Εντούτοις οι δύο αυτές προλίνες φαίνεται να επηρεάζουν την πρόσδεση της μεγάλης ισομορφής COUP-TF ως ετεροδιμερές με τρόπο ώστε να την ενισχύει. / -