No description available.

No description available.

No description available.

- / -

Tο γονίδιο COUP-TF κωδικοποιεί έναν ορφανό υποδοχέα ο οποίος δρα ως μεταγραφικός παράγοντας και ανήκει στην υπεροικογένεια των υποδοχέων των στεροειδών/ θυρεοειδών ορμονών. Στον αχινό το γονίδιο COUP-TF εκφράζεται στο στοματικό έξώδερμα στο αναπτυξιακό στάδιο του γαστριδίου και στη βλεφαριδωτή ζώνη στο στάδιο του πλουτέα. Aργότερα κατά την ανάπτυξη της νύμφης εκφράζεται αποκλειστικά στα νευρικά κύτταρα και στον ενήλικα αχινό στις ωοθήκες, σε μυικά κύτταρα και άλλους ιστούς (Chan et.al. 1992). Στόχος των συγκεκριμένων πειραμάτων είναι η μελέτη της ρύθμισης του γονιδίου COUPTF στα αναπτυξιακά στάδια του γαστριδίου και του πλουτέα. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε μια λεπτομερής ανάλυση της ανοδικής περιοχής του γονιδίου COUP-TF με σκοπό να καθοριστούν τα ιστοειδικά και χρονοειδικά στοιχεία που επηρεάζουν τη ρύθμιση. Προς το σκοπό αυτό αναγνωρίστηκε το σημείο έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου. Kατόπιν, απομονώθηκε ανοδική περιοχή μεγέθους 2kb περίπου, από το +14 έως το -1930. Tο τμήμα αυτό κλωνοποιήθηκε σε φορέα που φέρει το γονίδιο αναφοράς GFP, καθώς και το βασικό υποκινητή του γονιδίου Endo16. Από το αρχικό αυτό κατασκεύασμα, δημιουργήθηκαν διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα της περιοχής αυτής με τη μέθοδο της PCR. Eπιπλέον απομονώθηκαν επιμέρους μικρά ανοδικά τμήματα που δεν περιείχαν το βασικό υποκινητή του COUP-TF και κλωνοποιήθηκαν και αυτά στον ίδιο φορέα. Όλα τα κατασκευάσματα ενέθηκαν σε γονιμοποιημένα αυγά αχινού και μελετήθηκε το πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης GFP στα στάδια του γαστριδίου και του πλουτέα. Tα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι πρώτες 1079 βάσεις ανοδικά του +1 φέρουν τα απαραίτητα ρυθμιστικά στοιχεία για την έκφραση του COUP-TF στο στοματικό εξώδερμα και στο μεσέγχυμα. Eπιπλέον, η περιοχή από -232 έως -532 περιέχει έναν ενισχυτή της έκφρασης του COUP-TF στο στοματικό εξώδερμα ενώ το τμήμα από -1398 έως - 1639 έναν ενισχυτή της έκφρασης στο μεσέγχυμα. Ανοδικά του -1639 έως το -1930 περιέχεται ένας ισχυρός καταστολέας για την έκφραση του COUP-TF στο στοματικό εξώδερμα. Tα αποτελέσματα των ενέσεων με τα μικρά ανοδικά τμήματα επιβεβαιώνουν τα αποτελέσματα με τα διαδοχικά ανοδικά ελλείμματα και αναδεικνύουν ότι τα ρυθμιστικά στοιχεία που είναι απαραίτητα για την έκφραση του γονιδίου στο στοματικό εξώδερμα βρίσκονται στο τμήμα μεταξύ -232 και -1079. Η μελέτη ολόκληρης της ανοδικής περιοχής (έως -1930) δεν αναγνώρισε κάποιο τμήμα το οποίο να καταστέλλει την εκτοπική έκφραση του γονιδίου αναφοράς στα 7 μεσεγχυματικά κύτταρα. Η πραγματοποίηση κατασκευασμάτων που περιείχαν εκτός της ανοδικής περιοχής και την 5΄μη μεταφραζόμενη περιοχή οδήγησαν σε καταστολή της έκφρασης της GFP σε όλες τις κυτταρικές γραμμές. Η ανεύρεση στην 5’ μη μεταφραζόμενη περιοχή ενός στοιχείου απόκρισης για τον COUP-TF μας οδηγεί στην υπόθεση της πιθανής αυτορρύθμισης και συγκεκριμένα της αυτοκαταστολής του COUP-TF. / -

Σκοπός της συγκεκριμένης ερευνητικής εργασίας ήταν η αποκάλυψη του ρόλου και της θέσης του PlCOUP-TF στο ρυθμιστικό γονιδιακό δίκτυο της νευρογένεσης του αχινού Paracentrotus lividus, αλλά και η διερεύνηση των επιδράσεων του συγκεκριμένου μεταγραφικού παράγοντα στα υπόλοιπα γονίδια που εμπλέκονται στην δημιουργία νευρώνων. Ο PlCOUP-TF είναι ένας μητρικός μεταγραφικός παράγοντας και ορφανός πυρηνικός υποδοχέας που φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην δημιουργία νευρώνων σε μια ποικιλία οργανισμών. Τα υπό μελέτη γονίδια της νευρογένεσης είναι επίσης μεταγραφικοι παράγοντες με εξελικτικά συντηρημένες επικράτειες. Για τον προαναφερθέντα σκοπό, πραγματοποίηθηκαν πειράματα διπλής φθορίζουσας in situ υβριδοποίησης ώστε να αποκαλυφθούν οι περιοχές συνεντοπίσμου του PlCOUP-TF και των γονιδίων της νευρογένεσης σε ώριμα στάδια της ανάπτυξης. Επίσης, διεξήχθησαν πειράματα καταστολής της μητρικής έκφρασης του PlCOUP-TF με ενέσεις με ΜΑSO σε γονιμοποιημένα ωάρια και έλεγχος της έκφρασης των νευροειδικών γονιδίων στα ενεμένα και στα αντίστοιχα control έμβρυα. Ο έλεγχος της έκφρασης ήταν τόσο ποιοτικός (in situ χρωμογόνος υβριδοποίηση) όσο και ποσοτικός (Q-PCR). Με τα πειράματα αυτά, αποκαλύφθηκε ότι πιθανότατα ο συγκεκριμένος μεταγραφικός παράγοντας λειτουργεί ενεργοποιητικά για τα εν λόγω γονίδια. Συγκεκριμένα, φαίνεται η ύπαρξη κατασταλτικής δράσης του PlCOUP-TF πάνω σε καταστολέα των γονιδίων της νευρογένεσης (double negative gate) στην περιοχή του εμπρόσθιου νευροεξωδέρματος και σε συγκεκριμένες περιοχές της βλεφαριδωτής ζώνης. / Our aim was to identify the role of the orphan nuclear receptor PlCoup-TF in sea urchin embryonic neurogenesis and especially in the determination of the anterior neuroectoderm (ANE). To this end, we cloned a set of embryonic cDNAs encoding regulatory proteins expressed specifically in the ANE and we prepared antisense RNA probes for double fluorescence in situ hybridization for the following genes: PlCoup-TF, PlHbn, Plz81 and PlFoxG. We studied the spatial pattern of expression of ANE genes in conjunction with the expression pattern of PlCoup-TF in all embryonic stages of the sea urchin Paracentrotus lividus. A neurogenic territory specified within the animal pole of the embryo, is formed as a result of the interplay of the aforementioned regulatory factors that together constitute a sub-circuit within the embryonic gene regulatory network (GRN). We wanted to determine PlCoup-TF’s place within the GRN and specifically the ANE sub-circuit. Therefore, we knockdowned PlCoup-TF expression during embryogenesis by injecting specific morpholino antisense oligonucleotides (MASO) into sea urchin eggs and determine the expression pattern of the ANE specific genes by chromogenic in situ hybridization to resulting morphant embryos. The efficiency of the knockdown was measured by QPCR, where the amount of PlCoup-TF transcripts of morphants is compared to that of control embryos. Finally, we concluded that probably PlCoup-TF activate the ANE genes, by repressing repressor(s) of these genes (double negative gate) in ANE and in specific regions of CBE.