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Protein engineering could be used to bring two proteins together, which don't normally interact, in an oriented configuration. Using computer modelling and experimental work involving mutagenesis, a new dimer complex, (α7)2, was engineered with two α-hemolysin (αHL) heptamers (α7) units linked via disulfide bridges in a cap-to-cap orientation. The structure of (α7)2 was confirmed by biochemical analysis, transmission electron microscopy (TEM) and single-channel electrical recording. Importantly, it was shown that the one of two transmembrane  barrels of (α7)2 can insert into an attoliter liposome, while the other spans a planar lipid bilayer. (α7)2 pores spanning two bilayers were also observed by TEM. In potential, (α7)2 could be used for small molecule transfer between micron-sized vesicles (minimal cells) and would have applications in forming proto-tissues from minimal cells. Another target has been to couple a highly processive exonuclease, λ-exonuclease (λ-exo), which functions as a trimer, with the α7 pore for DNA sequencing and single molecule studies of λ-exo. Several genetic fusion constructs of λ-exo and αHL were screened and optimized for activity. By linking the N-terminus of λ-exo monomer to the C-terminus of the αHL monomer (α1), a new kind of processive exonuclease (AE) was synthesized that can form pores in bilayers. AE and wild-type α1 could be integrated into hetero-heptamers with different number of AE subunits. To achieve a hetero-heptamer with only one λ-exo trimer molecule mounted on the αHL cap, a concatemer of 2 λ-exo (exo3) was made by genetically linking the monomers of λ-exo with 15 and 17 amino acid linkers. The immediate next step is to link exo3 to α1 and then to co-assemble the exo3-α1 fusion construct with α1 to make the λ-exo-αHL pore complex. Using similar strategies as described in this thesis, other proteins could be linked to αHL increasing the scope of the nanopore technology.

De nos jours, l’entraînement en musculation occupe une part importante dans la programmation d’entraînement des sportifs car il permet d’optimiser deux paramètres essentiels à la performance, la force et la puissance. Les stratégies nutritionnelles qui accompagnent les séances de musculation sont susceptibles d’influencer les réponses à l’entraînement. Parmi ces stratégies, celle qui a surtout retenu l’attention du monde scientifique concerne les caractéristiques des apports protéiques, et notamment les aspects de quantité, de qualité et du moment d’apport optimaux. Alors que la grande majorité des travaux ont été conduit dans le cadre d’un exercice unique, ce travail de thèse se propose d’évaluer l’intérêt d’un apport protéique en récupération d’exercices programmés dans le cadre d’un entraînement en musculation de plusieurs semaines. Il s’agit de 1) préciser l’impact du rapport entre les protéines lentes (caséines) et les protéines rapides (lactosérum) du lait - présentes dans une boisson protéique de récupération - sur les adaptations musculaires à un entraînement en musculation (masse musculaire et force) et, 2) de vérifier l’intérêt et le moment optimal d’un apport en protéines lentes, à distance de l’entraînement en musculation, sur les réponses musculaires à l’entraînement. Les résultats de la première étude montrent une augmentation significative de la concentration plasmatique en leucine lorsque la proportion de protéines rapides est supérieure ou égale à la proportion de protéines lentes, par rapport à la situation inverse (plus de caséine que de lactosérum). Mais, ceci ne se traduit pas par des gains hypertrophiques supérieurs. La seconde étude, 1) confirme l’intérêt de l’ingestion de protéines rapides après chaque séance pour améliorer le gain de masse musculaire en réponse à l’entraînement en musculation, et 2) suggère l’intérêt d’un apport de caséine 3h après la fin de chaque séance d’entraînement pour maximiser les gains de force pendant l’entraînement en musculation. Ces résultats permettent de préciser les recommandations d’apport en protéines en phase de récupération de séances de musculation, tant au plan de la qualité des apports azotés (étude 1), de leur quantité (études 1 et 2), que du moment d’apport (étude 2). / Nowadays, resistance training plays an important part in the training programmes of sportsmen, because it can optimise two essential parameters of physical performance: strength and power. Nutritional strategies following exercise can maximise the muscle responses from resistance training. Quality, quantity and timing of protein intake have particularly engaged the attention of scientific studies. While the majority of relevant research has investigated the intake of protein after a single bout of resistance exercise, this particular research project aims to investigate the effect of post-exercice protein intake during several weeks of resistance training.The objectives of this project are 1) to identify the optimal ratio between slow proteins (casein) and fast proteins (whey) of milk, present in a recovery riched-protein drink, on the muscle adaptations from resistance training (muscle mass and strength) and, 2) to investigate the muscle responses to slow protein intake a few hours after resistance training exercise. Results from the first study show that there is no resulting gain in muscle mass when the ratio of fast protein is equal to or higher than that of slow protein, despite an resulting increase in plasma leucine. The second study 1) confirms that ingestion of fast protein after each resistance training session improves muscle mass and strength gains, and 2) suggests that intake of casein 3 hours after the end of each training session can maximise the gain of strength during resistance training. These results allow specific recommendations to be formulated for protein intake during the recovery period after resistance training, both in planning the quality (study 1), quantity (studies 1 and 2) and timing (study 2) of protein intake during resistance training programmes.

Résumé : Les régimes hyperprotéiques sont couramment consommés mais les conséquences au niveau du gros intestin sont peu connues. L’objectif de la thèse était d’étudier les effets des régimes hyperprotéiques et des métabolites bactériens dérivés des acides aminés sur la muqueuse du gros intestinUne série d’expérimentations animales et in vitro a permis de montrer que deux métabolites bactériens dérivés des acides aminés (le sulfure d’hydrogène et le p-cresol) sont toxiques pour l’épithélium lorsqu’ils sont présents en concentration élevée. Les résultats obtenus lors d’une étude clinique montrent que la quantité et la qualité des protéines alimentaires n’ont pas d’effets marqués sur la composition du microbiote fécal mais modifient les concentrations fécales et urinaires en métabolites bactériens.Ces modifications de l’environnement luminal du gros intestin n’étaient pas associées à une augmentation de la cytotoxicité des eaux fécales in vitro. Néanmoins, dans la muqueuse rectale, l’augmentation de l’apport en protéines a régulé l’expression de gènes impliqués dans le maintien de l’homéostasie et ces effets étaient distincts en fonction de la source de protéines utilisée. Toutefois, le niveau d’apport en protéines n’avait pas d’effet sur les paramètres inflammatoires et histologiques dans la muqueuse. Ces résultats ont été complétés par une étude chez le rat montrant qu’un régime hyperprotéique modifie le transcriptome dans les colonocytes mais n’a pas d’effets délétères en termes d’intégrité de l’ADN, de renouvellement de l’épithélium et de fonction barrière. / Abstract: High-protein diets are frequently consumed but the consequences for the large intestine are not well described. The objective of this thesis was to evaluate the effects of high-protein diets and of amino-acid derived bacterial metabolites on the large intestine mucosa. Animal and in vitro studies showed that two amino acid derived bacterial metabolites (hydrogen sulfide and p-cresol) are toxic for the epithelium when present at high concentration. The results obtained in a clinical trial indicate that quantity and quality of dietary protein do not have major effects on the fecal microbiota composition but modify the fecal and urinary concentration of bacterial metabolites.These changes in luminal environment were not associated with an increase in fecal water cytotoxicity in vitro. Nevertheless, in the rectal mucosa, the increase in protein intake regulated the expression of genes implicated in homeostatic processes and these effects were modulated by the source of protein. However, the level of protein intake had no effect on immune and histological parameters in the mucosa. These results were completed with a study in rats showing a clear transcriptome profile in colonocytes induced by a high-protein diet but that was not associated with detrimental effects in terms of DNA integrity, epithelial renewal and barrier function.