Introducción: La piel es el órgano más extenso del cuerpo humano. Las heridas cutáneas son producto de la ruptura de la integridad de la piel. Las células mesenquimales (MSCs) están emergiendo como fuertes candidatas para ser usadas como terapia celular en el tratamiento de heridas crónicas, dado su enorme potencial para mejorar la reparación y regeneración de los tejidos posterior a una lesión. Constructos biosintéticos fabricado con la fibroína de la seda celularizados con MSCs de diferentes fuentes han demostrado ser eficaces en la curación de heridas experimentales de la piel. Objetivos: investigar el comportamiento de las células mesenquimales de la gelatina de Wharton del cordón umbilical humano (hWj-MSCs) tanto in vitro como in vivo tras ser sembradas en un constructo electrohilado compuesto de fibroína de la seda y posteriormente implantado en ratones inmunocompetentes. Determinar si las hWj-MSCs aplicadas mediante constructos de fibroína de seda en heridas creadas en el dorso de ratones SKH1 contribuyen a mejorar la cicatrización de la lesión. Metodología: inicialmente hemos puesto a punto el protocolo para el aislamiento y caracterización de las hWj-MSCs. Posteriormente, estas MSCs en combinación con un constructo fabricado a partir de la fibroína de la seda fueron utilizados para probar sus propiedades terapéuticas en un modelo murino experimental de heridas. Resultados: Las hWj-MSCs mostraron una morfología fibroblástica, y presentaron en su superficie la expresión de marcadores mesenquimales que fueron positivos para CD90, CD105, CD73, y sin presencia detectable de marcadores de células hematopoyéticas. Las hWj-MSCs mostraron una capacidad limitada para diferenciarse hacia adipocitos, condrocitos, y osteoblastos. Las hWj-MSCs inhibieron de forma significativa la proliferación de linfocitos T tras ser estimulados con esferas anti-CD3/CD28, así como con células dendríticas maduras alogénicas. Las hWj-MSCs disminuyeron la producción in vitro de la citoquina pro-inflamatoria IFN- por los linfocitos T activados. Este efecto inmunosupresor también estuvo mediado por la producción de los factores anti-inflamatorios TGF-, IDO, y PGE2. Los experimentos con cultivos mixtos de linfocitos en presencia de diferentes inhibidores específicos de la biosíntesis o la señalización de estos factores anti-inflamatorios tales como SB-431542, indometacina (IDM), o 1-metil-triptófano (1-MT) respectivamente, recuperaron casi en su totalidad el nivel de proliferación de las células T estimuladas con células dendríticas maduras. El tratamiento de las heridas de la piel en ratones SKH1 demostró que la combinación de hWj-MSCs y el constructo de fibroína de la seda mejoró significativamente la capacidad de cicatrización de heridas. Conclusiones: Las hWj-MSCs son poco inmunogénicas, no expresan moléculas coestimuladoras, y expresan citoquinas que pueden modular la función inmune. La combinación de hWj-MSCs con los constructos de fibroína de seda contribuyó a la generación de un tejido de granulación de alta calidad, y escasa formación de tejido cicatrizal. La gelatina de Wharton del cordón umbilical humano puede ser una fuente adecuada para la obtención de MSCs para ser utilizadas en la cicatrización de heridas debido a sus diversas ventajas y junto con los beneficios sinérgicos de un constructo pudieran conformar una combinación ideal como apósitos para heridas crónicas de lenta y difícil curación. / Introduction: the skin is the largest organ in the human body. Cutaneous wounds are the result of disrupted skin integrity. Mesenchymal stem cells (MSCs) are emerging as a promising candidate for cell-based therapy for the treatment of chronic wounds because of their enormous potential for enhancing tissue repair and regeneration following injury. Silk fibroin cellularized with MSCs from different sources has been shown to be effective in repairing experimental wounds of the skin. Objectives: to investigate the behavior of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells (Wj-MSCs) both in vitro and in vivo when cultivated on electrospun silk fibroin scaffolds and implanted in immunocompetent mice. To determine whether Wj-MSCs delivered in silk fibroin scaffolds into skin defects in SKH1 mice would contribute to dermal wound healing. Methodology: we have first standardized the protocol for the isolation and characterization of Wj-MSCs. Further, these MSCs along with the combination of silk fibroin scaffolds were used to test their wound healing properties by creating skin wounds in an experimental murine model. Results: Wj-MSCs exhibited a fibroblastic morphology and displayed MSC surface markers positive for CD90, CD105, CD73 with no detectable presence of hematopoietic cells markers. Wj-MSCs were limited on their ability to differentiate into adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts. Wj-MSCs suppressed T cell proliferation after stimulation with anti-CD3/CD28 coated beads and allogeneic mDCs. Wj-MSCs downmodulated the in vitro production of the pro-inflammatory cytokine IFN- by activated T lymphocytes. This immunosuppressive effect was also mediated by the production of the anti-inflammatory cytokines TGF-, IDO, and PGE2. MLCs experiments in the presence of different specific inhibitors of the biosynthesis or signaling of these anti-inflammatory factors such as SB-431542, indomethacin (IDM) or 1-methyl-tryptophan (1-MT), respectively, recovered almost entirely the proliferation rate of mDCs-stimulated T cells. Treatment of skin injury of SKH1 mice model demonstrated that combination of Wj-MSCs and silk fibroin scaffold exhibited significantly better wound-healing capabilities. Conclusions: Wj-MSCs have reduced immunogenicity, did not express costimulatory molecules, and express cytokines that may modulate immune function. Wharton's jelly MSCs combined with silk fibroin scaffolds in the wound bed contributed to the generation of a high-quality, well-vascularized granulation tissue, enhanced re-epithelialization of the wound, and attenuated the formation of fibrotic scar tissue. Wharton's jelly from the human umbilical cord may be an adequate source for obtaining MSCs for wound healing given its several advantages and together with the synergistic benefits of a nanoscaffold they make ideal combinations as wound dressings for slow healing and hard-to-heal chronic wounds.

El melanoma cutáneo es una neoplasia maligna de los melanocitos que se caracteriza por un curso clínico a menudo indeseable. Aunque actualmente la detección precoz y la cirugía ofrecen una alta tasa de curación, este tumor puede eludir la vigilancia inmunológica del huésped favoreciendo su evolución. Esto puede deberse ciertas interacciones entre los antígenos leucocitarios humanos (HLA) y células T citolíticas específicas de antígeno (CTL) o las células asesinas naturales (NK), las cuales son importantes por su acción anti-tumoral frente al melanoma. En contraste con otras células tumorales, las células de melanoma se consideran altamente inmunogénicas debido a que expresan antígenos que pueden desempeñar un papel decisivo en el reconocimiento de células tumorales y el rechazo por el sistema inmunológico del huésped. OBJETIVOS: Hasta la fecha no han sido completamente dilucidados los mecanismos inmunológicos implicados en el melanoma cutáneo. Se han hecho esfuerzos para encontrar marcadores de susceptibilidad o pronóstico y posibles dianas para las terapias inmunológicas, pero no han dado frutos aún. Por lo tanto, los objetivos de este estudio han sido investigar si: 1. La susceptibilidad o evolución del melanoma están influenciadas o no por los loci HLA A, HLA B, HLA C, HLA E, HLA-DRB1 o HLA-DQB1. 2. Si los cambios tempranos de las células T CD8+ y CD56+ NK que expresan receptores NK participan en la susceptibilidad o curso del melanoma en diferentes grupos de pacientes definidos por su dimorfismo HLA-C (Lys80/Asn80). DISEÑO EXPERIMENTAL: 1. El tipaje de HLA-A y HLA-B con el método de microlinfocitotoxicidad estándar. El tipaje HLA C para analizar el dimorfismo en la posición 80 de la hélice α1 (Asn80/Lys80) capaz de mediar con las células que expresan KIR, se realizó PCR-SSO. 2. El tipaje HLA-DRB1 y HLA-DQB1 y las confirmaciones de HLA de clase I se realizó mediante PCR-SSP. 3. Las células T CD8+ y CD56+ NK de pacientes y controles con diferentes genotipos HLA-C (Asn80/Lys80) se analizaron por citometría de flujo. RESULTADOS: 1. En este estudio, no se ha encontrado una asociación negativa o positiva de los alelos HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1, HLA-DQB1 y HLA E con la susceptibilidad o evolución del melanoma melanoma. 2. Este estudio demuestra, por primera vez, que la presencia del epítopo Asn80 podría contribuir a la protección de la enfermedad, en particular el alelo HLA C*07. 3. Este estudio muestra, también por primera vez, que la presencia de HLA-C portadores de Lys80 en homocigosis puede ser considerado como un factor predisponente para el desarrollo de metástasis linfáticas tempranas. 4. Según nuestro conocimiento, describimos por primera vez, una evidencia “in vivo” de la existencia de un estado de activación en pacientes con melanoma en etapas no metastásicas de la enfermedad, determinada por un aumento del número absoluto de linfocitos T de sangre periférica con fenotipo CD8+CD28+DR+ o CD8+CD28-CD161+, que podría estar asociada con una estimulación de la respuesta inmune en las primeras etapas de melanoma cutáneo. 5. Se detecta, por primera vez también, una expansión selectiva de una subpoblación de células T que expresan receptores KIR2DL1/S1 (CD8+CD28CD158a+) junto con un aumento de las células CD56+ NK KIR2DL1/S1 en pacientes de melanoma, mucho más pronunciado en los pacientes portadores del ligando HLA-CLys80 en homocigosis, lo que indica un particular papel regulador inmunológico de las células que expresan receptores KIR2DL1/S1 en el melanoma. 6. Por lo tanto, es tentador especular sobre la posibilidad de la apertura de nuevas vías terapéuticas para el control de la progresión del melanoma, tomando en consideración a estas células como posibles dianas para la intervención inmunológica mediante el bloqueo o la estimulación de sus receptores inhibidores/activadores. / Cutaneous melanoma is a malignant neoplasm of melanocytes characterized by an often undesirable clinical outcome. Although current early detection and surgery offer a high cure rate, this tumor can be elusive for the host immune surveillance, especially if a state of tolerance against tumor is induced. The clinical outcome may be influenced by complex interactions that take place between the different human leukocyte antigens (HLA) and antigen-specific cytolytic T cells (CTL) or natural killer (NK) cells, which are believed to be important in eliciting an effective immune protection against melanoma. Nonetheless, in contrast to other tumor cells, melanoma cells are usually considered highly immunogenic because of the expression of antigens that may play a decisive role in tumor cell recognition and rejection by the host immune system. PURPOSE: To date, immune mechanisms involved in cutaneous melanoma have not been fully elucidated. Efforts have been made to find susceptibility or prognosis markers and potential targets for immune therapies, but they have not been entirely fruitful so far. Therefore, the goals of this study were to investigate: 1. If the susceptibility or outcome of the melanoma is influenced by HLA A, HLA B, HLA C, HLA E, HLA-DRB1 or HLA-DQB1 loci. 2. The influence of early changes in CD8 T and CD56 NK cells expressing NK receptors in different HLA-C dimorphism (Lys80/Asn80) groups in the susceptibility or outcome of the melanoma. EXPERIMENTAL DESIGN: All experiments were made in patients and sex- and age-matched controls. 1. HLA-A and HLA-B typing were performed by the standard microlymphocytotoxicity test. 2. Typing of HLA C dimorphism (Lys/Asn) at position 80 in the α1 helix to examine whether it could mediate in the emergence of cells expressing killer-cell immunoglobulin-like receptors was tested by PCR-SSO. 3. HLA class II typing HLA-DRB1 and HLA-DQB1 typing and resolution of HLA class I ambiguities were performed by PCR-SSP 4. CD8 T and CD56 NK cells were analyzed in patients and sex- and age-matched controls with different HLA-C genotypes (Asn80/Lys80) by flow cytometry. RESULTS: 1. In this study, none of the HLA class I antigens (HLA-A and HLA-B), HLA class II alleles (HLA-DRB1 and HLA-DQB1) and HLA E showed positive or negative association with the overall population of melanoma patients. 2. This study shows, for the first time, that the presence of the Asn80 epitope could contribute to the protection against the disease, particularly the HLA-Cw*07 allele. 3. This study shows, also for the first time, that the presence of Lys80 epitope of the HLA-C molecules in homozygosis may be considered as a predictive factor for the development of early LN metastasis. 4. To our knowledge, we have described for the first time an in vivo evidence of the existence of a status of activation in melanoma patients at the nonmetastatic stages of the disease, determined by an increase of the absolute number of T lymphocytes from peripheral blood with phenotype CD8+CD28+DR+ or CD8+CD28-CD161+, which could be associated with a stimulation of the immune response at the early stages of cutaneous melanoma. 5. We have detected, for the first time too, a selective expansion of T cells subpopulation expressing KIR2DL1/S1 (CD8+CD28-CD158a+) together with an increase of CD56+ NK KIR2DL1/S1 cells in patients of melanoma, much more pronounced in patients carrying the corresponding HLA-CLys80 ligand in homozygosis, which point to a particular immune regulatory role of cells expressing KIR2DL1/S1 in melanoma. 6. Thus, it is tempting to speculate about the possibility of opening new therapeutic ways for the control of melanoma progression, taking into consideration these cells as a target for immune intervention by blocking or enhancing their inhibitory/activatory receptors.

La exposición a la radiación solar provoca daños sobre la piel, que incluyen: eritema, quemaduras, inmunosupresión, etc.; y a largo plazo fotoenvejecimiento (término acuñado por Kligman en 1982) y cáncer de piel. De ahí que estas patologías sean en gran parte prevenibles al evitar la exposición excesiva al sol y con la utilización de fotoprotectores. Los objetivos de nuestro estudio, correspondieron al desarrollo de un modelo de fotoenvejecimiento en ratones SKH1, que fuera reproducible y fiable, para posteriormente estudiar los posibles efectos fotoprotectores de algunos compuestos polifenólicos. Para su realización utilizamos 40 ratonas SKH1/CRL, que fueron expuestas a radiación ultravioleta (98.6 % RUV-A y 1.4 RUV-B), 60 minutos por sesión, tres veces a la semana, durante 80 sesiones, con un total de 1.688 J/cm2 de energía recibida por animal. Las ratonas se dividieron en cuatro grupos (n = 10). El primero (Control) sólo recibió RUV y a los tres restantes, además de RUV, se añadió a la dieta, ácido Carnósico (Grupo II), Apigenina (Grupo III) y ácido Rosmarínico (Grupo IV), a la dosis de 1 mg /animal/día. En nuestro estudio todos los animales expuestos a las RUV presentaron las alteraciones características del fotoenvejecimiento y fotocarcinogénesis cutánea (entre 65 y 80 sesiones), por lo que lo consideramos que el modelo experimental desarrollado es idóneo para el estudio de esta patología. No obstante hemos encontrado diferencias entre los animales de los distintos grupos experimentales en cuanto al tiempo de presentación de las lesiones, su extensión, e intensidad, fundamentalmente en las 4 variables estudiadas, (DT 50: semana en la que al menos la mitad de los animales del grupo mostraban lesión), área total lesionada, tamaño medio de las lesiones, e incidencia microscópica de lesiones neoplásicas malignas). 4 Clínicamente en los animales pertenecientes al Grupo IV (ácido Rosmarínico), destacaba que la piel del dorso presentaba menor número de arrugas y un aspecto general más saludable que los de los otros grupos hasta la sesión 50. En cuanto a la semana en la que al menos la mitad de los animales del Grupo presentaban lesión (DT 50), solo observamos retraso en los animales del Grupo II (Ácido Carnósico) que presentaban una DT50 = 70, mientras que en los de los Grupos I (Control) y Grupo IV (ácido Rosmarínico) era idéntica: 60 (DT50=60), y en el Grupo III tratado con Apigenina era de 52. En la media del área total lesionada observamos una reducción que era mayor en los Grupos II (Ácido Carnósico) con 71.58 seguido del Grupo III (Apigenina) con 104.72 y del Grupo IV (Ácido Rosmarínico) con 132.10, respecto al Grupo I(Control): 190.43. De modo similar, también observamos esa reducción respecto al tamaño medio de las lesiones, que era: Grupo II: 10.91, Grupo III:36.31, Grupo IV: 44.59 y Grupo I: 62.65. En cuanto a la incidencia microscópica de las lesiones neoplásicas malignas, en los Grupos II (Ácido Carnósico) y IV (Ácido Rosmarínico) se presentaron en 6 animales, mientras que en el III (Apigenina) ocurrían casi en todos los animales (9) y en todos los del Grupo I (Control). De estos resultados parece deducirse que tanto el ácido Carnósico como el Rosmarínico poseen propiedades fotoprotectoras y anticarcinogénicas, probablemente debidas a su actividad antioxidante. / Exposure to solar radiation provokes damage to the skin, including erithema, burns and immunosuppression, and, in the long term photoaging (a term coined by Kligman in 1982) and skin cancer. Many of these pathologies are preventable by avoiding prolonged exposure to the sun or by using photoprotectors. The aim of our work was to develop a photoaging model in SKH1 mice that was reproducible and reliable and subsequently to study the possible photoprotective effects of several polyphenolic compounds. For this, forty SKH1/CRL mice were exposed to 80 sessions of UVR (98.6% UVA and 1.4% UVB) for 60 minutes/session, 3 times per week (total of 1,688 J/cm2 per animal). The mice were divided into four groups (N= 10): the control group, which only received UVR, and three others which were exposed to UVR but were also given a dietary supplementation of Carnosic Acid (Group II), Potassium Apigenin (Group III) and Rosmarinic Acid (Group IV) at a rate of 1 mg /animal/day. The control group animals exposed to UVR showed the alterations characteristic of photoaging and cutaneous photocarcinogenesis after 65-80 sessions, so that the experimental model can be considered ideal for studying such pathologies. However, there were differences between the animals receiving the supplements as regards the time at which the lesions appeared, their extension and intensity, basically for 4 variables studied, (DT 50: week in which at least half the animals of the group showed lesions), total area affected, mean size of variables and microscopic incidence of malign neoplastic lesions. Clinically, the animals of Group IV (Rosmarinic acid) showed fewer wrinkles and a healthier appearance than the other groups up to session 50. As regards the DT50 variable, only the animals of Group II (Carnosic acid) showed a DT50 = 70, while the other groups showed the following scores: Groups I (Control) and Grupo IV (Rosmarinic acid) 60 (DT50=60), and Group III (treated with Apigenina) 52. As regards the total damaged area, the reduction compared with the control was greater in group II (Carnosic acid) with 71.58 followed by Group III (Apigenin) 2 with 104.72 and Group IV (Rosmarinic acid) with 132.10, compared withGroup I (Control): 190.43. Similarly, there was a reduction in the mean size of the lesions: Group II, 10.91; Group III, 36.31; Group IV, 44.59 and Group I, 62.65. As regards the microscopic incidence of malign neoplastic lesions, 6 animals presented the same in Groups II (Carnosic acid) and IV (Rosmarinic acid), 9 in Group III (Apigenin) and all in Group I (Control). From the results it can be deduced that both carnosic acid and rosmarinic acid possess photoprotective and anti-photocarcinogenic properties, probably as a result of their antioxidant activity.

El fotoenvejecimiento es un tema de enorme interés socio-sanitario (Kawada, 2011) al ser un proceso patológico común Su manejo clínico y terapéutico implica un alto presupuesto sanitario (Yaar, 2007; Jemal, 2011; Siegel, 2012). Los países desarrollados invierten sumas millonarias en la investigación de sustancias que eviten o retrasen sus efectos (Gil Ortega,2014). De ahí el interés del desarrollo de modelos experimentales para su estudio, así como el de nuevas medidas de fotoprotección. El primer objetivo de nuestro trabajo correspondió al establecimiento de un modelo de fotoenvejecimiento cutáneo en ratones SKH-1 mediante exposición crónica a RUV; el segundo fue evaluar los posibles efectos protectores de la Astaxantina. Utilizamos 60 ratones SKH1/CRL, expuestos a RUV (98,6% UVA y 1,4% UVB) / 60 minutos / sesión / 3 veces a la semana / 80 sesiones, con un total de 1.688 J/cm2 por animal. Los ratones se dividieron en dos grupos (N= 30): El Control sólo recibió RUV y el segundo, RUV más Astaxantina / oral / 0,05 mg / animal / dia. Dado que en la mayoría de los animales de este grupo no se originaron lesiones neoplásicas al final del experimento (80 sesiones), seguimos aplicando hasta un total de 113 sesiones (2.384,3 J/cm2) a 10 ratones,. Los animales expuestos exclusivamente a RUV Grupo Control presentaron las alteraciones características descritas en el fotoenvejecimiento (100% de carcinomas escamosos), por lo que lo consideramos un modelo experimental idóneo para el estudio de estas patologías. No obstante, encontramos diferencias entre las lesiones de los animales tratados con Astaxantina, respecto a las del Control: el eritema se hacía fijo con aspecto reticulado, 15-16 sesiones mas tarde que en el Control; la presentación del marcado patrón geométrico de la piel (8-10 sesiones); arrugas (15-16 sesiones); engrosamiento cutáneo-lesiones queratósicas (10-12 sesiones) y de las lesiones eritemato-erosivas (5-6 sesiones). Las diferencias más destacables fueron en las lesiones tumorales, ya que solo las presentaron 10 animales del grupo tratado. De los 20 que recibieron 80 sesiones, solo 2 presentaron tumores; y de los 10 que recibieron 113 sesiones, se presentaron solo en 6 a partir de la sesión 100 y en 2 tras la 113. Todas las neoplasias correspondían a carcinomas de células escamosas. Microscópicamente, también encontramos diferencias en las lesiones precancerosas: la displasia en: el 60% de los animales tras la sesión 80 y en el 80% tras la 113; el carcinoma “in situ” en el 25% y el 75% respectivamente, mientras que en los animales del grupo Control se observaban ambos en el 100% de los animales. En el estudio inmunohistoquímico, constatamos un incremento significativo de la tasa de proliferación celular en los tumores del grupo control respecto a los tratados. La expresión de MMP-9 resultó más alta en los tumores de los animales tratados que en los del control. Sin embargo, el inhibidor de metaloproteinasas TIMP-1, se expresó de forma más intensa en el estroma de los tumores de los animales tratados que en los controles, sugiriendo que el tratamiento con astaxantina podría inhibir la progresión tumoral, mediante la inducción de la síntesis de inhibidores de metaloproteinasas en el estroma tumoral. / Photoaging, a common pathological process, is of enormous socio-sanitary interest (Kawada, 2011) and its clinical and therapeutic treatment is expensive (Yaar, 2007; Jemal, 2011; Siegel, 2012). Developed countries invest enormous sums of money in research into substances to prevent or delay the effects of the process (Gil Ortega, 2014) – hence the interest in developing experimental models for its study and new protection methods. The first objective of our study was to establish a model of cutaneous photoaging in SKH-1 mice chronically exposed to UVR, and the second to evaluate the possible protective effects of Astaxanthin. Sixty SKH1/CRL mice were exposed to 80 sessions of UVR (98.6% UVA and 1.4% UVB) for 60 minutos/session, 3 times per week (total of 1,688 J/cm2 per animal). The mice were divided into two groups (N= 30): the control group, which only received UVR, and a second group, which received UVR and Astaxanthin adminsitered orally at 0.05 mg / animal / day. Since most of the animals of the second group showed no neoplastic lesions at the end of the 80 sessions, the treatment was continued in 10 mice to reach 113 sessions (2,384,3 J/cm2). The control group animals showed the alterations characteristic of photoaging (100% squamous carcinomas), so that the experimental model can be considered ideal for studying such pathologies. However, there were differences in the lesions treated with Astaxanthin compared with the control group: erythema became permanent and showed a reticulated pattern 15-16 sessions later than in the control group; a marked geometric pattern of the skin (8-10 sessions later); swelling and/of queratósicas cutáneo-lesiones (10-12 sessions later); wrinkling (15-16 sessions) and eritemato-erosivas lesions (5-6 sessions later). The most pronounced differences concerned the tumoral lesions, which only appeared in 10 animals of the treated group. Of the 20 animals that received 80 sessions, only 2 showed tumours, while, of the 10 animals that received 113 sessions, tumour growth was evident in 6 after 100 sessions and another 2 after 113 sessions. All the neoplasias corresponded to squamous cell carcinomas. Microscopically, there were also differences in the precancerous lesions observed: dysplasia in 60% of animals after 80 sessions and in 80% after 113 sessions. “In situ” carcinomas were observed in 25 and 75%, respectively of the treated animals. In the control group, on the other hand, both were observed in 100% of the animals. An immunohistochemical study pointed to a significantly higher cell proliferation rate in the tumours of the control group, while MMP-9 expression was higher in the tumours of the treated group. Metaloproteinase TIMP-1 inhibitor expression was greater in the stroma of the tumours of the treated animals, suggesting that treatment with astaxanthin may inhibit tumour progression by inducing the synthesis of inhibitors of metaloproteinases in the tumoral stroma.

La piel es el órgano más extenso del organismo y puede sufrir, además del envejecimiento cronológico, el denominado fotoenvejecimiento o envejecimiento cutáneo patológico. Está caracterizado por un envejecimiento cutáneo más extenso y sobre todo, de mayor gravedad, pues engloba la fotocarcinogénesis o presentación de cánceres cutáneos. Desde la Antigüedad, el hombre tuvo conciencia de la importancia del Sol en su vida, pero también de sus efectos indeseables. En la actualidad las sociedades de los países desarrollados invierten sumas millonarias en la investigación de sustancias que eviten o retrasen los efectos del envejecimiento, no sólo por el culto a la belleza, sino por el gran coste económico que tiene la asistencia sanitaria de las lesiones. En los últimos años, los aceites esenciales han recibido gran atención dada su capacidad antioxidante, que podría interferir en los mecanismos de fotoenvejecimiento, evitando la formación de radicales libres y potenciando el subsistema inmunológico cutáneo. Por otro lado, a las dificultades metodológicas que supone la lenta evolución de los tumores, se suman las limitaciones éticas del desarrollo de modelos experimentales en humanos. Por esta razón, el primero de los objetivos de nuestro trabajo fue el establecimiento de un modelo de fotoenvejecimiento cutáneo en ratones SKH-1, mediante la exposición crónica a Radiación Ultravioleta (RUV), para en el segundo objetivo de nuestro estudio, evaluar las propiedades de dos aceites, el de almendras dulces y el de la crisálida del gusano de la seda, como posibles fotoprotectores. Para la realización del estudio, utilizamos 60 ratones SKH1/CRL, que se sometieron a radiación ultravioleta, 60 minutos por sesión, tres veces por semana, durante un total de 80 sesiones, con 1.688 J/cm2 de energía total absorbida por cada animal. Los ratones se dividieron en tres grupos. El primero (Control) sólo recibió RUV y los otros dos fueron tratados tópicamente, previamente a la irradiación, con aceite de almendras dulces (Grupo II) y con aceite de la crisálida del gusano de seda (Grupo III). Todos los animales expuestos a las RUV presentaron las alteraciones características del fotoenvejecimiento y fotocarcinogénesis cutánea, por lo que consideramos este modelo experimental idóneo para el estudio de esta patología, ya que la exposición crónica a las radiaciones provocó todo el espectro de lesiones propias del fotoenvejecimiento, si la exposición era prolongada (entre 65 y 80 sesiones), además de tratarse de un modelo fácilmente reproducible y de bajo coste. No obstante, en nuestro estudio observamos diferencias significativas entre los animales tratados con el aceite de la crisálida del gusano de seda (Grupo III) respecto a los de los otros dos grupos. En los ratones del grupo III se observa un retraso en la presentación de las lesiones cutáneas (6-9 semanas), con respecto a los otros grupos y hubo dos animales sin lesiones tumorales al final del experimento. Además, el área media de las lesiones era menor en el grupo III un 59,14% respecto al grupo control (reducción del 40,86%); el grupo tratado con aceite de almendras dulces, tan sólo redujo el área media en un 10%. Esto sugiere las propiedades fotoprotectoras del aceite de crisálida del gusano de seda, probablemente debidas a la acción de la sericina que contiene, que es un potente antioxidante. Este retraso en la presentación de lesiones neoplásicas y su menor volumen fue confirmado por el estudio inmunohistoquímico, respecto a la metaloproteinasa 9 (MMPs-9) y los inhibidores TIMP. / The skin is the largest organ of the body and may, in addition to chronological aging, suffer some disease called photoaging. It is characterized by a large aging of the skin and above all, what is more dangerous, photocarcinogenesis or presentation of skin cancers . Since antiquity, men became aware of the importance of the sun in our life, but also of its undesirable effects. At present, a lot of companies of developed countries invest a large amount of money in researching, looking for substances that prevent or delay the effects of aging, not only for beauty, but also by the great economic cost of health care. In recent years, essential oils have received great attention due to its antioxidant capacity, which may interfere with the mechanisms of photoaging, preventing the formation of free radicals and boosting the skin 's immune subsystem. Furthermore, to the methodological difficulties of the slow evolution of tumors, ethical constraints on development of experimental models in humans are added . Therefore, the first objective of our work was to establish a model of cutaneous photoaging in SKH -1 mice by chronic exposure to Ultraviolet Radiation (UVR). The second objetive of our study was to evaluate the properties of two oils, sweet almond and chrysalis of silkworm, as possible photoprotective . For the study, we used 60 mice SKH1/CRL, that received ultraviolet radiation, 60 minutes per session, three times per week, for a total of 80 sessions , with 1,688 J/cm2 of total energy absorbed by each animal. The mice were divided into three groups. The first (control) received only UVR and the other two were treated topically prior to irradiation, with sweet almond oil (Group II ) and oil of silkworm chrysalis (Group III). All animals exposed to UVR showed the characteristic alterations of cutaneous photoaging and photocarcinogenesis, so consider this experimental model as ideal for the study of this disease, since chronic exposure to radiation caused the entire spectrum of lesions characteristic of photoaging, if the exposure was prolonged (65 to 80 sessions), besides being an easily reproducible and not expensive model . However, in our study we observed significant differences between animals treated with oil of chrysalis silkworm (Group III) compared to the other two groups. In Group III, mice observed a delay in the presentation of skin lesions (6-9 weeks), with respect to the other groups, and there were three animals without tumor lesions at the end of the experiment. In addition, the mean area of lesions was lower in group III (59.14 %) than in the control group (40.86 % reduction), the group treated with sweet almond oil only reduced the area by 10 %. This suggests the photoprotective properties of oil of silkworm chrysalis, probably due to the action containing sericin, which is a potent antioxidant. This delay in the presentation of neoplastic lesions and their smaller area was confirmed by immunohistochemical study, regarding metalloproteinase 9 ( MMP -9) and TIMP inhibitors.

Tesis por compendio de publicaciones / Melanoma is the most aggressive form of skin cancer and it is highly resistant to all current modalities of cancer therapy, including cytotoxic drugs as methotrexate (MTX), an antifolate widely used in clinical oncology against many cancer types. Recently, our lab discovered a new melanoma-specific mechanism of MTX resistance by which folate receptor α (FR-α)–mediated endocytotic transport of MTX facilitates melanosomal drug sequestration and cellular export in melanoma cells, thereby reducing the accumulation of MTX in intracellular compartments. That low MTX intracellular concentration is just able to induce cell growth arrest, but not cell death in melanoma cells. Particularly, we found that melanoma treatment with MTX induces cell cycle arrest without inducing apoptosis, activates melanin synthesis and melanosome biogenesis, and accelerates melanosomal export; but the cellular and molecular processes by which MTX mediates all these effects had not been elucidated. The Main Objective of the present PhD Thesis was the identification of the molecular basis of the cell cycle arrest, the activation of melanogenesis and the acceleration of melanosome transport induced by MTX treatment that, collectively, protect melanoma cells against MTX-induced apoptosis. The Secondary Objective, was the development of new therapeutic strategies combining MTX with drugs directed against molecular targets that are key components of the mechanisms of melanoma resistance to MTX. Regarding the Techniques and Instrumentation, we used several experimental models, including melanoma and non melanoma cell lines, an artificial skin melanoma model, and mice melanoma xenografts. We also employed a battery of cell biology techniques (viability, apoptosis and migration assays; electronic and optical microscopy; flow citometry; immunohistochemistry, immunofluorescence, etc.); biochemistry techniques (western blotting, protein immunoprecipitation, mass spectrometry, enzymatic activity determination by UV-VIS espectroscopy, etc.); molecular biology techniques (nucleic acid extraction, PCR, RT-qPCR, chromatin immunoprecipitation, etc.). The Results of the implementation of these techniques were subjected to the appropriate statistical tests and are summarized bellow. Since the ability of cells to delay cell cycle progression and halt DNA synthesis represents a defensive mechanism that spares potential toxicity, firstly we focused on deciphering the molecular basis of the MTX-induced cell cycle arrest. We identified the transcription factor E2F1 and the checkpoint kinase 1 (Chk1) as key mediators of this mechanism of resistance. The results indicated that MTX stimulated the transcriptional activity of E2F1 on the promoters of dihydrofolate reductase (DHFR) and thymidylate synthase (TS), which lead to an increase in the dTTP levels, instead of dTTP depletion as occurs in MTX-sensible cells. Since dTTP is an allosteric inhibitor of ribonucleotide reductase, which is necessary for the synthesis of all the dNTPs, dTTP excess induced DNA replication fork stress that activates the ATR/Chk1 DNA damage signaling pathway. Under these conditions, melanoma cells were protected from apoptosis by arresting their cell cycle in early S-phase. However, abrogation of this checkpoint by CHEK1 silencing or by UCN-01 (7-hydroxystaurosporine)-mediated Chk1 inhibition, rapidly triggered MTX-induced cell death, suggesting that inhibition of Chk1 in combination with this kind of antimetabolite chemotherapy is a viable therapeutic strategy to overcome melanoma resistance. Secondly, we focused on the study of the activation of melanogenesis observed after MTX treatment. Our results showed that Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) that normally acts as a master regulator of melanocyte development, function and survival, is responsible for the activation of melanogenesis in melanoma after MTX treatment. In fact, MTX treatment increases the expression of this transcription factor which in turn induces the expression of melanocytic differentiation genes driving melanin production and melanosome biogenesis as tyrosinase (TYR). The increased TYR expression in response to MTX-mediated MITF activation provided an opportunity to design a two step strategy consisting in the combination of MTX with a prodrug that our group had previously designed to be activated by TYR. This prodrug is a compound called 3-O-(3,4,5-trimethoxybenzoyl)-(-)-epicatechin (TMECG) that inhibits the enzyme DHFR with high affinity. The combination of MTX and TMECG was able to induce depletion of thymidine pools, double-strand DNA breaks, and highly efficient E2F1-mediated apoptosis in vitro and in vivo. Recently, it has been recognized that MITF acts as a melanoma rheostat in determining tumor subpopulation identity. In melanomas, reduced MITF expression leads to G1 arrested, invasive cells with stem-like properties including the ability to initiate tumors with high efficiency. By contrast, elevated MITF leads to activation of differentiation genes. In between, intermediate levels of MITF allow the proliferation of melanoma cells. Consequently, tumors comprise a mix of MITF-positive and negative melanoma cells. Therefore, the increase of MITF expression by MTX treatment would drive heterogeneous populations of tumor cells to a differentiated and less invasive phenotype and, at the same time, would sensitize these differentiated cells to the TYR-processed prodrug TMECG in a cell-specific fashion. In a different approach, we explored the molecular basis of the activation of the transport of melanosomes observed after MTX treatment with the aim of designing a therapeutic strategy driven to block the MTX export within melanosomes. We identified a new MTX-activated molecular pathway involved in the export of melanosomes, in which the motor protein MyosinVa (MyoVa) plays a key role. Our results demonstrated that melanoma treatment with MTX leads to Akt2-dependent MyoVa phosphorylation, which enhances its ability to interact with melanosomes and accelerates their exportation. Due to these findings, we designed a combined therapy driven to block this MyoVa/Akt2 pathway. Because UCN-01 is also a potent inhibitor of PDK1, which activates Akt by phosphorylation, we hypothesized that the inhibition of this Akt2 phosphorylation by UCN-01 may result in the disruption of MTX stimulated melanosome transport. In fact, MTX/UCN-01 combined therapy prevented MTX export by blocking melanosome transport and was able to induce a highly efficient E2F1-mediated apoptosis in culture and in vivo. In summary, we observed that the combination of MTX and UCN-01 may represent a therapeutic option for the treatment of this evasive disease / El melanoma es el tipo de cáncer de piel más agresivo y muestra una alta resistencia frente a todas las terapias anticancerígenas disponibles en la actualidad, incluyendo agentes citotóxicos como el metotrexato (MTX), un antifolato ampliamente utilizado en oncología clínica. Recientemente, nuestro laboratorio ha descubierto un nuevo mecanismo de resistencia al MTX específico de las células de melanoma por el cual, la endocitosis de esta droga mediada por el receptor de fólico α (FR-α) conduce al secuestro del MTX en los melanosomas y a su expulsión al exterior celular, reduciendo así la acumulación de esta droga en los compartimentos intracelulares. Esta baja concentración de MTX en el interior celular es capaz únicamente de inducir un arresto del crecimiento, pero no de inducir la muerte de las células de melanoma. Por tanto, se sabía que el tratamiento con MTX es capaz de inducir arresto del ciclo celular sin inducir apoptosis, de activar la síntesis de melanina y la biogénesis de melanosomas, y de acelerar el transporte de melanosomas, pero los mecanismos celulares y moleculares por los cuales el MTX mediaba estos efectos era desconocido. El Objetivo Principal de esta Tesis Doctoral fue la identificación de las bases moleculares del arresto del ciclo celular, de la activación de la melanogénesis y de la aceleración del transporte melanosomal inducidos por el tratamiento con MTX que, en conjunto, protegen a las células de melanoma de la apoptosis inducida por el MTX. El Objetivo Secundario fue el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas combinando el MTX con agentes dirigidos frente a dianas moleculares clave en los mecanismos de resistencia. En cuanto a las Técnicas e Instrumentación, se emplearon como modelos experimentales varias líneas celulares de melanoma y de otros tipos de cáncer, un modelo de melanoma de piel artificial y un modelo de xenoinjerto de melanoma en ratón. Además, empleamos una batería de técnicas de biología celular (ensayos de viabilidad, apoptosis y migración; microscopía óptica y electrónica; inmunohistoquímica; inmunoflorescencia, etc.); técnicas de bioquímica (western blot, inmunoprecipitación de proteínas, espectrometría de masas, determinación de actividad enzimática mediante espectroscopía UV-VIS, etc.); técnicas de biología molecular (extracción de ácidos nucleicos, PCR, RT-qPCR, inmunoprecipitación de cromatina, etc.) Los Resultados de la implementación de las citadas técnicas fueron sometidos a las pruebas estadísticas apropiadas y se resumen a continuación: Dado que se ha descrito que la capacidad de las células de detener la síntesis de ADN constituye un mecanismo de defensa que evita posibles daños, en primer lugar nos centramos en descifrar las bases moleculares del arresto del ciclo celular inducido por el MTX. Así, identificamos al factor de transcripción E2F1 y a la quinasa Chk1 como mediadores de este mecanismo de resistencia. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento con MTX estimulaba la actividad transcripcional de E2F1 sobre los promotores de los genes de la dihidrofolato reductasa (DHFR) y la timidilato sintasa (TS). Esto conducía a un incremento en los niveles de dTTP, en lugar de a una depleción de dTTP, como ocurre en células sensibles al MTX. Puesto que el dTTP es un inhibidor alostérico de la ribonucleótido reductasa que es necesaria para la síntesis de todos los dNTPs, este exceso de dTTP inducía un estrés en las horquillas de replicación capaz de activar la vía de señalización del daño al ADN mediada por ATR/Chk1. En estas condiciones, las células de melanoma evitan la apoptosis mediante el arresto de su ciclo celular al inicio de la fase S. Sin embargo, la eliminación de este checkpoint mediante el silenciamiento genético de CHEK1 o mediante la inhibición de esta quinasa con UCN-01 (7-hidroxistaurosporina) tras el tratamiento con MTX desencadena rápidamente la muerte celular, sugiriendo que la inhibición de Chk1 en combinación con este tipo de antimetabolitos es una estrategia terapéutica eficaz para vencer la resistencia del melanoma. En segundo lugar, nos centramos en el estudio de la activación de la melanogénesis por el MTX. Nuestros resultados demostraron que el factor de transcripción MITF (Microphthalmia-associated transcription factor) que, en melanocitos normales actúa como un regulador clave del desarrollo, función y supervivencia, era el responsable de la activación de la melanogénesis tras el tratamiento con MTX. De hecho, el MTX incrementa la expresión de este factor de transcripción el cual, a su vez, induce la expresión de genes implicados en la diferenciación melanocítica que conducen a la producción de melanina, como la enzima tirosinasa (TYR), y a la biogénesis de melanosomas. Este aumento en la expresión de TYR en respuesta a la activación de MITF mediada por MTX nos permitió diseñar una estrategia terapéutica basada en la combinación de MTX con una prodroga activada por TYR que había sido sintetizada previamente en nuestro laboratorio. Esta prodroga es el compuesto denominado 3-O-(3,4,5-trimetoxibenzoil)-(-)-epicatequina (TMECG), capaz de inhibir a la enzima DHFR con una alta afinidad. La combinación MTX/TMECG fue capaz de inducir el agotamiento de las reservas de timidina, roturas de doble cadena en el ADN y la apoptosis mediada por E2F1 con una alta eficacia, tanto in vitro como in vivo. Recientemente se ha descrito que MITF actúa como un reóstato en melanoma, determinando la identidad de las distintas subpoblaciones tumorales. Según este modelo, bajos niveles de MITF dan lugar a células arrestadas en G1, altamente invasivas con propiedades de célula madre, incluyendo una alta capacidad de iniciar tumores. Por el contrario, niveles elevados de MITF conducen a la activación de genes de diferenciación. Entre ambos, niveles intermedios de MITF permiten la proliferación de las células de melanoma. En consecuencia, los tumores suponen una mezcla de células con distintos niveles de MITF. Por tanto, el aumento de la expresión de MITF por el tratamiento con MTX conduciría a las poblaciones heterogéneas de células tumorales hacia un fenotipo común, diferenciado y menos invasivo, y, al mismo tiempo, sensibilizaría a estas células diferenciadas a una prodroga activada por TYR como el TMECG. En una aproximación diferente, estudiamos las bases moleculares de la activación del transporte de melanosomas inducida por el tratamiento con MTX. En este sentido, identificamos una nueva vía molecular implicada en la exportación de melanosomas en la que juega un papel esencial la proteína motora Miosina Va (MyoVa). Nuestros resultados demostraron que el tratamiento del melanoma con MTX conduce a una fosforilación de MyoVa mediada por Akt2 que incrementa la capacidad de esta proteína de interaccionar con los melanosomas y acelera su exportación. En vista de estos hallazgos, diseñamos una terapia combinada encaminada a bloquear la activación del transporte mediada por esta vía. Dado que se ha descrito que el UCN-01 es un potente inhibidor de PDK1, la cual activa a Akt por fosforilación, diseñamos una terapia de MTX combinado con UCN-01 para bloquear el transporte melanosomal. Efectivamente, la terapia combinada MTX/UCN-01 logró evitar la exportación de MTX mediante el bloqueo del transporte melanosomal y fue capaz de inducir la apoptosis mediada por E2F1 con una alta eficiencia tanto in vitro como in vivo.