ウエストナイルウイルス（WNV）は蚊によって媒介される人獣共通感染症の原因ウイルスである。自然界では野鳥と蚊の間でウイルスの感染環が維持されている。ヒトやウマは髄膜炎や脳炎を発症し、重篤な症例では死に至る。1999年、ニューヨーク（NY）市で北米では初めてWNVが確認され、その後わずか数年でアメリカ合衆国全域に流行が拡大した。WNVは1990年代前半まで病原性の低いウイルスであると考えられてきたが、近年北米で流行している株はヒトやウマだけでなく自然宿主である鳥類に対しても強い病原性を示す。ヒト用の効果的なワクチンや治療法は未だ開発されておらず、WNVの生物学的・生態学的特性を明らかにすることが公衆衛生上重要である。現在WNVの分布域は北米大陸だけでなく、南米大陸およびロシアにおいても拡大しており、ウイルスが渡り鳥や物流を介して日本や東アジア諸国に侵入する危険がある。日本国内でのWNVの流行はまだ報告されていないが、日本にはWNVを媒介可能な蚊と増幅動物となる鳥類が多く生息し、またWNVに近縁で血清学的に交差反応を示す日本脳炎ウイルス（JEV）が常在している。JEVは豚だけでなく野鳥も宿主とすることから、日本や東アジアにWNVが侵入した場合、両ウイルスが野鳥に重感染する可能性がある。鳥類における両ウイルスの感染を鑑別可能な診断法の確立も急務である。これらの背景から以下の研究を行った。第一章では、WNVのエンベロープ（E）蛋白質上への糖鎖付加がウイルスの増殖に与える影響を調べた。多くの病原性の弱いWNV株はE蛋白質上にN型糖鎖付加部位を欠損しており、WNV NY株を含む近年の病原性の強いウイルス株は糖鎖付加部位を持つ。このことから、WNVの強毒化には糖鎖付加が関連している可能性がある。以前の研究で、WNV NY株からE蛋白質上にN型糖鎖付加部位を持つLP株と糖鎖付加部位を持たないSP株を単離した。LP株はSP株に比べてマウス末梢での増殖性が高く、神経侵襲性毒力も強いことが判明している。本研究では、WNVのE蛋白質上への糖鎖付加がウイルスの増殖および伝播に与える影響を明らかにすることを目的とした。自然宿主内でのLP株とSP株の増殖性や病原性を調べるために、鶏雛およびアカイエカを用いて感染実験を行った。LP株を接種した鶏雛ではほぼ全ての個体が死亡したが、SP株接種群では半数以上が生き残った。また、LP株を接種した個体にのみ重度の壊死性心筋炎が観察されたことから、LP株は鶏雛に対してSP株に比べて高い病原性を有することが判明した。鶏雛血清中のウイルス量を経時的に測定したところ、接種後1～7日目まで、LP株はSP株に比べて常に10倍以上高いウイルス血症を示した。一方でアカイエカにLP株とSP株を胸腔内接種または吸血感染させたところ、両株の間に増殖性の差は認められなかった。次に、各ウイルス株の増殖性を調べるために、WNVの宿主となる哺乳類、鳥類および蚊に由来する培養細胞を用いて経時的なウイルスの増殖性を調べた。哺乳類由来細胞（BHK）および鳥類由来細胞（QT6）において、高温培養条件下ではLP株がSP株より10倍以上高い増殖性を示した。しかし蚊由来細胞（C6/36）においては両株の増殖性に差は見られなかった。これらの結果から、WNVのE蛋白質上糖鎖付加はウイルスの増殖性、特に鳥類宿主における高いウイルス血症に関与していることが示唆された。鳥類内でのウイルス血症が高ければ、蚊は高率にWNVに感染するため、この糖鎖付加が自然界における効率的なWNV感染環成立に寄与しているのではないかと考えられた。第二章では、ウエストナイルウイルスの極東ロシアの野鳥における抗体調査を行った。アメリカ大陸だけでなくロシアでもWNVは検出されており、近年その分布域が拡大している。極東ロシアでのWNV流行状況は良く調べられていないが、もしこれらの地域にもWNVが分布しているならば、近接する東アジア諸国へとウイルスが侵入してくる危険性がある。日本を含む東アジアにはWNVに近縁で同じ日本脳炎ウイルス血清型群に属するJEVが常在している。両ウイルスは抗原的に交差反応性を示すため、血清診断による鑑別が難しい。本研究では、信頼性の高い血清診断法である中和試験を用いて両ウイルスの交差反応性を評価した。また、日本に近接する極東ロシアにおいて野鳥の疫学調査を行い、中和試験による血清中の抗WNV抗体の検出を試みた。中和試験の特異性を検討するため、2日齢の鶏雛にJEVもしくはWNVを皮下接種し、一部の個体には3週間後に他方のウイルスを重感染させた。JEVまたはWNVを単独感染させた鶏雛血清についてフォーカス減少法による中和試験を実施したところ、それぞれのウイルスに対する中和抗体を特異的に検出することができた。またJEVとWNVを重感染させた鶏雛では、どちらのウイルスを先に接種しても両ウイルスに対する中和抗体が検出されることが判った。次に、極東ロシアにおけるWNVの浸淫状況を把握するため、野鳥における血清疫学調査を行った。野鳥が多く生息し、渡り鳥の中継地となるハンカ湖やアニュイ川、ホル川で2005年8月と2006年8月に合計152羽の野鳥を捕獲した。回収した野鳥の腎臓からRNAを抽出し、Real-Time PCR法によってWNV遺伝子の検出を試みたが全て陰性であった。一方、中和試験を用いて野鳥血清中の抗体測定を行ったところ、145検体中21検体（14.5％）でWNVに対する中和抗体が検出された。WNVに対する抗体が検出された鳥類種はカモ目やチドリ目、ハト目に属し、WNV感染によって高いウイルス血症を生じることが知られているものであった。WNV抗体陽性検体についてはJEVに対する中和試験も実施したが、ほとんどの検体でJEVに対する中和抗体価よりもWNV中和抗体価が4倍以上高く、この中和試験の結果はJEVに対する交差反応によるものではないことが判った。これらWNV抗体陽性の野鳥には、留鳥であるドバトやキジバトが含まれ、極東ロシアの野鳥間でWNVが流行していることが示唆された。また、その他の野鳥は全て渡り鳥であるため、日本や東アジア諸国へのWNV侵入の危険性が高まっていると思われる。これらの結果から、今後もロシアやロシアに隣接する地域における疫学調査を継続していくことが重要であると考えられた。 / Hokkaido University (北海道大学) / 博士 / 獣医学

北海道沿岸には5種のアザラシ類が生息あるいは回遊しており，中でも個体数が多いのがゼニガタアザラシおよびゴマフアザラシである．近年，両種ともに個体数の増加が報告されており，それに伴って沿岸漁業への被害や混獲によるアザラシの死亡個体数も増加している．沿岸生態系において高次捕食者に位置するアザラシ類の個体数変動は，下位の生物相にも大きな影響を与える．日本で唯一通年生息しているゼニガタアザラシは絶滅危惧ⅠB類として環境省が管理しており，北海道内では個体数の60％以上がえりもと厚岸に集中している．それに対して，冬から春に北海道の日本海およびオホーツク海沿岸に来遊するゴマフアザラシは，環境省ではなく北海道の管理下にある．アザラシの漁業被害量や混獲死亡個体数は地域差が大きく，さらに両種が同所的に生息している地域もある．しかし，それらの多くはどちらか一方を対象としたものであり，分類学的に近縁な2種の相違をより明確にするためには，2種を対象とした比較研究が必要である．本研究では，北海道沿岸に生息するゼニガタアザラシとゴマフアザラシについて，形態学的および遺伝学的比較を行った．ゼニガタアザラシとゴマフアザラシの成長に伴う頭蓋骨形態の変化を調べたところ，ゼニガタアザラシでは幼獣の段階から雌雄差が認められた．また，ゴマフアザラシよりもゼニガタアザラシの方が大型であることもすべての成長段階で認められた．ゴマフアザラシは1980年代には雌雄差がほとんど認められないと報告されていたが，本研究では特に咀嚼機能に関与する計測部位で雌雄差が認められた．これは近年の個体数増加に伴って，繁殖競争や餌生物を巡る競争が激化したためではないかと考えられた．成長段階による頭蓋骨の非計測的特徴の変化を調べたところ，側頭頬骨縫合と鼻骨切歯縫合の形状には種差が認められた．また，両種は幼獣の段階では特徴が類似しているが，成長に伴ってゼニガタアザラシの形状が変化して種差が明確になっていくことが明らかとなった．mtDNA・チトクロームb領域配列の解析の結果，ゼニガタアザラシではえりもの個体のハプロタイプ多様度が他に比べて低く，系統樹でも厚岸や納沙布の個体とは異なる集団に分かれることが認められた．このことから，北海道沿岸のゼニガタアザラシはえりも個体群と道東個体群が存在することが明らかとなった．それに対して，ゴマフアザラシのハプロタイプは多様であり，系統樹でも明確な地域個体群を認めることは出来なかった．この個体群の有無は両種の生態学的相違を反映しており，上陸場への定着性の強いゼニガタアザラシが明確な地域個体群を示したのに対して，回遊性があり特定の上陸場への定着性があまりみられないゴマフアザラシには地域個体群が認められないということが確認された．mtDNAとSRYによる両種の種間交雑判定を試みたところ，えりものゼニガタアザラシ28個体中1個体とゴマフアザラシ5個体中2個体で，斑紋と異なる種のmtDNAハプロタイプを持つことが確認された．その他の地域では，すべての個体は斑紋と同じ種のmtDNAハプロタイプを示した．しかし，SRY配列を調べたところ，ゼニガタアザラシとゴマフアザラシは同じ配列であり，SRYハプロタイプを利用して交雑判定を行うことは不可能であった．しかし斑紋とmtDNAハプロタイプが異なる個体が確認されたことから，えりもで種間交雑が生じている可能性が考えられた．本研究の結果から，北海道沿岸に生息するゼニガタアザラシとゴマフアザラシの頭蓋骨形態の成長に伴う特徴，mtDNAによる地域個体群の存在有無，種間交雑個体の存在の可能性が示された．特に，えりも地域では遺伝的特異性の高いゼニガタアザラシの地域個体群が認められるとともに，ゴマフアザラシとの交雑が生じている可能性も考えられた．従って，北海道におけるアザラシ類の保護管理を行う上で，えりも地域のモニタリングを重点的に進める必要があると考えられた．アザラシ類や沿岸漁業を含めた沿岸生態系の保全管理を実行していくにあたり，本研究の結果を基盤として，更に多様な調査研究へと発展させていくことが望まれる． / Hokkaido University (北海道大学) / 博士 / 獣医学

The potential for non-cardiac drugs to induce QT interval prolongation accompanied by a rare but life-threatening lethal arrhythmia has generated intense interest and concern in the development of pharmaceuticals. Because inhibition of the hERG channel is considered the main cause for the QT interval prolongation, in vitro hERG inhibitory tests are generally conducted in early-stage drug development. However, hERG inhibitors do not necessarily cause QT prolongation and hERG tests are considered insufficient for actual QT risk assessment. In this study, in consideration of accurate QT risk evaluation in the early stages, I developed in vivo assays using anesthetized guinea pigs, anesthetized dogs and conscious common marmosets. 1. Since the period of ventricular repolarization (QT interval) adapts to changes in the heart rate (or RR interval), studies using anesthetized guinea pigs and dogs were conducted under a fixed heart rate using atrial pacing to accurately assess the effects of drugs on the QT inteval. In addition, studies using anesthetized dogs and conscious marmosets were preformed under highly sensitive conditions using the appropriate QT correction formula obtained from a relationship between QT and RR intervals. 2. The monophasic action potential (MAP) was measured in anesthetized guinea pigs under a fixed heart rate using atrial pacing. Eight positive reference drugs (E-4031, cisapride, astemizole, terfenadine, bepridil, haloperidol, quinidine, dl-sotalol) and four negative reference drugs (diltiazem, verapamil, chlorpheniramine, captopril) were intravenously administered at various dosages to assess the effects on the MAP duration (MAP90(pacing): action potential duration at 90% repolarization level). All positive reference drugs showed dose-dependent MAP90(pacing) prolongation, whereas the negative reference drugs did not. There was a clear correlation between each estimated 5% MAP90(pacing) prolonging dose (ED5: 5% effective dose) of the eight positive reference drugs and the clinical plasma concentration associated with QT prolongation previously reported (R2=0.7214). 3. The electrocardiogram (ECG) under atrial pacing conditions was measured in anesthetized dogs. A relationship between the QT and RR intervals under a nontreatment condition was clarified. The QT/RR relationship indicated that when the RR interval was prolonged, prolongation of the QT interval followed. In order to obtain a QT interval uninfluenced by changes in the heart rate, QT corrections were compared among the formulae of Bazett, Fridericia, Matsunaga, Van de Water and the study original. The study original formula (QTcX=QT/RR0.3879) eliminated the influence of RR interval most effectively and resulted in small CV values, indicating that the method showed the most appropriate correction of the QT interval against the RR interval. Two positive reference drugs (astemizole, dl-sotalol) and one negative reference drug (propranolol) were intravenously administered to assess the effects on the QTc interval corrected by the study original QT correction formula at sinus rhythm (QTcX) and QT interval under atrial pacing (QT(pacing)) and the plasma drug concentrations were measured. All of the positive reference drugs dose-dependently prolonged the QTcX interval and QT(pacing), whereas the negative reference drugs failed to do so. The plasma concentrations of the positive reference drugs associated with QT prolongation were mostly consistent with those associated with previously reported clinical QT prolongation. 4. Common marmosets were implanted with telemetry transmitters. ECG was measured under a conscious condition and a relationship between QT and RR intervals was clarified. The QT/RR relationship indicated that when RR interval was prolonged, prolongation of the QT interval followed, as with the abovementioned anesthetized dogs. In order to obtain a QT interval uninfluenced by changes in heart rate, the QT correcting formulae of Bazett, Fridericia and individual correction were compared. The individual QT correction method (QTci=RRrefβ×QT/RRβ, where β is the individual correction coefficient) most effectively eliminated the influence of RR interval and resulted in small CV values, indicating that the method showed the most appropriate correction of the QT interval against the RR interval. Two positive reference drugs (astemizole, dl-sotalol) and two negative reference drugs (propranolol, nifedipine) were orally administered to assess the effects on the QTc interval corrected by the individual QT correction formula and the plasma drug concentrations measured. All positive reference drugs showed QTc interval prolongation, whereas the negative reference drugs did not. The plasma concentrations of the positive reference drugs associated with QT prolongation were mostly consistent with those associated with previously reported clinical QT prolongation. 5. All of the assays using anesthetized guinea pigs, anesthetized dogs and conscious marmosets developed in this study showed high sensitivity and high specificity. In addition, the quality of sensitivity was appropriate because the results of the positive reference compounds showed a clear correlation with clinical outcomes. Therefore, these assays would be useful for the assessment of drug-induced QT interval prolongation. The anesthetized guinea pig assay can deal with many different test compounds and is superior in throughput. The anesthetized dog assay can accurately clarify the safety margin of test compounds because of the many blood-sampling points for the measurement of plasma drug concentration. The conscious marmoset assay can be conducted with the same drug administration route used in clinic and thus could be effectively utilized. The appropriate assay should be selected according to the characteristics and the number of test compounds. Incorporation of these assays into early-stage drug development would provide a potentially accurate and more integrated assessment of QT risk and thus a more timely introduction of new pharmaceuticals into the clinic stages with fewer safety issues. / Hokkaido University (北海道大学) / 博士 / 獣医学

1997年以来、H5またはH7ウイルスの感染に因る高病原性鳥インフルエンザ(HPAI)の発生が続いている。筆者はインフルエンザAウイルスの自然宿主である野生水禽に維持されているH5またはH7ウイルスとHPAIウイルス間でヘマグルチニン(HA)の抗原性が類似していることを示した。本結果に基づき、野生水禽から分離された非病原性鳥インフルエンザウイルスを元に、A/duck/Hokkaido/Vac-1/2004 (H5N1) [Vac-1/04 (H5N1)]、A/duck/Hokkaido/Vac-3/2007 (H5N1)、およびA/duck/Hokkaido/Vac-2/2004 (H7N7)[Vac-2/04 (H7N7)]をワクチン候補株として作出した。ホルマリン不活化したVac-1/04 (H5N1) を100μg皮下接種したマウスは、HPAIウイルスVietnam/1194/2004 (H5N1)の致死量の攻撃に耐過した。Vac-1/04 (H5N1)およびVac-2/04 (H7N7)によって試製したワクチンを接種したニワトリおよびサルは、HPAIウイルスの攻撃に耐過した。以上の結果は野生水禽から分離した非病原性ウイルスがHPAIウイルスに因る感染症に対するワクチン株として有用であることを示している。一方で、ワクチンの濫用はHPAIウイルスの見えない流行拡大を助長する恐れがある。ワクチン接種に依存しHPAI対策の基本である摘発淘汰が疎かとなっている地域では、抗原変異ウイルスの出現を招くと共に、人の感染例が増加している。本研究で確立したワクチン株と流行株間の交差反応性を調べると共に、世界各国が摘発淘汰を基本とした対策を行い、鳥インフルエンザを封じ込める必要がある。H5またはH7ウイルスに因るHPAIに加え、近年低病原性H9N2ウイルスによる鳥インフルエンザの発生がアジア・中近東で続いており、家禽に甚大な被害を及ぼしている。従ってH9ウイルスがH5およびH7ウイルスのように家禽に対する高い病原性を獲得し得るかどうかを確認しておくことは防疫上重要である。本研究において、H9ウイルスのHA開裂部位にHPAIウイルスに見られる塩基性アミノ酸の連続配列を人工的に導入し、さらにヒヨコの気嚢内で10代継代したウイルス、rgY55sub-P10 (H9N2)はニワトリに対して静脈内接種病原性を示した。HA 開裂部位に導入した塩基性アミノ酸、および継代によって起こったアミノ酸の置換がニワトリに対する高い病原性に関与するものと考えられる。rgY55sub-P10 (H9N2)はMDCK細胞における増殖に外来性のトリプシン(ニワトリの呼吸器・腸管に局在)を必要としなかったが、本株を鼻腔内に接種したニワトリはH5ウイルスを接種した場合と異なり全く症状を示さなかった。本結果はニワトリ体内のユビキタスなプロテアーゼによるHAの開裂活性化はウイルスの全身感染に必要であるが、十分条件ではないことを示している。H5ウイルスはH9ウイルスに比べニワトリの血管内皮細胞で効率的に増殖してウイルス血症を引き起こし、さらに脳に侵入して高い病原性を発揮するものと考える。本研究では、H9N2ウイルスが静脈内接種病原性を獲得し得ることを示した。H9ウイルスはニワトリに細菌と共感染すると、鼻腔内接種病原性が増強することが報告されている。HA開裂部位に塩基性アミノ酸の置換変異を有するウイルスが実際に野外のニワトリから分離されており、このようなウイルスが鶏群内で感染を繰り返すことによって、静脈内接種病原性に加え鼻腔内接種病原性を獲得する恐れがあるので、監視を続ける必要がある。本研究で得られた成績は野生水禽および家禽におけるインフルエンザサーベイランスが、1) 環境中のウイルスの抗原性を把握する、2) HPAIに対するワクチン株を得る、3) 新たなHPAIウイルスの出現予測、のために重要であることを示している。 / Hokkaido University (北海道大学) / 博士 / 獣医学

Hokkaido University (北海道大学) / 博士 / 獣医学

Diabetic nephropathy is the most common cause of end-stage renal failure in developed countries. Strict glycemic control or blood pressure control of diabetic patients with nephropathy result in delay of dialysis onset. However, there is no therapeutic agent at the moment to regress the kidney injury in diabetic nephropathy. Thus, the development of novel therapeutics for diabetic nephropathy is an intensively investigated topic. In the present study, the mechanisms of the progression of diabetic nephropathy was investigated, using type II diabetic nephropathy rat model SHR/NDmcr-cp and in vitro cultured renal cells. First, the renoprotective effects achieved by an insulin-sensitizer, pioglitazone, or by insulin were compared in SHR/NDmcr-cp. Pioglitazone markedly attenuated hyperinsulinemia and renal dysfunction in contrast with insulin treatment. Although renal accumulation of pentosidine and the local oxidative stress were both reduced to a similar extent by pioglitazone and insulin, the enhanced TGF-β expression was suppressed only by pioglitazone, suggesting that hyperinsulinemia up-regulated TGF-β expression. These data suggest that hyperinsulinemia together with a stimulated TGF-β expression significantly contribute to the incidence and deterioration of diabetic nephropathy. Second, the renoprotective effects of cobalt chloride, which enhances a key defensive factor against hypoxia, i.e. HIF, were evaluated in SHR/NDmcr-cp. The renal expression of TGF-β and CTGF, renal accumulation of pentosidine, and the local oxidative stress were reduced, and significant renoprotection was observed by cobalt treatment. Cobalt treatment up-regulated renal HIF-1α expression, increased the expression of HIF-regulated genes, e.g. erythropoietin, VEGF, and HO-1, and protected peritubular capillaries. Thus, cobalt achieved renal protection via the activation of HIF-1α signals, and its effect was attributed to prevention of renal hypoxia. Third, the role of megsin, a member of the serine protease inhibitor superfamily, in the decreased activities of MMP-2, MMP-9 and plasmin was investigated. High-glucose up-regulated megsin RNA expression in the kidney of SHR/NDmcr-cp as well as in vitro in cultured mesangial cells (RMC). The functional studies in RMC showed that megsin potentially inhibits total enzymatic activities of MMP-2, MMP-9 and plasmin, indicating decreased degradation of mesangial matrix. An anti-megsin neutralizing antibody restored the reduced activities of MMP-2 and MMP-9 by megsin in RMC. These data suggest that hyperglycemia induces up-regulation of megsin which, in turn, inhibits activities of plasmin, MMP-2 and MMP-9, potentially contributing to mesangial matrix accumulation in diabetic nephropathy. In conclusion, this study shows that the etiology of diabetic nephropathy involves hyperinsulinemia due to the increased expression of TGF-β that occurs through several distinct pathways including activation of HIF-1α signals and up-regulation of megsin. These findings provide new insights into searching and identifing therapeutic targets for diavetic nephropathy. / Hokkaido University (北海道大学) / 博士 / 獣医学

The broad ligament is a double peritoneal membrane connecting the abdominal wall and the uterus, and the blood vessels pass through the broad ligament to supply the uterus. In aged mares, broad ligament hematoma that often leads to the death by blood loss can occur in perinatal period. It is difficult to arrest hemorrhage by surgical procedure and to estimate and prevent the broad ligament hematoma, because there are few case reports on the sites of arterial rupture, etiology and pathogenesis of the broad ligament hematoma in pregnant mares. The present study purposes elucidating 1) clinical findings of broad ligament hematoma by hearing investigation for owners and clinical veterinarians, 2) preferential rupture sites of blood vessels by necropsy, 3) mechanisms of the arterial ruptures by histopathological examination, and 4) aging changes of the arteries predisposed to the broad ligament hematoma. In the first chapter, the breeding site of 36 Thoroughbred mares died of broad ligament hematoma in perinatal period was identified by necropsy. I also interviewed owners and clinical veterinarians treated the horses. The mean age of the affected mares was 17.15 ± 3.43 years (S. D.), and the parity was 9.86 ± 2.85 times (S. D.). Thirty mares showed clinical signs after delivery, and 18 of the 19 mares in which the time course between delivery and death could be specified, died within 24 hours after delivery. At necropsy, rupture sites were identified in 31 of 36 mares, and the sites were located in the uterine artery (24 mares), internal pudendal artery (5 mares), caudal mesenteric artery (1 mare), and internal iliac artery (1 mare). Among these, the proximal uterine artery that lies near the bifurcation from the iliac artery was the most frequent site of rupture. The arterial ruptures occurred 4 times more frequently at the left side than the right. The rupture at uterine artery tended to occur in aged mare. The arterial ruptures preferably occurred at arterial bifurcations subjected to severe hemodynamic stress. Most of the ruptures were a tear in the arterial wall, but in other cases, the arteries were completely transected. The broad ligament hematoma usually occurred in mares older than 14 years. The proximal part of uterine artery that is the preferential site for rupture can be monitored by transrectal echography. Therefore, the proximal part of uterine artery should be check primarily using transrectal echography in the mares suspected of broad ligament hematoma. The antemortem identification of rupture sites may enable the arrest of hemorrhage by surgical procedure. In the second chapter, I pathologically examined 31 mares in which the rupture sites were macroscopically identified and investigated the mechanisms of the arterial ruptures. The morphology of the ruptures was classified into three types: rupture with longitudinal fissures, rupture without longitudinal fissures, and transection. The arterial ruptures with fissures occurred only in the proximal uterine artery, and transections mainly occurred in the internal pudendal artery. Histologically, fibrosis of the tunica media and thickened tunica intima were observed adjacent to the arterial ruptures, and these changes were observed commonly on both sides of the ruptured and apparently intact arterial walls. Therefore, these arterial change might be related with aging and multiparity. The lumen of some proximal uterine artery without rupture was partially dilated with thin arterial wall, forming small aneurism. These changes might be the result of hemodynamic stress to the arterial wall and similar lesions were observed in distal uterine artery forming spiral shape. The middle to distal uterine artery had abundant longitudinal smooth muscle fasicles in the tunica adventitia, and the luminal surface of these area formed circumferential ridges and grooves. These structures might make the middle to distal uterine artery more resistant to mechanical forces such as tugging and increased blood pressure, and might contribute to lower incidence of arterial ruptures in those areas in compare with that of proximal uterine artery. Coagulative necrosis and infiltration of inflammatory cells were observed at the rupture sites of the internal pudendal artery. These changes were not observed in other arteries. The internal pudendal artery runs between the uterus and pelvis, and the artery may be injured due to being caught between them during pregnancy or parturition. Therefore, the cause of internal pudendal artery rupture may be physical injury by the external forces. At the ruptured edge of internal iliac artery, circular smooth muscles of the tunica media were crossed with longitudinal smooth muscle bundles and collagen fibers. Due to its structure, the artery might be poorly dilative and increased blood pressure may cause arterial rupture. The caudal mesenteric artery of one mare was transected, and blood cells flooded among smooth muscle cells in tunica media at elongated edge of transected artery. Since this mare suffered dystocia due to an excessively-sized fetus, arterial rupture might occur at parturition by vigorous traction of caudal mesenterium, small colon and rectum. The present study revealed that broad ligament hematoma in mares had preferential site for arterial rupture, the proximal uterine artery, but the rupture may also occur in other arteries with different mechanisms. Therefore, ruptured sites should be sought at necropsy and therapy considering the age of mare, number of delivery, extent of dytocia and size of fetus. In the third chapter, the uterine artery and external iliac artery of mares of variable ages without broad ligament hematoma were histologically examined to determine whether the histological lesions of arteries described in the former chapter at non-rupture sites were the specific change for mares with broad ligament hematoma or aging changes common for mares. The mares had the same arterial changes in uterine artery as observed in the mare with broad ligament hematoma and they were congruent with aging changes of arteries in humans and rats. The aging changes included an atrophy of smooth muscle cells with medial fibrosis. The fibrotic area of the uterine artery appeared irregularly-shaped thick bands in the proximal part and regular thin bands in middle and distal uterine artery. The other aging changes were the disruption of internal elastic lamina and thickening of tunica intima due to an increase of collagenous stroma and proliferation of smooth muscle cells. Tunica intima of the proximal uterine artery was thicker than those of middle and proximal arteries, reflecting the different magnitude of hemodynamic stress on the uterine artery. The results of morphometrical analysis confirmed the aging changes of arterial walls. In the tunica media of external iliac artery, a decrease of elastin and an increase of collagen with aging were detected by routine histopathology, but the age-dependency was not substantiated by the morphometrical analysis. The result of this chapter indicates the histological changes of arteries described in the chapter 2 was aging change common to mares and the degree of the aging changes differed among arteries and areas of arteries. These changes were more prominent at the proximal part of uterine artery, the most frequent site of arterial rupture in aged mares, thus the aging change were considered to be one of the predisposing lesions for the arterial rupture resulting in broad ligament hematoma. Arterial lesions with aging may elevate systolic pressure of arteries and increase the risk of arterial rupture. Therefore, daily monitoring of blood pressure might be helpful in evaluating the risk of broad ligament hematoma in aged mares at perinatal period. / Hokkaido University (北海道大学) / 博士 / 獣医学

インフルエンザ脳症 (IAE) はインフルエンザウイルス感染に伴う致死的な中枢神経疾患の一つである。本邦では毎年100例前後の患者がみられ、5歳以下の幼児での発生が全体の約8割を占めている。死亡率は約30%と高く、神経学的後遺症が遺残することも多いため、効果的な治療・予防法の確立が急務である。本疾患の特徴的な臨床所見はインフルエンザによる発熱の直後に現れる左右対称性の急性脳浮腫で、その後しばしば播種性血管内凝固、多臓器不全の続発を伴うことがある。患者剖検例の病理組織学的検査では脳血管の障害による血液脳関門 (BBB) の破綻が明らかであるため、急性経過での血管障害がIAEの基盤病変であると考えられている。本疾患の発症メカニズムに関しては解明されていない点が多く、動物モデルもこれまでに報告されていない。患者の中枢神経系からはインフルエンザウイルスが分離されないことから、ウイルス感染による直接的な脳組織傷害が本疾患の原因である可能性は低いと考えられる。一方、患者の血液中にはTNF-α、IL-1β、IL-6などの炎症性サイトカインの上昇が認められることが多い。これら炎症性サイトカインの血中濃度とIAEの重篤度が比例することから、サイトカイン血症による急性の血管障害がIAEの原因であるという説が有力である。インフルエンザ脳症の病理組織学的所見がエンドトキセミアによる脳症と類似することから、本論文の第1章では、インフルエンザAウイルス (IAV) 感染乳のみマウスへのリポポリサッカライド (LPS) 投与によるIAEモデルの作出を試みた。IAVとLPSを接種したマウス (IAV+LPS群) ではLPS単独接種群のマウスに比べ、神経病原性と脳血管透過性の亢進がより重度に発現することが分かった。病理組織学的検索では、IAV+LPS群の脳に微小出血、浮腫および好中球浸潤が認められ、同群マウスはIAEと同様の血管障害による脳症を示していた。IAV+LPS群マウスの血漿では、IAVまたはLPSを接種したマウスに比べ、TNF-α、IL-6が有意に上昇しており、IAE患者の血清学的検査所見に一致していた。また、IAV+LPS群マウスの脳にはIAVの感染は認められなかった。同群マウスで観察された脳病変、血中サイトカイン動態、および脳におけるIAVの不在がIAEの特徴に一致していたことから、IAV感染乳のみマウスはLPS接種によりIAE類似脳症を示し、IAEの病態モデルとなることが明らかにされた。本論文の第2章では、IAV+LPS接種マウスにおけるIAE様脳病変の形成メカニズムを病理学的に解析した。その結果、IAV+LPS群マウスの脳ではIAVまたはLPS接種群と比べ、アポトーシス細胞の増加がみられた。アポトーシスは主に脳の血管周囲で見られ、その一部は血管内皮様の紡錘形細胞だった。また、アポトーシス陽性細胞の一部はアストロサイトのマーカーに対して陽性を示した。アストロサイトと血管内皮細胞はBBBの機能と密接に関係しており、IAV+LPS群マウスでは、これらの細胞のアポトーシスによるBBBの破綻がIAE様脳病変を引き起こす一因になっていることが示唆された。一方、脳血管内皮細胞に発現するタイトジャンクション (TJ) 蛋白質の発現量を比較したところ、マウス群間での有意な差は認められなかった。このことから、IAV+LPS群マウスのIAE様脳症の形成にはTJの機能低下による内皮細胞間透過性の亢進は重要な要因ではないと考えられた。過去の報告によると、IAE患者の脳グリア細胞や血管内皮細胞においてもアポトーシスの増加が示されており、本実験のIAV+LPS群マウスの脳症病変はIAEと共通のメカニズムにより形成されていることが示唆された。本論文では、乳のみマウスにおいてIAVの肺感染がLPS誘発性の脳症および炎症性サイトカイン産生を増強させることを示した。同処置を行ったマウスの脳の病理組織像、血中サイトカイン動態およびウイルス分布はIAEの特徴に一致した。また、その脳症病変の形成には脳血管内皮細胞とアストロサイトのアポトーシスが関与しており、本実験のIAV+LPSマウスではIAEと共通のメカニズムにより脳症病変が形成されていると考えられた。また、IAV+LPS群マウスでは血中サイトカイン濃度の上昇が脳におけるアポトーシス誘導の引き金となっていると考えられ、ヒトにおいても高サイトカイン血症による脳血管内皮細胞とアストロサイトのアポトーシスがIAEの原因となる可能性が示された。本マウスモデルはIAEの早期診断法と有効な治療法の開発に役立つことが期待される。 / Hokkaido University (北海道大学) / 博士 / 獣医学

Spectrin strengthens the red cell membrane through its direct association with membrane lipids and through protein-protein interactions. Spectrin loss reduces the membrane stability and results in various types of hereditary spherocytosis. However, less is known about acquired spectrin damage. The present study showed that α- and β-spectrin in human red cells are the primary targets of the lipid peroxidation product 4-hydroxy-2-nonenal (HNE) by immunoblotting and mass spectrometry analyses. The level of HNE adducts in spectrin (particularly α-spectrin) and several other membrane proteins was increased following the HNE treatment of red cell membrane ghosts prepared in the absence of MgATP. In contrast, ghost preparation in the presence of MgATP reduced HNE adduct formation, with preferential β-spectrin modification and increased cross-linking of the HNE-modified spectrins. Exposure of intact red cells to HNE resulted in selective HNE-spectrin adduct formation with a similar preponderance of HNE.β-spectrin modifications and marked reduction in the membrane mechanical properties. These findings indicate that HNE adduction occurs preferentially in spectrin at the interface between the skeletal proteins and lipid bilayer in red cells and suggest that HNE-spectrin adduct aggregation results in the extrusion of damaged spectrin and membrane lipids under physiological and disease conditions. / 膜脂質の過酸化は、4-hydroxyl-2-nonenal (HNE)をはじめとする種々のアルデヒドやアルケナールを産生する。これらの脂質過酸化産物は、核酸やタンパク質と共有結合して、その構造と機能の障害を生じる。赤血球は、こうした脂質過酸化産物による障害を最も受け得る細胞であり、その老化にともなうHNE の蓄積が知られるが、実際にいかなる分子修飾がどのような影響をもたらすのかは不明である。本研究は、その解明を目的に、主にヒト赤血球膜におけるHNE 付加タンパク質と修飾部位の同定、ならびに膜物性に対する影響の解析を行った。まず、抗HNE 抗体を用いたイムノブロッティングの結果、膜骨格網状構造の主体をなすタンパク質、α-、ならびにβ-スペクトリンにHNE 付加体のシグナルが検出された。赤血球膜ゴーストをHNE と孵置すると、アクチンやバンド３をはじめとする他の主要膜タンパク質にHNE 付加が生じたが、無傷赤血球にHNE を作用させた場合にはスペクトリンにのみ、特にβ-スペクトリンにHNE 付加体の著しい増加が認められ、α-、ならびにβ-スペクトリンがHNE の主たる標的分子であることが明らかになった。飛行時間型質量分析装置を用いた解析から、その修飾部位は、β-スペクトリン分子N 末端ドメイン(βN)中のIle110-…-Arg127 配列など、膜脂質と直接に相互作用する領域を中心に複数存在し、Cys、His、ならびにLys 残基のMichael 付加体として、またLys 残基では加えてSchiff 塩基付加体として存在すると推定された。一方、ヒト以外の赤血球膜でも、HNE との孵置によりHNE-スペクトリンの著増がみられたが、自然付加体の量はヒト赤血球に比べて少なく、また動物種により差異が認められた。これらの知見は、スペクトリン分子と膜脂質との相互作用がHNE 修飾に影響することを示唆するものである。そこで、赤血球におけるスペクトリン-膜脂質間結合を保つMgATP の存在／非存在下に膜ゴーストを調製し、これらのHNE 付加を検討した。その結果、MgATP 存在下では、HNEとの孵置でスペクトリンの不可溶性凝集体形成が生じ、α鎖よりもβ-スペクトリンの修飾が優位であった。対照的に、MgATP 非存在下では、HNE-α-スペクトリンの生成がβ鎖のそれを上回り、明瞭な凝集はみられなかった。また、比重遠心で分画した赤血球では、予想に反して全ての分画の赤血球でスペクトリンのHNE 修飾がみられ、最下層の老化赤血球では軽度のHNE-スペクトリン減少が認められた。これらの知見は、スペクトリンの膜への組み込み後早期に一定量のHNE 付加が生じることを示すとともに、赤血球の末梢循環過程で限定的なHNE-スペクトリン凝集体の形成と膜小胞としての除去が生じることを示唆している。さらに、HNE 付加による赤血球膜の機械的特性の変化を知るために、エクタサイトメーターで赤血球の変形能を解析したところ、変形能指数は、HNE の濃度と孵置時間に応じて対照赤血球の値の40%～80%に低下した。また、HNE-スペクトリンの赤血球反転小胞への結合定数は対照スペクトリンの約1/2 とわずかではあるが低下を示した。したがって、一時的なHNE 付加体の増加は、スペクトリン-アクチン膜骨格の変形能を低下させて局所的な膜の断片化を生じ得ると推測され、その一因として赤血球膜との相互作用の強まりが考えられた。以上のように、本研究の成績は、酸化ストレス下、赤血球内外で生成するHNE が赤血球膜に作用してスペクトリンと共有結合付加体を形成し、スペクトリンの性状と機能を変化させることを通して赤血球膜の変形能を低下させることを明らかにしたものである。これらの知見は赤血球の老化や様々な疾患病態にともなう赤血球膜物性変化に新しい視点を与えるとともに、酸化ストレスが関わる疾患の細胞病態に、膜インターフェースにおける脂質過酸化産物による骨格タンパク質の構造・機能修飾が関わる可能性を示すものである。 / Hokkaido University （北海道大学） / 博士 / 獣医学

網状赤血球の成熟は、赤芽球系細胞分化・成熟の最終段階であり、成熟赤血球が必要とする膜の特性を獲得するために、トランスフェリンレセプター(TfR)をはじめとする過剰／不要な細胞膜成分を排除する過程である。この過程には、タンパク質分解、ならびにエクソゾーム(exosome) と呼ばれる微小小胞の放出が関わるとされる。犬網状赤血球にはNa,K-ATPase が存在するが、これは成熟赤血球に至る過程で消失し、結果として、犬赤血球は一般に高Na+、低K+のLK 型赤血球となる。一方で、柴犬や珍道犬には遺伝的にNa,K-ATPase を保持したHK 型赤血球をもつ個体が存在する。本研究の目的は、犬網状赤血球成熟過程におけるNa,K-ATPase 消失におけるエクソゾームの役割と、そのHK/LK 赤血球表現型との関連の解明である。第１章では、犬網状赤血球の成熟過程で放出される小胞の性状を解析した。LK 型犬から得た網状赤血球を孵置し、24、72 時間後に上清を分別遠心すると微小小胞が得られた。この小胞は直径20～60 nm で、Hsc70、TfR など、既報エクソゾームの指標となるタンパク質を主要成分として含むことから、エクソゾームと判断した。膜タンパク質の解析から、犬の網状赤血球膜に含まれるが赤血球膜には存在しないNa,K-ATPase α サブユニット、Hsc70、TfR、GLUT1、ならびに脂質ラフトタンパク質のひとつstomatin は、いずれもこのエクソゾームに存在した。一方で、赤血球膜の主要タンパク質、バンド３、スペクトリンは検出されなかった。また、Na,K-ATPase、Hsc70、TfR はTriton X-100 可溶性画分に、一方、GLUT1 は不溶性画分に、GLUT1 と相互作用するstomatin は両画分に含まれていた。さらに、このエクソゾームをショ糖密度勾配遠心で分画したところ、小胞は比重1.06 g/ml～1.14 g/ml（画分4～12）の範囲に広く分布し、Hsc70、TfR、stomatin は画分5～8、特にラフトマーカーのGM1 と同じ画分7 と8 に多く含まれていた。一方、Na,K-ATPase は、より比重の小さい画分4～6 に主に認められた。これらの結果から、網状赤血球エクソゾームの組成は均一ではなく、タンパク質構成の異なるポピュレーションから成ることが明らかになるとともに、Na,K-ATPase と一部のstomatin、Hsc70 が同一ポピュレーションに存在することが示唆された。そこで第２章では、overhydrated stomatocytosis (OHSt)患者における欠損を発端に見出され様々なトランスポーターとの相互作用が提唱されているstomatin に焦点をあて、遺伝子型hk/hk のHK 型、hk/lk とlk/lk 由来のLK 型各犬の網状赤血球と成熟赤血球におけるstomatin の含量を検討した。HK 型(hk/hk)の赤血球膜におけるstomatin 含量がヒト赤血球と同程度であるのに比べ、LK 型(lk/lk)はその2%以下でOHSt 患者と同様の低値を示した。また、遺伝子型hk/lk のLK 型赤血球のstomatin 含量はHK 型の10%程度で、hk/hk 型、ならびにlk/lk 型と明確な差異を示した。上述のようにLK 型(lk/lk)網状赤血球にはstomatinが存在し、これに対するHK 型の赤血球、網状赤血球のstomatin 含量はそれぞれ8 倍、12.5倍であった。Na,K-ATPase とGLUT1 にも類似した量的関係が認められた一方で、TfR 含量はHK 型、LK 型の網状赤血球で同程度であった。これらの成績から、HK 型とLK 型は、いずれも網状赤血球の成熟にともなったstomatin とNa,K-ATPase の減少を同様に生じること、成熟赤血球のHK/LK 表現型が両型の網状赤血球における発現量の差違に基づくことが明らかになった。以上のように、本研究は、複数のポピュレーションを含む犬網状赤血球エクソゾームがNa,K-ATPase やstomatin をはじめとする膜タンパク質の同時、かつ選択的な除去に寄与すること、ならびにstomatin の膜含量がHK/LK 遺伝子型の指標となることを明らかにした。加えて、これらの知見は、HK/LK 赤血球表現型を生じる本質的要因がTfR を発現するよりも前の前駆細胞の段階にあることを示唆するものである。 / Hokkaido University （北海道大学） / 博士 / 獣医学