La Microscopie à Force Atomique (AFM) rapide et ses applications potentielles en nano-biotechnologie nécessite l’augmentation de la fréquence de résonance des sondes, constituées de levier résonant à quelques mégahertz. De plus, lors du passage en liquide, la fréquence de résonance ainsi que le facteur de qualité sont dégradés tandis que le système optique de mesure gagne en complexité. Les travaux présentés dans ce manuscrit proposent de remplacer le levier standard de l’AFM par un microsystème résonant à haute fréquence, présentant un facteur de qualité élevé et dont l’actionnement comme la détection seront intégrés. Après un état de l’art de l’AFM et de l’apport potentiel des microsystèmes pour la discipline, les détails de la conception d’une sonde basée sur un anneau en silicium vibrant suivant un mode elliptique munie d’une pointe sont présentés. Le procédé technologique 3D de fabrication collective sur substrats des sondes est détaillé. La pointe, dont l’apex présente un rayon de courbure nanométrique, est fabriquée par gravure chimique. L’actionnement électrostatique et la détection capacitive mettent en jeu un entrefer de 80nm auto-aligné. Un ensemble de caractérisations électriques et optiques permettent de mesurer et de calibrer les sondes avant leur montage sur un scanner AFM commercial. L’imagerie sur des échantillons biologiques, des origamis d’ADN, à l’aide d’une sonde fonctionnant à 11MHz et présentant un facteur de qualité à l’air de 1300 conclue ce manuscrit. La résolution en force obtenue est de 5pN.Hz-1/2. / High speed Atomic Force Microscopy (AFM) and its potential applications in nanobiotechnology need to increase the resonance frequency of the probes limited in the case of the usual cantilever to a few megahertz. The first chapter describes the state of the art of the AFM and focus on the potential of MEMS in this area. The second chapter treats of the conception of a sensor taking advantage of the high resonance frequency of a silicon bulk mode resonator integrating a nanotip fabricated in batch process. We describe in the next chapter the realization of MEMS-based AFM Nanoprobes with integrated in-plane nanotip and 80nm self-aligned capacitive transduction gaps. The probes are fabricated using a photolithographic process and deep reactive ion etching. Small gaps being critical to maximize the capacitive transduction, the self-aligned 80nm capacitive gaps are obtained by thermal oxidation of the resonator side walls and polysilicon refilling. A chemical wet etching defines the in-plane nanotip thanks to the selectivity between the silicon planes. The radius of the tip apex obtained is about 10-20nm.One probe, working at 11MHz and showing a Q factor of 1300 is optically and electrically fully characterized. The probe holder of a Multimode Veeco microscope is replaced by a dedicated circuit board supporting the MEMS probe. The sample is constituted by DNA origami which is bimolecular self-assembled structure programmed to form various geometric shapes. In this case, 50nm side and 2nm height squares of DNA deposited on mica surface are used. For this probe, the minimal detectable force is estimated at 5pN.Hz-1/2.

Ce travail de recherche porte sur le développement d’une plateforme microfluidique de type laboratoire sur puce pour la mesure du pouvoir infectieux d’agents pathogènes présents dans l’eau. La principale fonction étudiée dans ce manuscrit est la concentration de parasites en suspension dans un liquide. La manipulation des microparticules est basée sur l’emploi de forces électrocinétiques. Une analyse numérique en deux et trois dimensions apporte des informations qualitatives. Elle permet également d’extraire les valeurs géométriques clés des électrodes employées pour la concentration des microparticules. Ces premiers résultats théoriques sont confirmés expérimentalement à l’aide de deux dispositifs contenant une grande variété de concentrateurs. A partir des éléments théoriques et expérimentaux, nous concevons un concentrateur optimisé. Il est intégré dans un dispositif employant la technique de déplacement de goutte par électromouillage sur diélectrique (EWOD). Ce système est employé selon trois modes : concentrateur, extracteur et séparateur. Des oocystes de Cryptosporidium et des kystes de Giardia lambia sont utilisés pour la caractérisation du dispositif. Enfin, des résultats préliminaires de cultures cellulaires sur des surfaces fonctionnalisées à l’échelle de la centaine de micromètres permettent d’envisager le développement d’une plateforme microfluidique complète d’analyse du pouvoir infectieux d’agents pathogènes du genre Cryptosporidium. / This work focuses on the development of a microfluidic platform (lab on a chip) for the measurement of pathogens infectivity power in water. The main function studied in this manuscript is the concentration of parasites suspended in a liquid. The manipulation of microparticles is based on the use of electrokinetic forces. Numerical analysis in two and three dimensions provides qualitative information. It can also extract the geometric key values of electrodes used for the concentration of the microparticles. These theoretical results are confirmed experimentally using two devices containing a wide variety of concentrators. From the theoretical and experimental results, we design an optimized concentrator. It is integrated in a system allowing droplet motion by electrowetting on dielectric (EWOD). This system is used in three modes: concentrator, extractor and separator. Cryptosporidium oocysts and Giardia lamblia cysts are used for the characterization of the device. Preliminary results of cell culture on surfaces functionalized at scale of hundreds of microns allow to consider the development of a complete microfluidic platform for infectivity analysis of pathogenic agent such as Cryptosporidium.

Recent diversification of the telecommunications industry has resulted in the adaptation of optical materials and their associated fabrication technologies for use in the bioanalytical sensor industry. Flame hydrolysis deposited (FHD) planar silica is one such material. Capable of producing high quality films for optical waveguides, the chemical inertness of the deposited silica makes it an ideal substrate from which to fabricate a biological fluorescence sensor. The aim of the work contained in this thesis was to utilise the FHD silica in optical - fluorescence sensors suitable for use at visible and in particular red wavelengths where several fluorophores can be excited, and background fluorescence from the silica is small. New technologies for producing waveguides have been evaluated in the context of their usefulness in optical sensors, with the intention of producing devices with as few fabrication steps as possible to reduce fabrication time and cost. The design, fabrication and testing of a number of sensor configurations is described, in which optical waveguides were interfaced with microfluidic chambers to provide excitation of a fiuorophore in solution. New waveguide fabrication technologies were used for the first time in sensor systems with integrated microfluidic circuits. Waveguides, written by electron beam densification were evaluated in terms of their performance in splitting an excitation signal into several different components, as would be appropriate for excitation of multiple microfluidic chambers - an 'array sensor'. Both Y-branch waveguides and multimode interference (MMI) splitters were successfully used to split the excitation signal. In addition to electron beam densification, UV irradiation at a wavelength of 157 nm was used to write waveguides in FHD silica. The application of a metal surface mask to define the waveguide structures is described. To allow sensitive detection and identification of fluorophores from FHD silica sensor chips, a single chamber device was successfully interfaced to a system to make time resolved fluorescence measurements, a technique known as time correlated single photon counting (TCSPC). The use of TCSPC allowed measurement of the decay time of the fluorescent dye, by which different fluorescent molecules could be identified, as well as the possibility of low concentration measurements. The research has allowed new technologies for creating waveguides in FHD silica to be adapted for sensing purposes, leading to a platform for creating devices in a number of different configurations.

Ce travail présente la conception, la fabrication et le test d’une unité de préparation d’échantillons utilisant une approche originale combinant les microfluidiques digitale et continue. L'avantage du préconditionnement ‘numérique’ est d’éviter l’introduction d'un réseau complexe de micro-vannes pour manipuler les échantillons, tandis que le format ‘continu’ en entrée et sortie de l’unité permet de coupler facilement ce dispositif avec des composants microfluidiques situés en amont et en aval. Nous avons travaillé sur deux procédés de fabrication. Le premier comprend un tricouche PSP (Pyrex-Silicium-Pyrex) pour lequel les interfaces liquide-solide sont de nature hydrophobe. Un procédé original de collage thermoplastique a été optimisé qui est suffisamment générique pour être utilisé dans d’autres procédés MEMS. Cependant, les résultats des caractérisations ont montré que bon nombre des échantillons ne pouvaient pas être manipulés. Pour résoudre ce problème, nous avons développé un procédé bicouche PS (Pyrex-silicium) où les interfaces liquide-solide sont de nature superhydrophobe suite à une nanotexturation du silicium par traitement chimique. Grâce à la faible hystérésis, la résistance de friction et la pollution biologique sont largement réduites ce qui permet la manipulation de liquides complexes. Cette technologie a été employée pour fabriquer une unité microfluidique dédiée à de la préparation d’échantillons issus de bioprocédés à base de levures. Ces échantillons préparés sont ensuite analysés soit par une méthode immuno-enzymatique (ELISA) soit par une analyse par spectrométrie de masse précédée par une étape de séparation par électrophorèse capillaire. / This work presents the concept, fabrication technology and characterization of a sample preparation unit using an original approach coupling channel-based continuous and electrowetting-on-dielectric (EWOD)-based digital microfluidics. The major advantage of ‘digital’ is the accurate control of multiple reagents without the need of a complex network of microvalves, while unprocessed and reprocessed ‘continuous’ format is ideal for coupling with upstream and downstream microfluidic devices. We have developed two generations. In our first work, a three layers PSP (Pyrex-Silicon-Pyrex) configuration with hydrophobic liquid-solid interfaces was employed. An original adhesive wafer bonding technique has been optimized that is sufficiently generic to be used in diverse MEMS processes. However, the preliminary characterization results have shown that most real samples used in bioprocessing could not be handled by this first prototype. To address this issue, we have developed a bilayer PS (Pyrex-Silicon) configuration with superhydrophobic liquid-solid interfaces made by chemical nanotexturation of silicon. Thanks to the low contact angle hysteresis of this superhydrophobic surface, the friction resistance and bio-adsorption on the surface were largely reduced allowing transport of real complex liquids. Finally, this prototype has been successfully used for preconditioning samples taken from a yeast bio-reactor and then delivered to analytical modules either an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or a capillary electrophoresis (CE) device coupled with a mass spectrometry (MS).

Le Cryptosporidium est la principale cause d’épidémies d’origine hydrique provoquées par des protozoaires parasites dans le monde. Dans cette thèse, nous montrons qu’il est possible d’utiliser la spectroscopie d’impédance électrique pour obtenir in vitro des informations sur le cycle de vie du Cryptosporidium infectant des cultures cellulaires et pour quantifier l’infectivité d’un inoculum. Des cellules HCT-8 (adénocarcinome humain) ont été cultivées dans des puits contenant un réseau d’électrodes interdigitées planaires jusqu’à confluence pendant 76 heures, puis infectées par le Cryptosporidium parvum pendant 60 heures. La réponse impédimétrique a été mesurée entre 100Hz et 1MHz avec une période d’échantillonnage de 7min. Au cours de l’infection, le signal d’impédance présente une série de pics distincts et reproductibles à 12, 23 et 31h post infection (PI) et de minima à 9, 19 et 28h PI. Une modélisation électrique par circuit équivalent révèle que ces variations peuvent être en partie expliquées par l’effet des interactions hôte-parasite sur les zones intercellulaires. En outre, nos données présentent pour la première fois un suivi en temps réel du développement précoce et homogène du parasite, où les phases de prédominance de formes invasives (i.e. zoïtes) et prolifératives (i.e. mérontes) s’alternent et sont respectivement observées aux pics et minima du signal impédimétrique. Finalement, en quantifiant l’amplitude de la réponse en impédance, nous montrons que ce dispositif peut également être utilisé comme un capteur d’infectivité, dont la réponse dès 12h PI s’avère au moins 4 fois plus rapide que d’autres techniques à l’état de l’art. / Cryptosporidium is the main origin of worldwide waterborne epidemic outbreaks caused by protozoan parasites. In this thesis, we show that an in vitro electrical impedance-based device is able to get insights on Cryptosporidium life cycle on a cell culture and to quantify sample infectivity. HCT-8 cells (human adenocarcinoma) were grown to confluency on interdigitated microelectrode arrays during 76 hours and then infected by Cryptosporidium parvum during 60 hours. The impedimetric response was measured at frequencies ranging from 100Hz to 1MHz and a 7min sampling period. As the infection progresses, the impedance signal shows a reproducible distinct succession of peaks at 12, 23 and 31h post infection (PI), and minima at 9, 19 and 28h PI. An electrical equivalent circuit modeling-based approach indicates that these features can be partly explained by the effects of host-parasite interactions on intercellular areas. Furthermore, our data present for the first time a real-time monitoring of early homogeneous parasitic stage development with alternating invasive (i.e. zoites) and proliferative (i.e. meronts) form predominances, observed respectively at peaks and minima in the impedimetric signal. Finally, by quantifying the magnitude of the impedimetric response, we demonstrate this device can also be used as an infectivity sensor as early as 12h PI, thus being at least 4 times faster than other state of the art techniques.

Ce travail de doctorat a permis de développer un biocapteur dédié à l’analyse de l'activité hydrolytique d'une enzyme sur un composant de la paroi végétale, l'arabinoxylane, dans un contexte où le nombre d'enzymes à tester augmente.Ce biocapteur permet non seulement de détecter une enzyme active mais également de classer son activité hydrolytique au sein d’un ensemble d’enzyme. L’identification est réalisée simplement à l'œil nu mais le classement nécessite une observation instrumentée. Des techniques de micro-fabrication sont utilisées pour dispenser de manière précise l’arabinoxylane sur un support. La composition de la solution à base d'arabinoxylane a été optimisée afin d’assurer sa stabilité ainsi que l’uniformité de l’épaisseur du dépôt solide. L’influence de la mouillabilité du support est également étudiée. Notre suivi permet de détecter l’hydrolyse enzymatique et de quantifier le taux d’hydrolyse. La fonctionnalité du biocapteur est validée avec une xylanase commerciale par comparaison avec une technique standard en enzymologie utilisant un substrat colorimétrique. Ce nouvel outil a également été évalué sur des enzymes issues de clonage métagénomique. Son seuil de sensibilité est de 3 nkat/ml, comparable aux autres techniques mais permet de diviser par deux le temps d’analyse. / This thesis focused on the development of a biosensor able to detect the hydrolysis capabilities of enzymes. In a context in which an increasing number of enzymes must be tested for their ability to decompose biomass, we choose to use arabinoxylan as our sensor's active layer as it is a major component of plant cell walls. This biosensor doesn’t only make it possible to detect an enzymatic activity but also to rank several enzymes according to their respective activities. While the precise ranking of enzymes requires an instrument, detecting a hydrolytic activity can be done without it. We rely on microfabrication techniques to precisely deposit arabinoxylan on a solid support. We have developed an arabinoxylan based and tuned its composition to maximize its stability and ensure deposits’ homogeneity. The influence of the wetting properties of the support itself was also thoroughly investigated. We are able to quantify the progressive degradation of the arabinoxylan deposits and thus extract the hydrolysis rate. We have benchmarked our approach with the standard techniques (colorimetry) used in enzymology on a commercial Xylanase. Our approach was further evaluated in a metagenomic enzyme screening context. We have demonstrated that while twice faster than the existing techniques, we maintain a limit of detection at the state of the art (3nkat/mL).

Les organismes vivants prennent des décisions en permanence à l’aide de réseau de réactions chimiques couplées (CRN) les unes aux autres. Cette capacité a inspirée de nombreux scientifiques qui cherchent aujourd’hui à construire des versions synthétiques de ces réseaux pour créer des systèmes dynamiques complexes. Les molécules d’ADN constituent une solution idéale pour construire de tels CRNs. Le travail de recherche présenté dans ce manuscrit vise à développer des surfaces actives qui permettent d’interagir avec la PEN toolbox en environnement microfluidique afin de pouvoir utiliser pleinement le potentiel de tels systèmes moléculaires. Nous avons étudié l’utilisation de la PEN toolbox en microfluidique en explorant différents paramètres. Nous discuterons ensuite de la réalisation de surfaces actives et de leur caractérisation. Celles-ci sont concues pour permettre l’immobilisation de brins d’ADN via une liaison thiol et leur largage en solution en rompant électro-chimiquement cette liaison. Nous discuterons également d’aspect technique permettant l’intégration aisée d’une telle stratégie dans des dispositifs microfluidiques. Par la suite, nous montrerons qu’il est possible de contrôler spatio-temporellement le largage d’instructions à base d’ADN. Pour ce faire, nous nous appuierons sur une version plus évoluée de l’auto-catalyseur présenté précédemment. Nous mettrons en évidence qu’il est possible d’initier de façon contrôlée des phénomènes de réaction-diffusion dans des canaux microfluidiques.Pour finir, nous ouvrirons des perspectives pour la conception de surface actives permettant un niveau de contrôle encore plus grand des systèmes moléculaires. / Living organisms perform complex information processing tasks with a help of intertwined chemical reaction networks (CRNs) and diffusion processes. These biological phenomena inspired scientists to design from the bottom-up dynamical systems with complex spatiotemporal behaviour. DNA provides a perfect solution for building these synthetic CRNs. Our research work focused on designing active surfaces with the aim to provide a convenient way to interact in microfluidics with the PEN toolbox (as an example of DNA-based CRNs) and explore the full potential of these novel biochemistry tools. We will study the step by step assembly and optimisation of the PEN toolbox parameters. Next, we will discuss the construction and characterisation of active surfaces, which provide loading and controllable release of DNA input, based on formation and electrochemical cleavage of gold-thiol bond. We will also provide a technological solution to integrate these surfaces and the PEN toolbox in microfluidics. We will show controllable triggering of basic activation and autocatalysis PEN toolbox modules. We will further apply our method for spatiotemporal control of autocatalytic CRNs, which have higher stability then simple autocatalytic module while still providing an exponential signal amplification contrary to the activation module. This approach allows us to investigate and optimise the parameters of our technology. Finally, we will discuss the construction of active surfaces with irreversibly bound DNA, which provides a higher level of the PEN toolbox spatiotemporal behaviour, based on electrical polarisation and tuning the shape of surface-attached DNA patterns.

Ce travail de recherche est centré sur l’électromouillage sur diélectrique (EWOD) et l’emploi de surfaces superhydrophobes dans une optique d’intégration dans un système microfluidique en gouttes. Dans un premier temps, nous détaillons la réalisation de surfaces présentant différentes échelles de rugosités : micro-, nano- et micro/nanotexturées. Leur robustesse à l'imprégnation d'un liquide soumis à pression extérieure est étudiée. Deux techniques sont mises en œuvre, l’impact de goutte et l’EWOD. Les surfaces à double échelle de rugosité montrent une meilleure robustesse (>13kPa). Cependant, une surface de nanofils de silicium présente des seuils d’empalement à l’état de l’art (>17kPa) et une réversibilité complète sous EWOD. Dans un second temps nous caractérisons le déplacement de gouttes par EWOD au sein d’un système microfluidique et mettons en évidence l’influence des surfaces superhydrophobes (par rapport à des surfaces hydrophobes). Nous obtenons pour une tension donnée, des vitesses de déplacement supérieures (+30%), pour une vitesse donnée, une tension d’actuation réduite (-30%), ainsi que des contraintes de cisaillements proche paroi plus importantes. Enfin, ces propriétés sont mises en avant à travers deux applications que sont la collecte de bio-particules et l’analyse par spectrométrie de masse de biomolécules présentes en solution. Dans le premier cas, une efficacité de collecte proche de 100% est obtenue que ce soit pour des virus ou des spores. Dans le second cas, nous avons pu analyser des concentrations de peptides jusque 10fmol dans des zones localisées ainsi qu’un très faible niveau de pollution en dehors de ces zones. / This work deals with electrowetting on dielectric (EWOD) technique and integration of superhydrophobic surfaces in a droplet-based microfluidic device. The first part of the thesis consists on the preparation of micro-, nano- and micro-nano-structured surfaces, and a detailed study of their robustness to impalement under electrowetting and drop impact. Hierarchical surperhydrophobic surfaces showed the best robustness to impalement. However, a silicon nanowires surface has shown an impalement threshold still in the state of art with a total reversible behavior under EWOD. In a second approach, we characterized droplet displacement using electrowetting in a microfluidic system and evidenced the influence of superhydrophobic surfaces compared to hydrophobic ones. For a given actuation voltage, the droplet motion is increased by +30% and for a given droplet motion, the actuation voltage is reduced by -30%. Moreover, wall shear stresses are more important. Finally, these properties are featured through two main applications: particles collection and bio-molecules analysis by matrix-free laser desorption/ionization mass spectrometry. For particles collection, a cleaning efficiency close to 100% either for virus or bacteria particles was reached using superhydrophobic surfaces. For lab-on-chip application, a detection limit of 10 fmol was obtained for peptides analysis using mass spectrometry.

Le graphène et ses dérivées ont suscité un grand intérêt au fil des années en raison de leurs propriétés physiques et chimiques exceptionnelles. Pour l'intégration du graphène dans des dispositifs électrochimiques, il est essentiel d'avoir une technique simple, reproductible et contrôlable afin de produire des feuillets de graphène de bonne qualité sur des grandes surfaces. Dans cette optique, l'utilisation d'oxyde de graphène réduit chimiquement (rGO) plutôt que le graphène produit par la technique CVD représente une alternative très prometteuse. Dans cette thèse, nous avons développé différentes approches simples, respectueuses de l'environnement, et contrôlables pour la réduction chimique de l'oxyde de graphène en rGO ainsi que la fonctionnalisation simultanée de la matrice de rGO formée par les agents de réduction utilisés. Les divers agents réducteurs utilisés sont : la tyrosine, l'acide 4-aminophénylboronique (APBA), la dopamine portant une fonction alcyne, et nanoparticules de diamant (ND). Les matrices de rGO ainsi préparées ont été caractérisées par différentes méthodes telles que : XPS, AFM, MEB, FTIR, Raman, UV/Vis et mesures électrochimiques. Les matrices de rGO, déposées sur des électrodes de carbone vitreux (GC), ont ensuite été utilisées pour des applications électrochimiques pour la détection du peroxyde d'hydrogène (en absence d’enzyme), du glucose, et de la L-dopa et carbidopa simultanément. Finalement, les nanocomposites de rGO/NDs ont été utilisés avec succès comme électrodes dans des supercondensateurs, et ont montré une capacité spécifique de 186 F g-1 et une excellente stabilité. / Graphene and its derivatives have attracted tremendous research interest over the years due to their exceptional physical and chemical properties. For the integration of graphene into electrochemical devices, it is essential to have a simple, reproducible and controllable technique to produce high quality graphene sheets on large surfaces. In this respect, the use of chemically derived reduced graphene oxide (rGO) rather than CVD graphene is a promising approach. In this thesis, we have developed simple, environmentally friendly, and controllable approaches for the chemical reduction of graphene oxide to rGO and the simultaneous functionalization of the resulting rGO matrix with the used reducing agents. These techniques are based on the use of tyrosine, 4-aminophenyl boronic acid (APBA), alkynyl-modified dopamine, and diamond nanoparticles (ND) as reducing agents. The robustness of the developed derivatization schemes was evaluated by the post-functionalization of alkynyl-dopamine/rGO with thiolated molecules via a photochemical “click” reaction.The resulting rGO matrices were characterized by a variety of different techniques, including XPS, AFM, SEM, FTIR, Raman, UV/Vis, and electrochemical measurements. The rGO matrices, deposited on glassy carbon (GC) electrodes, have been further used for electrochemical based applications for nonenzymatic detection of hydrogen peroxide, glucose, and simultaneously L-dopa and carbidopa. Furthermore, rGO/NDs nanocomposites have been successfully used as electrode in supercapacitors and exhibited a specific capacitance of 186 F g-1 and excellent long term stability.

L’augmentation des infections causées par des pathogènes résistants aux médicaments est devenue un problème de santé majeur dans le monde entier qui impose le développement de nouvelles stratégies destinées à empêcher la formation de biofilms et à éliminer les bactéries. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été la préparation de nanostructures complexes pour contrôler l’adhérence des cellules à des surfaces et inactiver les bactéries pathogènes. Ainsi, nous proposons différentes approches qui consistent en l’utilisation de : i) une couche micro-structurée de polystyrène polymérisé à l’aide d’un plasma (pPS), ii) la thérapie photodynamique à base de nanoparticules hybrides activées par un rayon laser dans le proche infrarouge (NIR) et iii) des nanoparticules de carbone fonctionnalisées par l’ampicilline, comme solutions possibles pour éliminer les bactéries. / The increase of infections by multi-drug resistant pathogens has become an important worldwide healthcare issue that requires the development of new strategies to prevent biofilm formation and to kill bacteria. In this context, the aim of this thesis was the design of complex nano-structures to control cells adhesion to surfaces and to inactivate pathogenic bacteria. To this end, we propose different strategies relying on the use of i) micro-structured plasma polymerized styrene (pPS) films, ii) particle-based photodynamic therapy combined with a pulsed laser in the near infrared (NIR) region and iii) ampicillin-functionalized, fluorescent carbon dots (CDs) as possible solutions for bacterial killing. Firstly, we performed a detail characterization of pPS films used as substrates to study the behavior of biological systems.