Thesis (Ph. D.)--University of Texas at Austin, 2007. / Vita. Includes bibliographical references.

Thesis (M.Sc.)--York University, 2005. Graduate Programme in Biology. / Typescript. Includes bibliographical references. Also available on the Internet. MODE OF ACCESS via web browser by entering the following URL: http://gateway.proquest.com/openurl?url%5Fver=Z39.88-2004&res%5Fdat=xri:pqdiss &rft_val_fmt=info:ofi/fmt:kev:mtx:dissertation&rft_dat=xri:pqdiss:MR11935

Undergraduate honors paper--Mount Holyoke College, 2007. Program in Biochemistry. / Includes bibliographical references (leaves 107-108).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2006. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 149-172).

Thesis (Ph. D.)--Case Western Reserve University, 2007. / [School of Medicine] Department of Pharmacology. Includes bibliographical references. Available online via OhioLINK's ETD Center.

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Orientador: Maria Inês de Moura Campos Pardini / Resumo: Este trabalho visou a comparação de 5 diferentes métodos de extração de DNA, a partir de amostras de materiais de arquivo (tecido incluído em parafina, lâmina de hemograma corada e não corada com Leishman, lâmina de mielograma, gotas de sangue em Guthrie card) e fontes escassas (células bucais, 1 e 3 bulbos capilares, 2 mL de urina), para avaliar a facilidade de aplicação dos mesmos e possibilidade de amplificação desse DNA pela técnica de PCR. Os métodos incluíram digestão por proteinase K, seguida e não seguida por purificação com fenol/clorofórmio, utilização de Chelex 100 Ò, utilização de InstaGeneÒ e fervura em água estéril. O DNA obtido, foi testado por PCR, para a amplificação de três fragmentos gênicos: de Brainderived neutrophic factor (764 pb), de Fator V Leiden (220 pb) e de Abelson (106 pb), sendo que, a amplificação para o primeiro, eliminava a necessidade dos demais. Conforme o tamanho do fragmento gênico estudado, a fonte potencial de DNA e o método de extração utilizado, os resultados caracterizaram o melhor caminho para padronização dos procedimentos técnicos a serem incluídos e apresentados no manual de Procedimentos Operacionais Padrão do Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro - HC - UNESP - Botucatu. / Abstract: The present work aimed to compare five different methods of DNA extraction of archieved materials samples (paraffin-embedded tissues, periferic blood smear - stained or non-stained with Leshman, aspired bone marrow smears and blood guts in Guthrie card) and rare sources (oral cells, 1 and 3 capilar bulbs, 2 mL urine), to avaliate the aplication facility and the amplification possibility one for PCR. The methods included proteinase K digestion - followed or non by phenol/chloroform purification, Chelex 100Ò (BioRad), InstaGeneÒ (BioRad) and boilling in sterile water. The DNA obteined, was tested for amplification of 3 genic fragments: from Brainderived neutrophic factor gene (764 bp), Factor V Leiden gene (220 bp) and Abelson gene (106 bp). According to the genic fragment lenght studed, the DNA potential source and the extraction method used, the results characterized better guidelines for padronization of the techniques procedures for to Good Manufacturing Practices from Molecular Biology Laboratory from Blood Center - Medicine School - UNESP - Botucatu . / Mestre

O carrapato Boophilus microplus é um dos mais importantes ectoparasitas dos rebanhos bovinos, estando em todas as áreas tropicais e subtropicais entre o paralelo 32 °N e 32 °S, abrangendo regiões que se dedicam à pecuária na América, África, Ásia e Oceania. O controle do carrapato B. microplus é realizado principalmente com o uso de acaricidas, entretanto devido a crescente preocupação com os problemas criados pela poluição química do ambiente, ao alto custo e toxicidade das drogas e ao aparecimento de carrapatos resistentes aos acaricidas, alternativas para o controle do B. microplus devem ser encontradas. A sobrevivência dos carrapatos depende grandemente da sua capacidade de evadir o sistema imunológico dos hospedeiros, portanto antígenos da glândula salivar poderiam ser alvos para intervenção imunoprofilática. Neste trabalho foram isolados cDNAs não previamente descritos correspondentes a antígenos presentes na glândula salivar. cDNAs que codificam para proteínas similares a paramiosina e calreticulina foram seqüenciados, expressos em Escherichia coli e as proteínas recombinantes purificadas, tendo sido produzidos soros policlonais contra as proteínas recombinantes em coelhos. As seqüências foram caracterizadas e alinhamentos múltiplos com outras seqüências foram determinados. O gene da calreticulina mostrou ser expresso em todos os estágios e tecidos testados, tanto em experimentos de RT-PCR quanto de Western blot, tendo sido demonstrado também a sua secreção pela saliva. Análise filogenética indica o agrupamento do gene de B. microplus com seqüências de outros artrópodos. Soros de bovinos infestados não reconhecem a calreticulina recombinante, apesar dela ser reconhecida pelo soro de cães infestados pelo carrapato Rhippicephalus sanguineus. A paramiosina mostrou-se, em ensaios de Western blot, também estar presente em todos os estágios testados, porém não na saliva. A paramiosina recombinante foi capaz de ligar colágeno e IgGs. Ambas as proteínas correspondem a proteínas multi-funcionais possivelmente envolvidas na imunomodulação do hospedeiro, tendo sido sugeridas como imunógenos protetores contra outros parasitas.

O carrapato Boophilus microplus é um dos mais importantes ectoparasitas dos rebanhos bovinos, estando em todas as áreas tropicais e subtropicais entre o paralelo 32 °N e 32 °S, abrangendo regiões que se dedicam à pecuária na América, África, Ásia e Oceania. O controle do carrapato B. microplus é realizado principalmente com o uso de acaricidas, entretanto devido a crescente preocupação com os problemas criados pela poluição química do ambiente, ao alto custo e toxicidade das drogas e ao aparecimento de carrapatos resistentes aos acaricidas, alternativas para o controle do B. microplus devem ser encontradas. A sobrevivência dos carrapatos depende grandemente da sua capacidade de evadir o sistema imunológico dos hospedeiros, portanto antígenos da glândula salivar poderiam ser alvos para intervenção imunoprofilática. Neste trabalho foram isolados cDNAs não previamente descritos correspondentes a antígenos presentes na glândula salivar. cDNAs que codificam para proteínas similares a paramiosina e calreticulina foram seqüenciados, expressos em Escherichia coli e as proteínas recombinantes purificadas, tendo sido produzidos soros policlonais contra as proteínas recombinantes em coelhos. As seqüências foram caracterizadas e alinhamentos múltiplos com outras seqüências foram determinados. O gene da calreticulina mostrou ser expresso em todos os estágios e tecidos testados, tanto em experimentos de RT-PCR quanto de Western blot, tendo sido demonstrado também a sua secreção pela saliva. Análise filogenética indica o agrupamento do gene de B. microplus com seqüências de outros artrópodos. Soros de bovinos infestados não reconhecem a calreticulina recombinante, apesar dela ser reconhecida pelo soro de cães infestados pelo carrapato Rhippicephalus sanguineus. A paramiosina mostrou-se, em ensaios de Western blot, também estar presente em todos os estágios testados, porém não na saliva. A paramiosina recombinante foi capaz de ligar colágeno e IgGs. Ambas as proteínas correspondem a proteínas multi-funcionais possivelmente envolvidas na imunomodulação do hospedeiro, tendo sido sugeridas como imunógenos protetores contra outros parasitas.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-24 / Tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina permitem investigações retrospectivas valiosas para estudos moleculares, especialmente em estudos genéticos, nos casos em que o DNA não se encontra disponível em amostras congeladas e/ou frescas. Entretanto, de acordo com alguns autores, é difícil obter um DNA de boa qualidade, uma vez que o processo de fixação resulta na fragmentação dos ácidos nucleicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o DNA extraído de tecidos parafinados, após 1 e 5 anos de armazenamento, através de 3 métodos de extração. Para isso, foram utilizados o gene da β-actina (136pb), a fim de detectar a viabilidade e fragmentação do DNA extraído, e da amelogenina (X: 212pb e Y: 218pb) para diferenciação do sexo do indivíduo e viabilidade na utilização de primers com comprimento maior. O estudo envolveu 12 casos de autópsia recentes, onde amostras normais de fígado (n=10), baço (n=10) e cérebro (n=10) foram coletadas em duplicata, de modo que um grupo seguiu para o processo de fixação e inclusão em parafina, e outro grupo seguiu para o congelamento. Além disso, foram utilizados os mesmos tipos de tecidos, normais (n=10 cada), oriundos de 13 casos de autópsia armazenados por 1 ano e 15 casos armazenados por 5 anos. Após a remoção da parafina, as amostras foram submetidas às extrações com kit comercial (QIAGEN QIAamp Mini), Salting-Out e fenol-clorofórmio. O DNA extraído foi quantificado no aparelho Nanodrop® e ajustado para PCR (10ng/μl). Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose a 1%. As amostras de baço e fígado apresentaram maior rendimento em relação à extração de DNA quando comparado ao cérebro, em todos os tempos. Todas as amostras arquivadas apresentaram boas condições de extração de DNA, porém deve-se levar em consideração o processo de fixação e inclusão dos tecidos, que podem comprometer a qualidade do DNA. A extração pelo fenol rendeu maior quantidade de DNA e grau de pureza em relação aos outros métodos estudados, porém o kit comercial mostrou melhores resultados quanto à amplificação do DNA obtido. Houve amplificação do gene da amelogenina em todas as amostras utilizadas, porém recomenda-se a utilização de primers menores para uma completa análise do fragmento a ser estudado. / Formalin fixed and paraffin embedded tissues provide valuable retrospective investigations for molecular studies, especially for genetic studies, when the DNA is not available in fresh and/or frozen samples. However, according to some authors, is difficult to obtain a DNA of good quality, since the fixation process results in nucleic acids fragmentation. The aim of this study was to evaluate the DNA extracted from paraffin embedded tissues, after 1 and 5 years of storage, by 3 methods of extraction. For this, the gene of β-actin (136pb) were used, to detect the viability and DNA fragmentation, and the gene of amelogenin (X: 212pb e Y: 218pb) for sexual differentiation and viability in primers with greater length. The study involved 12 recent autopsy cases, where samples of liver (n=10), spleen (n=10) and brain (n=10) were collected in duplicate, which one group followed to the process of fixation and inclusion and the other group followed to freezing. Moreover, the same kind of tissues, normal (n=10 each), from 13 autopsy cases archived for 1 year and 15 cases archived for 5 years were used. After paraffin remove, the samples were submitted to DNA extraction with commercial kit (QIAGEN QIAamp Mini), Salting-Out and phenol-chlorophorm. The DNA extracted was quantified in Nanodrop® and adjusted for PCR (10ng/μl). The PCR products were visualized in agarose gel 1%. The samples of spleen and liver showed more yield in DNA extraction than the brain samples, in all the times. All the samples archived showed good extraction conditions, however should take in consideration the fixation and embedded process, which could compromise the DNA quality. The extraction by phenol-chloroform yielded more DNA quantity and purity than the other methods. However, the commercial kit extraction showed better results in DNA amplification. The primer of the gene of amelogenin was amplified in all utilized samples, however recommends the utilization of smaller primers for a complete analyze of the fragment studied. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações