Les mégacaryocytes (MK) sont des cellules géantes de la moelle osseuse, précurseurs des plaquettes sanguines. Leur différenciation se caractérise par un accroissement de la quantité de protéines et de membranes pour permettre l'élongation de prolongements cytoplasmiques, les proplaquettes (PPT), qui vont traverser l'endothélium médullaire pour libérer les plaquettes dans le sang. Il est admis que la tubuline joue un rôle essentiel dans l'élongation des PPT. Par contre, le rôle du cytosquelette d'actine reste encore peu clair et controversé. Dans ce contexte, le but de ma thèse a été d'étudier le rôle de l'actine et de ses régulateurs, les GTPases de la famille Rho et les phosphoinositides, dans la formation des PPT. Dans une première partie, j'ai montré que le cytosquelette d'actine était le principal régulateur de la formation du système de membranes de démarcation (DMS) qui constitue le réservoir de membranes nécessaires à la formation des PPT. Par la combinatoire de modèles murins et humains, j'ai montré que la GTPase Cdc42 et ses effecteurs Pak étaient les acteurs principaux de cette régulation. Mes résultats posent clairement les bases du processus de maturation interne des MK. Ainsi, en réponse à la thrombopoïétine, cytokine clé de la mégacaryopoïèse, le MK possède la propriété intrinsèque de se polariser de façon indépendante des contacts avec la niche hématopoïétique, pour former les territoires du DMS au niveau du futur site d'émission des PPT, et des noyaux. L'imagerie confocale en 3D et en FRET a démontré que la GTPase Cdc42 active était associée aux endomembranes. Logiquement, son inhibition pharmacologique induit une désorganisation majeure du DMS, abolissant totalement la formation des PPT. Pak2 intervient dans ce phénomène en aval de Cdc42 et son inhibition affecte également la production plaquettaire. Ces résultats originaux permettent de mieux comprendre la mécanistique physiologique de maturation des MK pour aboutir à une production plaquettaire normale et mettent en lumière d'éventuelles cibles moléculaires des dysfonctionnements observés dans les thrombopénies. En complément de ce travail, nous avons mis en place une collaboration avec l'équipe du Dr B. Nieswandt (University Clinic of Würzburg, Allemagne) qui vise à comparer l'impact de la délétion spécifique dans la lignée mégacaryocytaire des GTPases Rac1, Cdc42 et RhoA, seules ou en combinaison dans les lignées murines KO. Mes résultats valident le rôle central de Cdc42 et mettent en avant une régulation croisée inattendue entre RhoA et cette dernière. Dans une deuxième partie, j'ai abordé le rôle du phosphatidylinositol 5-phosphate (PtdIns5P), dont l'équipe a montré qu'il activait les GTPases Rac1 et Cdc42, et était responsable de l'invasion lymphomateuse en formant des podosomes invasifs. Les contacts avec la matrice extracellulaire (MEC) sont importants pour la différenciation terminale des MK qui forment des podosomes différents selon le type de matrice (fibrinogène ou collagène). J'ai montré que les MK formaient des podosomes linéaires le long des fibres de collagène alors qu'ils sont punctiformes sur fibrinogène. De façon intéressante, on constate un changement de GTPase selon la matrice. Les podosomes formés sur collagène sont riches en Rac1, alors que sur fibrinogène ils portent Cdc42. Par ailleurs, le PtdIns5P est alors un élément central de la structure des podosomes invasifs sur gel comprenant du fibrinogène. Ainsi, lorsque la matrice est proche de celle de l'environnement vasculaire (fibrinogène), on a apparition d'un phénotype invasif mettant en jeu le PtdIns5P et Cdc42, laissant supposer que la signalisation attenante pourrait réguler les contacts et la traversée endothéliale. L'ensemble des résultats obtenus au cours de ce travail de thèse contribue à une meilleure compréhension de la maturation des mégacaryocytes et de leur relation avec l'environnement médullaire et vasculaire pour aboutir à la production de plaquettes fonctionnelles. / Megakaryocytes (MK) are giant cells located in the bone marrow that produce blood platelets. Their differentiation is characterized by an increase in proteins and membranes that leads to the elongation of cytoplasmic protrusions called proplatelets (PPTs). PPTs will cross the medullar endothelium to release platelets in the blood flow. Tubulin plays a major role in PPT elongation. However, the involvement of the actin cytoskeleton remains unclear and controversial. In this context, the purpose of my thesis was to study the role of actin and its regulators, namely the Rho GTPases and phosphoinositides, in PPTs formation. In a first part, I demonstrated that the F-actin was the main regulator of the formation of the demarcation membranes system (DMS), which represents a membrane reservoir for PPTs. Using complementary mouse and human models, I demonstrated that the Cdc42 GTPase and its effector Pak2 were key regulators of this process. My data set the bases of the internal maturation process. I demonstrated that MKs display the intrinsic property of polarizing in response to thrombopoietin, which is the main cytokine regulating megakaryopoiesis, independently of contacts with the hematopoietic niche. Polarization results in the formation of the DMS territory at the future PPTs emission site, facing the nuclei territory. 3D confocal and FRET imaging demonstrated that active Cdc42 was associated with endomembranes. Interestingly, Cdc42 pharmacological inhibition resulted in total DMS disorganization, which completely abolished PPTs formation. In this phenomenon, Pak2 acted downstream of Cdc42 and its inhibition also abrogated platelets production. These data shed new light on MK physiological maturation that ends in normal platelet production and points to new potential molecular targets that might be dysregulated in thrombocytopenia. We then set up a collaboration with Dr B. Nieswandt's group (University Clinic of Würzburg, Germany) to evaluate the impact of megakaryocytic specific knockout of the Rac1, Cdc42 and RhoA GTPases, alone or in combination, on murine MKs differentiation. My results with these models validate the central role of Cdc42 and demonstrated an unexpected cross-regulation between Cdc42 and RhoA. In a second part, I studied the role of the phosphatidylinositol 5-phosphate (PtdIns5P), which the team demonstrated to activate Rac1 and Cdc42, and identified as a central regulator of lymphoma invasion through elaboration of invasive podosomes. Contacts with the extracellular matrix (ECM) within the bone marrow are instrumental into MKs terminal differentiation. I demonstrated that MKs form linear podosomes along collagen fibers while they form regular dotted structures on fibrinogen. Interestingly, we observed a difference in podosome-associated GTPases according to the matrix. Podosomes formed on collagen were enriched in Rac1, while Cdc42 localized in podosomes when cells were cultivated on fibrinogen. In this case, PtdIns5P that was vesicular in MKs progenitors concentrated in the actin core of those invasive podosomes. Taken together, these data suggest that when the matrix is similar to the vascular environment (fibrinogen), concentration of PtdIns5P and Cdc42 in podosomes might lead to the emergence of the invasive phenotype seen in vitro on fibrinogen-containing gels. An interesting hypothesis regarding the in vivo outcome of this observation is that the PtdIns5P/Cdc42 pathway might be involved in the regulation of MKs contacts with endothelial cells to drive endothelium crossing. Overall, these data shed new lights on MKs maturation and its relationship with medullar and vascular environments that results in production of functional platelets.

Thèse doctorat : Aspects Moléculaires et Cellulaire de la Biologie : Strasbourg 1 : 2006. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 19 p.

Au sein des tissus, les cellules sont entourées par une matrice extracellulaire (MEC) dont les propriétés mécaniques influencent de nombreux aspects du comportement cellulaire, tels que la migration ou la différenciation. L’objectif de ce travail était d’explorer les effets de la rigidité de la MEC sur la mitose. En utilisant des hydrogels de polyacrylamide, nous avons observe que des cellules murines et humaines cultivées sur des matrices de rigidités croissantes se divisent plus rapidement. Grace a une analyse protéomique, nous avons mis en évidence que SUN2, une protéine de l’enveloppe nucleaire participe a la régulation de la progression mitotique en réponse a la rigidité de la MEC. Sur une matrice rigide, la stabilité et l’expression de SUN2 augmentent, favorisant ainsi le recrutement de l’actine au niveau cortical lors de la mitose et la progression de la métaphase. L’ensemble de ces résultats révèle l’existence d’un nouveau mécanisme régulant la division cellulaire en fonction de la rigidité de la MEC. Ce mécanisme pourrait notamment jouer un role important dans de nombreux contextes physiologiques et pathologiques associes a une rigidification de la MEC tels que le vieillissement ou l’hypertension artérielle. / Within tissues, cells are surrounded by an extracellular matrix (ECM), whose mechanical properties regulate many aspects of cell behavior, including motility and differentiation. Here we examined the effect of ECM rigidity on cell division. We found that cells divide more rapidly when cultured on substrates with increasing stiffness. We next compared the proteomic content of cells dividing on soft and stiff substrates and we found that ECM rigidity regulates the stability of the LINC complex component SUN2, whose level of expression affects mitotic progression. On rigid substrates, high level of SUN2 promotes cortical actin recruitment, force generation and mitotic progression, while low level of SUN2 delays the onset of anaphase when cells are grown on soft ECM. These results revealed a new mechanism that regulates mitotic progression in response to changes in ECM rigidity.

Thèse de doctorat : Mécanique. Biophysique-Biomécanique : Paris 12 : 2005. / Titre provenant de l'écran-titre. Pagination : 151 f. Bibliogr. f. 142-151.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2006. / Titre de l'écran-titre (visionné le 14 mai 2007). Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2006. / Titre de l'écran-titre (visionné le 28 mars 2007). Bibliogr.

Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1997. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Les changements dans la forme des cellules sont essentiels à de nombreux processus qui déterminent le destin de la cellule, notamment la division cellulaire. Ils sont orchestrés par le remodelage de structures mécanosensibles à base d’actine contrôlant la tension cellulaire. Les évidences récentes laissent croire que le contrôle de qualité des protéines pourrait contribuer à la régulation spatiotemporelle du remodelage des structures d’actine par des mécanismes de séquestration, de recyclage et de dégradation protéiques. Les chaperons moléculaires de la famille des HSPB apparaissent comme des modulateurs des structures à base d’actine en conditions physiologiques. Durant un stress protéotoxique, ces protéines séquestrent des composantes cellulaires endommagées afin de prévenir leur agrégation. Bien que leur implicationdans différentes pathologies soit démontrée, le mode d’action des HSPB demeure encore peu compris. Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse adressent l’hypothèse centrale que le complexe chaperon formé d’HSPB8 et de son co-chaperon BAG3 régule le remodelage des structures à base d’actine qui dirigent la division cellulaire. Nos travaux ont établi que lors de la mitose, BAG3, d’une manière dépendante de son association avec HSPB8, facilite l’arrondissement mitotique requis pour le positionnement du fuseau et la ségrégation adéquate des chromosomes. Nous montrons que la réduction des niveaux d’HSPB8 ou de BAG3 interfère également avec le désassemblage de l’anneau contractile d’actomyosine et l’abscission des cellules filles lors de la cytokinèse. Cet effet est corrélé avec une augmentation de la prévalence de cellules multi-nucléées, laquelle est restaurée à des niveaux contrôles par des drogues qui normalisent la dynamique de l’actine dans les cellules déplétées en HSPB8. Ceci établit un lien de cause à effet entre la dérégulation de la dynamique de l’actine et les défauts de division cellulaire observés dans ces cellules. De plus, l’inhibition du désassemblage de l’anneau d’actomyosine est corrigée par la rapamycine, une drogue qui active la dégradation par autophagie. Inversement, ce phénotype est reproduit par les cellules contrôles traitées avec des drogues qui réduisent le flux autophagique. Ces observations suggèrent que la régulation de la morphodynamique mitotique par HSPB8-BAG3 impliquerait sa fonction dans l’autophagie sélective. En outre, pendant la mitose et la cytokinèse, HSPB8-BAG3 limiterait la polymérisation de l’actine branchée. Notamment, HSPB8-BAG3 semble faciliter l’arrondissement mitotique et la dynamique d’un réseau sous-cortical d’actine qui dépend d’Arp2/3, en modulant la déacétylase HDAC6 et son substrat la cortactine, tous deux intervenants dans les processus d’autophagie sélective. L’ensemble de ces travaux contribue à une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels le complexe chaperon HSPB8-BAG3 facilite les transitions dans la forme des cellules qui contrôlent des fonctions essentielles, notamment la division cellulaire. Ils identifient de nouvelles cibles cellulaires du complexe chaperon impliquées dans le remodelage des structures à base d’actine, lesquelles pourraient contribuer au développement de pathologies associées avec une dérégulation du complexe, notamment à la progression tumorale. / Changes in cell shape are essential to key cellular processes that determine the cell fate, including cell division. They are orchestrated by the remodeling of mechanosensitive actin-based structures guiding cellular tension. Recent data suggest that protein quality control may contribute to the spatiotemporal remodeling of actin-based structures through protein sequestration, recycling and degradation mechanisms. Incidentally, the molecular chaperones of the HSPB family appearas modulatorof actin-based structures under physiological processes. These proteins are known to sequester damaged cellular constituents to prevent their toxic aggregation during proteotoxic stress. Whilst their implications in human pathologies have been clearly established, their mode of action is still poorly understood. The work presented in this thesis addresses the central hypothesis that the chaperone complex formed by HSPB8 and its co-chaperone BAG3 would facilitate the remodeling of actin-based structures, which is deemed instrumental for proper mitotic progression. We have shown that during mitosis, BAG3, in a manner requiring its association with HSPB8, facilitates mitotic rounding, spindle positioning and accurate chromosomes segregation. We further showed that depletion of HSPB8 or BAG3 silencing also interferes with disassembly of the contractile actomyosin ringduring cytokinesis, thereby impairing daughter cells abscission. Such an effect is correlated with accumulation of multinucleated cells, a defect which is corrected by drugs that normalize actin dynamics in HSPB8-depleted cells. These results established a cause-effect relationship between deregulation of actin dynamics and the cell division defects induced by HSPB8 silencing. Further, we found that such a phenotypecan be rescued by rapamycin, a drug that stimulates autophagy, while itis recapitulated in control cells by inhibitors of autophagic degradation. These results, and others presented in this thesis, suggest that the regulation of cell shape remodellingby HSPB8-BAG3 may involve their function in the selective targeting of proteins for autophagic degradation. Finally, evidence was obtained that during mitosis, like during cytokinesis, HSPB8-BAG3 would act by limiting branched actin polymerization. We found that HSPB8-BAG3 can modulate mitotic rounding and the dynamics of an Arp2/3-dependent subcortical actin pool that contributes to spindle positionning, by restrictingthe activity of HDAC6 deacetylase maybe on its target cortactin, both having a role in selective autophagy processes. Together, this work contributed to a better understanding of the mechanisms by which the chaperone complex HSPB8-BAG3 would facilitate transitions in cellshape during cell division and uncovered novel targets of HSPB8-BAG3 that may be implicated in the development of human disorders associated with deregulation of the chaperon complex, notably cancer.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Pendant le développement d’un embryon, le remodelage des tissus amène un changement de forme: les tissu peuvent s’allonger, s’envaginer, s’étirer etc. Différentes voies de signalisation règlent ces comportements dans le temps et l’espace à travers le contrôle du cytosquelette d’actine et des tensions produites par ce dernier en interaction avec le moteur moléculaire Myosine-II.Quelle est la distribution des forces subcellulaires qui contrôlent la morphogenèse des tissus? Quelle est la nature des forces engendrée set pour finir, quelle est l’origine de ces forces? Voici les questions pour lesquelles ma thèse cherche des réponses. J’utilise l’élongation de la bande germinale de l’embryon de Drosophile comme système modèle afin d’investiguer la mécanique de la morphogenèse des tissus / During embryonic development tissue remodeling leads to shape changes: for example, tissues can elongate, invaginate, and stretch. Distinct signaling pathways regulate in space and time these behaviors through the control ofthe actin cytoskeleton and of myosin-based tension required for cell shapechange. What is the spatiotemporal pattern of subcellular forcesthat orient tissue morphogenesis? What is the nature of the generated forces and finally, what lies at the origin of such forces? These are the main questions that my thesis tries to illuminate. I use the germbandelongation of the Drosophila embryo as a model system to investigate themechanics of tissue morphogenesis