Note sur les annexes : 3 tableaux en format Excel, les tableaux supplémentaires S1 et S6 accompagnent le chapitre 1 qui présente le manuscrit « Point mutations in functionally diverse genes are associated with increased natural DNA transformation in multidrug resistant Streptococcus pneumoniae » ; le tableau supplémentaire S2 accompagne le chapitre 2 qui présente le manuscrit « On the role of choline in natural DNA transformation in Streptococcus pneumoniae » / *Streptococcus pneumoniae* est une bactérie qui colonise le nasopharynx humain. Présent dans le microbiome nasopharyngé sous forme de biofilms complexes, le pneumocoque atteint ses taux de portage maximum vers l'âge de 2 ou 3 ans, où près de 60% des enfants sont colonisés. Heureusement, la colonisation par le pneumocoque se fait de manière asymptomatique. Cependant, sous l'influence de divers facteurs environnementaux le pneumocoque peut quitter sa niche préférentielle pouvant entraîner des maladies potentiellement mortelles telles que la pneumonie ou la méningite. Le pneumocoque est responsable de plus d'un million de décès chaque année, particulièrement chez les enfants, les personnes âgées et les individus immunodéprimés. Cette menace est exacerbée par l'émergence de souches résistantes et par la grande variabilité antigénique qui lui permet d'échapper au programme de vaccination mis en place. Ce défi de santé publique vient de la remarquable plasticité génétique du pneumocoque, entravant ainsi les possibilités d'interventions cliniques ciblées. Au cœur de ce phénomène : la compétence. La compétence est un état physiologique régulée génétiquement qui confère à la bactérie la capacité de capturer, d'internaliser et d'intégrer de l'ADN exogène dans son chromosome par recombinaison homologue. Ce processus de engendre une considérable variabilité phénotypique, notamment en ce qui concerne la résistance aux antibiotiques et la formation de la capsule polysaccharidique, cible des vaccins disponibles. La compréhension approfondie des mécanismes et des facteurs d'induction de la compétence revêt une importance cruciale pour contenir la propagation des résistances aux antibiotiques et pour prévenir toute évasion de la bactérie vis-à-vis des vaccins. Alors que la compétence pour la transformation naturelle de l'ADN est transitoire dans des conditions planctoniques, les biofilms offrent un cadre idéal pour un échange génétique accru. C'est pourquoi notre choix s'est porté sur le biofilm *de S. pneumoniae* comme modèle d'étude de la transformation naturelle de l'ADN, et, par extension, de la compétence. En laboratoire, la compétence pour la transformation de l'ADN est souvent artificiellement induite par l'utilisation du peptide stimulant la compétence (CSP). Cependant, nos observations ont révélé que l'ajout artificiel de CSP n'est pas toujours nécessaire, dépendant de la souche et des conditions de culture. Nous avons isolé des mutants capables de transformer naturellement sans CSP par un criblage chimio génomique couplé au séquençage de nouvelle génération. Le séquençage du génome de ces mutants a mis en lumière une abondance et une diversité de gènes mutés. L'introduction de ces mutations dans la souche D39 a conduit à une augmentation de la transformation naturelle. Par le biais d'une étude d'association génomique entre des isolats cliniques multirésistants et sensibles aux antibiotiques, nous avons identifié des mutations associées à la multirésistance. Plusieurs gènes sont communs entre les deux études. Ces résultats suggèrent que *S. pneumoniae* utilise la transformation de l'ADN pour sa survie, et l'évolution de ce pathogène favorise la sélection de mutations améliorant ce mécanisme, contribuant ainsi à l'acquisition de résistances multiples. Dans le même contexte, nous avons évalué l'efficacité de transformation de la souche D39 dans divers milieux sans l'ajout de CSP. Seul le milieu CDM lui permet de transformer de l'ADN. Ainsi, des disparités significatives dans la composition du milieu ont été constatées, impactant le processus de transformation. Notamment, une corrélation positive a été observée entre la concentration en choline et l'amélioration de l'efficacité de la transformation. Une analyse transcriptomique effectuée après l'ajout de choline a révélé des altérations dans diverses voies métaboliques, telles que le métabolisme des carbohydrates ou les métabolismes induits lors de l'état de compétence, comme la biosynthèse des bactériocines et du pilus de type IV, essentiel lors de l'absorption de l'ADN exogène. Lors du criblage chimio-génomique mentionné précédemment, une mutation dans la protéine de liaison à la choline CbpL a été identifiée comme ayant un impact sur la transformation de l'ADN, bien que la voie spécifique par laquelle elle exerce cet impact demeure à déterminer. Cette étude a permis d'approfondir notre connaissance des mécanismes moléculaires influencés par la choline sur la transformation génétique, en mettant en lumière le rôle d'une mutation ponctuelle dans une protéine liant la choline sur ce processus. La transformation représente un mode de vie bactérien induit par une variété de facteurs, lui conférant une adaptabilité aux changements environnementaux. Ces deux études ont validé l'efficacité des approches « omiques » dans la compréhension des mécanismes biologiques régissant la cellule bactérienne. / *Streptococcus pneumoniae*, commonly known as pneumococcus, is a bacterium that colonizes the human nasopharynx. Present in the nasopharyngeal microbiome in the form of complex biofilms, pneumococcus reaches its peak carriage rates around the age of 2 or 3, when almost 60% of children are colonized by this bacterium. Fortunately, pneumococcal colonization of the nasopharynx is asymptomatic. However, under the influence of various environmental factors, pneumococcus can leave its preferential niche, leading to potentially fatal illnesses such as pneumonia or meningitis. Pneumococcus is responsible for over a million deaths every year, particularly among children, the elderly and immunocompromised individuals. This threat is exacerbated by the emergence of resistant strains, and by the high antigenic variability that allows it to evade established vaccination programs. This public health challenge stems from pneumococcus' remarkable genetic plasticity, which hinders the possibilities of targeted clinical interventions. At the heart of this phenomenon: competence. Competence is a genetically regulated physiological state that confers on the bacterium the ability to capture, internalize and integrate exogenous DNA into its chromosome through homologous recombination. This process generates considerable phenotypic variability, particularly regarding antibiotic resistance and the formation of the polysaccharide capsule, the target of available vaccines. A thorough understanding of the mechanisms and factors involved in the induction of competence is of crucial importance in containing the spread of antibiotic resistance and preventing vaccine evasion. While competence for natural DNA transformation is transient under planktonic conditions, biofilms offer an ideal setting for increased genetic exchange. This is why we chose the *S. pneumoniae* biofilm as a model for studying natural DNA transformation and, by extension, competence. In the laboratory, competence for DNA transformation is often artificially induced using the competence stimulation peptide (CSP). However, our observations revealed that the artificial addition of CSP is not always necessary, depending on strain and culture conditions. We isolated mutants capable of transforming naturally without CSP by chemo-genomic screening coupled with next-generation sequencing. Genome sequencing of these mutants revealed an abundance and diversity of mutated genes. The introduction of these mutations into the D39 strain led to an increase in natural transformation. Through a genomic association study between multidrug-resistant and antibiotic-susceptible clinical isolates, we identified mutations associated with multidrug resistance. Several genes are common to both studies. These results suggest that *S. pneumoniae* uses DNA transformation for its survival, and the evolution of this pathogen favours the selection of mutations enhancing this mechanism, thus contributing to the acquisition of multiple resistances. In the same context, we evaluated the transformation efficiency of strain D39 in various media without the addition of PSC. Only CDM medium enabled it to transform DNA. Significant disparities in medium composition were observed, impacting the transformation process. A positive correlation was observed between choline concentration and improved transformation efficiency. Transcriptomic analysis carried out after choline addition revealed alterations in various metabolic pathways, such as carbohydrate metabolism or metabolisms induced during the competence state, such as bacteriocin biosynthesis and type IV pilus, essential for the bacterium's uptake of exogenous DNA. In the chemogenomic screen, a mutation in the choline-binding protein CbpL was identified as having an impact on DNA processing, although the specific pathway by which it exerts this impact remains to be determined. This study has deepened our understanding of the molecular mechanisms influenced by choline on genetic transformation, highlighting the role of a point mutation in a choline-binding protein on this process. Transformation represents a bacterial lifestyle induced by a variety of factors, conferring adaptability to environmental changes. These two studies validated the effectiveness of -omics approaches in understanding the biological mechanisms governing the bacterial cell.

Les systèmes toxine-antitoxines (TA) sont abondants dans la majorité des génomes bactériens séquencés à ce jour. Ces systèmes codent une toxine stable qui inhibe soit la transcription, soit la traduction, et une antitoxine qui contrecarre l’effet de la toxine par formation d’un complexe avec celle-ci. L’antitoxine est instable suite à sa dégradation continue par les protéases ATP-dépendantes. Afin de maintenir un ratio antitoxine :toxine constant en condition normale de croissance, l’expression des systèmes TA est régulée négativement au niveau transcriptionnel par le complexe toxine-antitoxine.<p><p>Au début de notre travail, cinq systèmes TA étaient identifiés dans le chromosome d’E. coli. Il avait été montré par notre laboratoire que parmi ces systèmes, seul yefM-yoeB était activé en condition de surproduction de la protéase ATP-dépendante Lon. Ce résultat était surprenant puisque Lon était connue pour dégrader également l’antitoxine RelB du système chromosomique relBE. Un des objectifs de notre travail était de comprendre les mécanismes sous-jacents à cette spécificité. Nous avons montré que l’antitoxine YefM était dégradée à la fois par Lon et les protéases ClpAP et ClpXP. Nous avons également montré qu’en condition de surproduction de Lon, YefM était fortement instable (t1/2~ 10 min. vs 60 min en condition normale). Cette instabilité accrue permet donc l’activation du système yefM-yoeB, c’est-à-dire la libération de la toxine YoeB du complexe qu’elle forme avec YefM. Nous avons également avons montré que le t1/2 de RelB n’était pas affecté par la surproduction de Lon, ce qui explique pourquoi le système relBE n’est pas activé dans ces conditions. Notre hypothèse était qu’un cofacteur soit nécessaire à la dégradation de RelB par Lon et que celui-ci serait limitant dans nos conditions expérimentales. Le crible génétique que nous avons réalisé n’a cependant pas permis d’identifier de cofacteur de dégradation ni de régulateur transcriptionnel en trans du système relBE. <p><p>Un deuxième volet de notre travail de thèse a consisté en l’étude de la fonction des systèmes TA chromosomiques. L’hypothèse prévalente au début de notre travail était que les systèmes TA soient intégrés dans les voies adaptatives de réponses au stress. Cependant, le résultat de leur activation était controversé. L’hypothèse du groupe de Gerdes était que leur activation mène à un état bactériostatique réversible alors que le groupe d’Engelberg-Kulka montrait que le système mazEF était un système de mort programmée. Afin d’éclaircir le rôle des cinq systèmes TA dans la physiologie d’E. coli, nous avons testé l’effet de nombreux stress sur la croissance et la viabilité de souches sauvages et de souches délétées de ces systèmes. Aucune des conditions que nous avons testées n’a entraîné une diminution de la viabilité excluant de manière définitive l’hypothèse de la mort programmée. De plus, l’inhibition de croissance causée par ces différents stress s’est avérée être indépendante des cinq systèmes, de même que la phase de récupération suivant les différents stress. Enfin, nos expériences de compétition ont clairement démontré que les cinq systèmes ne procuraient aucun avantage sélectif aux bactéries dans des conditions de compétition en carence nutritive. Les systèmes TA étudiés dans ce travail ne jouent donc aucun rôle dans l’adaptation aux stress que nous avons testé puisqu’ils n’améliorent ni l’aptitude (fitness), ni la compétitivité des bactéries dans ces conditions. <p><p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished