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Les caractéristiques cinétiques du transport ionique par les différents variants du cotransporteur NKCC2Tremblay, Laurence E. 23 November 2023 (has links)
Le cotransporteur Na⁺-K⁺-Cl⁻ de type 2 (NKCC2) appartient à la famille des cotransporteurs cation-Cl⁻ (CCC). Il existe en tant que trois variants d'épissage, appelés A, B et F, qui ne diffèrent entre eux que de 32 acides aminés et qui sont tous localisés sur la membrane apicale de l'anse ascendante de Henle (AAH) à l'état homodimérique. Ils sont cependant exprimés de façon différentielle : NKCC2F se retrouve à la partie initiale de l'AAH où il assure une réabsorption importante du NaCl pour le maintien du volume extracellulaire alors que NKCC2A et NKCC2B se retrouvent à la partie distale de l'AAH et dans la macula densa où ils assurent une réabsorption plus modeste du NaCl pour aider au maintien du volume extracellulaire et soutenir la rétroaction tubuloglomérulaire. Comme « A » et « B » se retrouvent dans des types cellulaires communs, nous nous sommes demandé : 1) s'ils pouvaient former des hétérodimères AB dont les caractéristiques de transport ionique différaient de AA et BB et 2) si les quantités relatives de AA, AB et BB pouvaient être régulés pour permettre à l'AAH distale et à la macula densa d'opérer adéquatement à l'intérieur d'un éventail de concentrations ioniques plus large. L'objectif de recherche a donc été de générer des constructions d'ADNc où deux variants sont connectés entre eux par un « linker » inerte pour forcer la formation de dimères AA, AB ou BB, d'exprimer le produit de ces constructions dans des ovocytes de Xenopus laevis et d'en caractériser la cinétique de transport. Nous avons trouvé que des hétérodimères déployaient des caractéristiques fonctionnelles uniques (différentes par rapport à AA ou BB). Les vitesses maximales de transport atteintes par l'hétérodimère AB étaient beaucoup plus élevées que les homodimères AA et BB. Nos données suggèrent ainsi que les sous-unités assemblées coopèrent entre elles durant le processus de transport. Nos données ouvrent aussi la voie sur la possibilité que la quantité d'hétérodimères formés puisse être régulée de manière à permettre un spectre de réponses en fonction des besoins à combler. / The Na⁺-K⁺-Cl⁻ cotransporter type 2 (NKCC2) belongs to the cation-Cl⁻ cotransporter (CCC) family. It exists as three splice variants called A, B and F that differ among each other by 32 residues and that are all localized on the apical membrane of the thick ascending loop of Henle (TALH) as homodimers. However, they are differentially distributed along this nephron segment: NKCC2F is localized in the initial part of the TALH where it ensures substantial NaCl reabsorption to maintain the extracellular fluid volume and NKCC2A and NKCC2B are localized in the distal part of the TALH where it ensure more modest NaCl reabsorption to help in the maintenance of the extracellular fluid volume and support the tubuloglomerular feedback. As "A" and "B" are localized in the same cellular types, we asked ourselves: 1) whether they could form AB heterodimers with transport characteristics that differ from AA and BB and 2) whether the relative quantities of AA, AB and BB formed could be regulated to allow the distal TALH and macula densa to operate adequately within a wider range of ionic concentrations. My research objective was thus to generate cDNA constructs in which the A and/or B variants are connected to each other by an inert "linker" to force the formation of AA, AB or BB by proximity, to express the product of these cDNA constructs in Xenopus laevis oocytes and to characterize the transport kinetics of the NKCC2 produced. We found that AB heterodimers exhibited unique functional characteristics (relative to AA or BB). In particular, maximal transport rates were much higher for the AB heterodimers than for the AA and BB homodimers. Our data therefore suggest that the assembled subunits cooperate with each other during the transport cycle. Our data also pave the way towards the possibility that the quantity of AB heterodimers formed is regulated such that an array of responses are allowed as a function of the needs to be met.
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Construction d'un clone produisant des vecteurs rétroviraux s'auto-inactivant pour le traitement de l'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive par thérapie géniqueBoivin-Welch, Michael 24 April 2019 (has links)
L’épidermolyse bulleuse dystrophique récessive est une maladie génétique rare causée par des mutations dans COL7A1 codant pour le collagène de type VII. Cette protéine est produite par les kératinocytes de l’épiderme et les fibroblastes du derme et permet la formation des fibrilles d’ancrages dont le rôle est l’adhésion de l’épiderme au derme sous-jacent. Les patients atteints de l'EBDR souffrent de décollements de la peau et des muqueuses et aucun traitement ne permet de guérir cette maladie. Le but de ce projet est de construire un vecteur viral sécuritaire contenant l'ADNc de COL7A1 et de générer un clone de cellules productrices de virus à haut titre permettant de transduire assez de kératinocytes souches pour produire des peaux reconstruites et traiter les patients atteints de l'EBDR. Divers vecteurs rétroviraux "self-inactivated" exprimant l'ADNc de gfp ou de COL7A1 ont été générés. Les vecteurs GFP ont permis de déterminer que le remplacement de la région U3 du LTR 5' par l'enhancer et le promoteur du CMV, l'ajout de la séquence WPRE en 3' UTR du transgène, l'insertion de la séquence de polyadénylation du SV40 dans la région R du LTR 3' et l'ajout de la séquence de polyadénylation de bGH en aval du LTR 3', génèrent les titres viraux les plus élevés. L'ADNc de COL7A1 a été introduit dans un rétrovirus SIN optimisé puis transfecté dans une lignée d’encapsidation exprimant l’enveloppe Amphotropique 4070A. Un clone de cellules productrices produisant 9,8 x 105 particules virales par mL a été isolé. Le virus produit par ce clone est capable de transduire les kératinocytes et fibroblastes de patients atteints de l'EBDR à un taux de transduction de 37 % et 24 % respectivement. En somme, un clone de cellules productrices d’un vecteur rétroviral sécuritaire portant COL7A1 a été généré et a le potentiel d’être utilisé pour la thérapie génique de l’EBDR. / Recessive dystrophic epidermolysis bullosa is a rare genetic disorder caused by mutations in COL7A1 encoding type VII collagen. This protein is produced by the epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts and allows the formation of anchor fibrils whose role is the adhesion of the epidermis to the underlying dermis. Patients with EBDR suffer from skin and mucosal detachments and no treatment can cure this disease. The goal of this project is to construct a safe viral vector containing COL7A1 cDNA and to generate a high-titer virus-producing cell clone in order to transduce enough keratinocytes stem cells to produce reconstructed skins to treat patients with EBDR. Various self-inactivated retroviral vectors expressing gfp or COL7A1 cDNA have been generated. The GFP vectors allowed us to determine that the replacement of the U3 region of the 5' LTR by the CMV enhancer and promoter, the addition of the WPRE sequence to the 3 'UTR of the transgene, the insertion of the SV40 polyadenylation sequence into the R region of 3' LTR and the addition of the polyadenylation sequence of the bGH downstream of the 3' LTR generate the highest viral titers. COL7A1 cDNA was introduced into an optimized SIN retrovirus and transfected into a packaging cell line expressing the Amphotropic envelope 4070A. A clone of packaging cells producing 9.8 x 105 viral particles per mL was isolated. The virus produced by this clone is capable of transducing the keratinocytes and fibroblasts of patients with EBDR at a transduction rate of 37 % and 20 % respectively. In sum, a clone of cells producing a safe COL7A1 retroviral vector has been generated and has the potential of being used for gene therapy of EBDR.
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