La réparation par excision de nucléotides (NER) est une voie critique chez l'homme pour enlever des lésions qui déforment l’hélice d'ADN et qui bloquent à la fois la réplication et la transcription. Parmi ces lésions, il y a les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPDs) et les adduits pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4PPs) induient par les rayons ultraviolets. L'importance physiologique de la NER est mise en évidence par l’existence de la maladie Xeroderma pigmentosum (XP), causée par des mutations affectant des gènes impliqués dans cette voie de réparation. Les personnes atteintes sont caractérisées par une photosensibilité extrême et une forte prédisposition à développer des tumeurs cutanées (plus de 1000 fois). Les patients atteints du type variant de la maladie Xeroderma pigmentosum (XPV), apparemment compétents en réparation, portent plutôt des mutations dans le gène codant pour l'ADN polymérase η (polη). Polη est une ADN polymérase translésionnelle capable de contourner avec une grande fidélité certaines lésions telles que les CPDs, qui autrement bloquent les polymérases réplicatives. Ainsi, la polη prévient la formation de mutations et permet la reprise de la synthèse d'ADN. L'objectif principal de cette thèse est d'évaluer le rôle potentiel de voies de signalisation majeures dans la régulation de la NER, dont celles régulées par la kinase ATR (Ataxia Télangiectasia and Rad3-related kinase). Suite à l'irradiation UV, ATR est rapidement activée et phosphoryle des centaines de protéines qui régulent les points de contrôle du cycle cellulaire et joue un rôle notoire dans le maintient de la stabilité génomique. Nous avons postulé qu’ATR puisse réguler la NER de manière dépendante du cycle cellulaire. Cependant, tester cette hypothèse représente un grand défi car, pour des raisons techniques, les méthodes conventionnelles n’ont pas à ce jour été adaptées pour l'évaluation de la cinétique de réparation au cours des différentes phases du cycle cellulaire. Nous avons donc développé une méthode novatrice basée sur la cytométrie en flux permettant de quantifier avec grande précision la cinétique de réparation des 6-4PPs et CPDs dans chacune des phases G0/G1, S et G2/M. Avec cette nouvelle méthode, nous avons pu démontrer que l'inhibition d'ATR ou polη résulte en une très forte inhibition de la NER exclusivement durant la phase S du cycle cellulaire. Ces études ont révélé, pour la première fois, une fonction critique pour ces protéines dans le retrait des lésions qui bloquent la réplication. En outre, nous avons démontré que la synthèse d'ADN est indispensable pour l’inhibition de la réparation en phase-S, reflétant un lien potentiel entre la NER et la réplication. Curieusement, nous avons également montré que parmi six lignées cellulaires tumorales choisies aléatoirement, trois présentent une abrogation totale de la NER uniquement pendant la phase S, ce qui indique que de nombreux cancers humains pourraient être caractérisés par un tel défaut. Nos observations pourraient avoir d'importantes implications pour le traitement du cancer. En effet, le statut de la NER semble constituer un déterminant majeur dans la réponse clinique aux médicaments chimiothérapeutiques tels que le cisplatine, qui inhibent la croissance des cellules cancéreuses via l'induction de lésions à l’ADN. / Nucleotide excision repair (NER) is a critical pathway in humans for repairing highly genotoxic helix-distorting DNA lesions that strongly block both replication and transcription. Among these lesions are ultraviolet-induced 6-4 photoproducts (6-4PPs) and cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). The physiological importance of NER is highlighted by individuals afflicted with Xeroderma pigmentosum (XP), who carry mutations in NER pathway genes and as such exhibit extreme photosensitivity and remarkable predisposition to cutaneous tumorigenesis (1000-fold increase). On the other hand patients with the variant form of Xeroderma pigmentosum (XPV) are considered proficient in NER, and rather carry germline mutations in the gene encoding DNA polymerase η (polη). Polη is a specialized translesion DNA polymerase able to accurately bypass certain lesions including CPDs which otherwise completely inhibit the progression of normal replicative polymerases, thereby preventing mutations and allowing the resumption of DNA synthesis. The main goal of this thesis was to elucidate the potential role in NER of major DNA damage signalling cascades, including that regulated by the ataxia telangiectasia and rad 3-related kinase (ATR). Following UV irradiation, ATR is rapidly activated and phosphorylates hundreds of proteins that regulate cell cycle checkpoints and maintain genomic stability. We postulated that ATR might regulate NER in a cell cycle-specific manner. However testing this presented a great challenge, as (for technical reasons) traditional NER assays have to date not been adapted for evaluation of repair kinetics during individual phases of the cell cycle. We therefore developed a novel flow cytometry-based assay for sensitive quantification of 6-4PPs and CPDs repair efficiency during each of G0/G1, S, and G2/M. With this new assay, we were able to show that inhibition of either ATR or polη results in strong inhibition of NER capacity exclusively during S phase of the cell cycle. This revealed, for the first time, a critical function for these proteins in removal of replication-blocking DNA adducts. In addition, we demonstrated that active DNA synthesis is required for S phase-specific repair inhibition, reflecting a potential relationship between NER and replication. Intriguingly, we also showed that among six tumor cell lines, three exhibit total abrogation of NER uniquely during S phase, indicating that many human cancers may be characterized by such a defect. Our findings therefore could harbour important implications for cancer treatment. Indeed, NER status of tumors clearly appears to constitute a major determinant in the clinical response to chemotherapeutic drugs such as cisplatin, which inhibit the growth of rapidly proliferating cancer cells through induction of replication-blocking DNA lesions.

La réparation par excision de nucléotides (NER) est une voie critique chez l'homme pour enlever des lésions qui déforment l’hélice d'ADN et qui bloquent à la fois la réplication et la transcription. Parmi ces lésions, il y a les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPDs) et les adduits pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4PPs) induient par les rayons ultraviolets. L'importance physiologique de la NER est mise en évidence par l’existence de la maladie Xeroderma pigmentosum (XP), causée par des mutations affectant des gènes impliqués dans cette voie de réparation. Les personnes atteintes sont caractérisées par une photosensibilité extrême et une forte prédisposition à développer des tumeurs cutanées (plus de 1000 fois). Les patients atteints du type variant de la maladie Xeroderma pigmentosum (XPV), apparemment compétents en réparation, portent plutôt des mutations dans le gène codant pour l'ADN polymérase η (polη). Polη est une ADN polymérase translésionnelle capable de contourner avec une grande fidélité certaines lésions telles que les CPDs, qui autrement bloquent les polymérases réplicatives. Ainsi, la polη prévient la formation de mutations et permet la reprise de la synthèse d'ADN. L'objectif principal de cette thèse est d'évaluer le rôle potentiel de voies de signalisation majeures dans la régulation de la NER, dont celles régulées par la kinase ATR (Ataxia Télangiectasia and Rad3-related kinase). Suite à l'irradiation UV, ATR est rapidement activée et phosphoryle des centaines de protéines qui régulent les points de contrôle du cycle cellulaire et joue un rôle notoire dans le maintient de la stabilité génomique. Nous avons postulé qu’ATR puisse réguler la NER de manière dépendante du cycle cellulaire. Cependant, tester cette hypothèse représente un grand défi car, pour des raisons techniques, les méthodes conventionnelles n’ont pas à ce jour été adaptées pour l'évaluation de la cinétique de réparation au cours des différentes phases du cycle cellulaire. Nous avons donc développé une méthode novatrice basée sur la cytométrie en flux permettant de quantifier avec grande précision la cinétique de réparation des 6-4PPs et CPDs dans chacune des phases G0/G1, S et G2/M. Avec cette nouvelle méthode, nous avons pu démontrer que l'inhibition d'ATR ou polη résulte en une très forte inhibition de la NER exclusivement durant la phase S du cycle cellulaire. Ces études ont révélé, pour la première fois, une fonction critique pour ces protéines dans le retrait des lésions qui bloquent la réplication. En outre, nous avons démontré que la synthèse d'ADN est indispensable pour l’inhibition de la réparation en phase-S, reflétant un lien potentiel entre la NER et la réplication. Curieusement, nous avons également montré que parmi six lignées cellulaires tumorales choisies aléatoirement, trois présentent une abrogation totale de la NER uniquement pendant la phase S, ce qui indique que de nombreux cancers humains pourraient être caractérisés par un tel défaut. Nos observations pourraient avoir d'importantes implications pour le traitement du cancer. En effet, le statut de la NER semble constituer un déterminant majeur dans la réponse clinique aux médicaments chimiothérapeutiques tels que le cisplatine, qui inhibent la croissance des cellules cancéreuses via l'induction de lésions à l’ADN. / Nucleotide excision repair (NER) is a critical pathway in humans for repairing highly genotoxic helix-distorting DNA lesions that strongly block both replication and transcription. Among these lesions are ultraviolet-induced 6-4 photoproducts (6-4PPs) and cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). The physiological importance of NER is highlighted by individuals afflicted with Xeroderma pigmentosum (XP), who carry mutations in NER pathway genes and as such exhibit extreme photosensitivity and remarkable predisposition to cutaneous tumorigenesis (1000-fold increase). On the other hand patients with the variant form of Xeroderma pigmentosum (XPV) are considered proficient in NER, and rather carry germline mutations in the gene encoding DNA polymerase η (polη). Polη is a specialized translesion DNA polymerase able to accurately bypass certain lesions including CPDs which otherwise completely inhibit the progression of normal replicative polymerases, thereby preventing mutations and allowing the resumption of DNA synthesis. The main goal of this thesis was to elucidate the potential role in NER of major DNA damage signalling cascades, including that regulated by the ataxia telangiectasia and rad 3-related kinase (ATR). Following UV irradiation, ATR is rapidly activated and phosphorylates hundreds of proteins that regulate cell cycle checkpoints and maintain genomic stability. We postulated that ATR might regulate NER in a cell cycle-specific manner. However testing this presented a great challenge, as (for technical reasons) traditional NER assays have to date not been adapted for evaluation of repair kinetics during individual phases of the cell cycle. We therefore developed a novel flow cytometry-based assay for sensitive quantification of 6-4PPs and CPDs repair efficiency during each of G0/G1, S, and G2/M. With this new assay, we were able to show that inhibition of either ATR or polη results in strong inhibition of NER capacity exclusively during S phase of the cell cycle. This revealed, for the first time, a critical function for these proteins in removal of replication-blocking DNA adducts. In addition, we demonstrated that active DNA synthesis is required for S phase-specific repair inhibition, reflecting a potential relationship between NER and replication. Intriguingly, we also showed that among six tumor cell lines, three exhibit total abrogation of NER uniquely during S phase, indicating that many human cancers may be characterized by such a defect. Our findings therefore could harbour important implications for cancer treatment. Indeed, NER status of tumors clearly appears to constitute a major determinant in the clinical response to chemotherapeutic drugs such as cisplatin, which inhibit the growth of rapidly proliferating cancer cells through induction of replication-blocking DNA lesions.

CONTEXTE La syphilis est une maladie ré-émergente depuis 2000. Son traitement est simple, mais son diagnostic est complexe. La technique d’amplification génique de Treponema pallidum (Tp-PCR) existe depuis 1990 mais le CDC l’a incluse dans sa définition de cas en janvier 2014. OBJECTIFS 1) Evaluer la performance diagnostique de la Tp-PCR à différents stades cliniques et milieux biologiques. 2) Mesurer la sensibilité, spécificité et les valeurs prédictives de la Tp-PCR en fonction de 3 groupes de référence dans des ulcères récents. 3) Comparer les performances des 2 principales cibles de Tp-PCR.MATÉRIEL ET MÉTHODES Premièrement, une revue systématique et méta-analyse des études publiées depuis 1990 ont été menées. Ensuite une étude multicentrique prospective a été conduite dans 5 villes européennes pendant 2 ans chez des patients avec un ulcère oro-génital. Tous ont reçu le test de référence local et 2 Tp-PCRs dans l’ulcère (gène tpp47 vs. polA). Les valeurs de sensibilité, spécificité et valeurs prédictives de la Tp-PCR ont été calculées comparativement au fond noir (FN), à la sérologie et à un gold standard amélioré. La concordance des 2 cibles a été évaluée par un coefficient kappa.RÉSULTATS PRINCIPAUX La méta-analyse conclut que la Tp-PCR a une meilleure performance dans les ulcères récents. L’étude clinique montre que la Tp-PCR décrit une meilleure performance comparativement au gold standard amélioré et a même une meilleure sensibilité que le FN. Les 2 cibles ont la même valeur diagnostique et une concordance quasi parfaite. CONCLUSIONS La Tp-PCR ciblant tpp47 ou polA est cliniquement utile pour diagnostiquer une syphilis primaire et pourrait même remplacer le FN sous certaines conditions. / BACKGROUND Syphilis has re-emerged in at-risk populations since 2000. Although the treatment of syphilis is simple, its diagnosis remains challenging. Treponema pallidum Polymerase Chain Reaction (Tp-PCR) has been used in the diagnosis of syphilis since 1990 but it is included in the case definition of the CDC since January 2014. OBJECTIVES 1) To assess the accuracy of Tp-PCR in various biological specimens and syphilis stages. 2) To measure its diagnostic performance (sensitivity, specificity and predictive values) in ulcers from early syphilis compared to three groups of reference. 3) To compare the accuracy of the two most currently used targets: tpp47 and polA genes.METHODS We conducted a systematic review and meta-analysis of all studies published from 1990. We implemented a multicentre, prospective, observational study in 5 European cities between 09/2011 and 09/2013 among patients with an oral or genital ulcer suggestive of syphilis. All patients were tested with traditional reference tests plus 2 Tp-PCRs (tpp47 and polA). We estimated the sensitivity, specificity and predictive values of Tp-PCR compared to darkfield microscopy (DFM), serology and an enhanced gold standard. We used the kappa coefficient to assess the agreement between the 2 targets.MAIN RESULTST p-PCR had the best accuracy in ulcers from early syphilis. Tp-PCR performed better when compared to the enhanced gold standard and had a higher sensitivity than DFM. The 2 Tp-PCRs had a similar accuracy and an almost perfect agreement.CONCLUSIONS Tp-PCR targeting either tpp47 or polA is clinically useful to confirm an early syphilis in smears and could even replace DFM under specific conditions.