Il lavoro qui presentato è incentrato sulla caratterizzazione dei Fontanili - risorgive semi-natural1 comuni della regione Lombardia (Nord Italia), GDES rilevanti per il progetto GENESIS sulle acque sotterranee (progetto europeo finanziato nell'ambito del 7th Framework Programme). Gli obiettivi di questo lavoro di dottorato sono stati: - Caratterizzare gli ecosistemi Fontanili sulla base delle conoscenze scientifiche disponibili; - Individuare le risposte ecotossicologiche di un indigeno specie bentoniche macroinvertebrati alla contaminazione agricola attraverso la sperimentazione in Fontanili per verificare se il metodo applicato può servire come bioindicatore della contaminazione negli ecosistemi Fontanili. Gli obiettivi indicati sono affrontati nelle sezioni seguenti. Sezione 3 caratterizza gli ecosistemi Fontanili sulla base delle conoscenze scientifiche disponibili. La sezione 4 è una rivista di indicatori biologici per la valutazione della qualità delle acque con particolare attenzione alla macroinvertebrati. La sezione 5 presenta i risultati degli studi su Fontanili selezionati con l'uso di un test biologico in situ di alimentazione con un anfipode indigena Echinogammarus stammeri. I capitoli 6 e 7 sono esperimenti di laboratorio condotti per misurare le risposte delle anfipodi di inquinanti agricoli rilevati nei Fontanili studiati. A parte il lavoro condotto in Italia, l'autore insieme a Sarah Joseffson dal Dipartimento di Scienze acquatica e Valutazione, Università Svedese di Scienze Agrarie a Uppsala, in Svezia eseguito uno studio "Trasferimento di inquinanti organici persistenti da acquatico a ambienti terrestri con insetti acquatici come vettori" nel 2012. La descrizione e preliminari risultati di questo lavoro di studio possono essere trovati nell'appendice I. / The work presented here is focused on characterization of fontanili - semi-natural1 springs common in the Lombardy region (North Italy), relevant groundwater dependent ecosystems for the GENESIS project on groudwater systems (European project funded under the 7th Framework Programme). The objectives of this PhD work were: - to characterize the fontanili ecosystems based on the available scientific knowledge; - to identify ecotoxicological responses of an indigenous macroinvertebrate benthic species to agricultural contamination through experimentation in fontanili ecosystems This will test if the applied method can serve as a bioindicator of contamination in the fontanili ecosystems. The mentioned objectives are addressed in the following sections. Section 3 characterizes the fontanili ecosystems based on the available scientific knowledge. Section 4 is an overview of biological indicators as water quality assessment with focus on macroinvertebrates. Section 5 presents the results of field studies on selected fontanili sites with the use of an in situ feeding bioassay with an indigenous amphipod Echinogammarus stammeri. Chapters 6 and 7 are laboratory experiments conducted to measure the responses of the amphipods to commonly detected agricultural pollutants in the studied fontanili. Apart from the work conducted in Italy, the author together with Sarah Joseffson from the Department of Aquatic Sciences and Assessment, Swedish University of Agricultural Sciences in Uppsala, Sweden performed a study “Transfer of persistent organic pollutants from aquatic to terrestrial environments with aquatic insects as vectors” in 2012. The description and preliminary results of this study work can be found in Appendix I.

Lo scopo principale di questa ricerca è stato di monitorare la concentrazione di nitrati, dell'erbicida terbutilazina e di un suo metabolita, la desethylterbuthylazina, in acque sotterranee superficiali, secondo le normali pratiche agronomiche in differenti aree italiane rappresentative della coltura maidicola. Il primo passo è stato identificare i siti di monitoraggio, quindi è stata creata una procedura generale al fine di individuare aree rappresentative per il mais in Italia. Dentro tali aree sono stati selezionati dei siti di: 4 in Lombardia, 2 in Emilia Romagna, 2 in Veneto, 2 in Piemonte e uno in Friuli-Venezia Giulia. In Aprile 2005 il monitoraggio ha avuto inizio e i campionamenti sono stati eseguiti ogni due mesi. L'indice “IDPR”, strumento per la mappatura della vulnerabilità a livello regionale e nazionale, è stato applicato alle aree oggetto di studio. L'indice riflette l'influenza che le formazioni geologiche del sottosuolo hanno sullo scorrimento superficiale e sull'infiltrazione. L'analisi della probabilità di distribuzione dei risultati ha mostrato che una bassa probabilità di superare i limiti fissati per legge, questa probabilità è risultata più alta per il metabolita. Le concentrazioni dei nitrati nelle acque sotterranee sono risultate molto basse. Inoltre, è stato applicato un modello matematico (MACRO vs 5.1) di previsione che calcola la percolazione dei pesticidi. / The main aim of the research was to monitor the concentrations of nitrates, the herbicide terbuthylazine and its products of the environmental degradation, desethyl-terbuthylazine, in shallow groundwater, according to the normal agricultural practices in different Italian areas representative of maize crop. The first step was to identify the monitoring sites, therefore it was necessary to create a general procedure to individuate maize representative areas in Italy. Inside these area 11 monitoring sites were selected: 4 in Lombardy, 2 in Emilia Romagna, 2 in Veneto, 2 in Piedmont and one in Friuli-Venezia Giulia. In April 2005 the monitoring started. Groundwater samplings were carried out every two months. The IDPR index, a tool for national and regional vulnerability mapping, was applied. The index reflects the influence of the subsurface geological formations on the surface water runoff or infiltration. The distribution probability analysis of the results showed that there was a very low probability of exceeding the limit fixed by law, this probability was higher for the metabolite. The greater probability of exceed the 0.1 μg/L occurred in two sites, both irrigated with basin irrigation system. Nitrate concentrations resulted to be very low in shallow groundwater. Moreover, it was used a mathematical model which calculate the leaching of pesticides (MACRO 5.1).

Scopo di questa tesi è stato di valutare se le attività biologiche possono essere utilizzate come indicatori di adattamento microbico. Le prove condotte sinora in letteratura si sono concentrate unicamente sull’attività di nitrificazione. Pertanto si è voluto valutare se altre attività biologiche possono essere utilizzate come indicatori d’adattamento. Allo scopo si è prima valutata la sensibilità di alcune importanti proprietà biologiche del suolo (nitrification, fluorescein diacetate (FDA)) e attività enzimatiche (urease, nitrate reductase, phosphatase, arylsulfatase, β-galactosidase, phenol-oxidase and dehydrogenase) allo Zn mediante l’impiego di test ecotossicologici Per le attività più sensibili sono state condotte delle prove di adattamento secondo il protocollo di Rusk. Questo esclude le interferenze dovuto all’ aging. Questo protocollo è basato sul reinoculo di un suolo sterile (contaminato con concentrazioni crescenti di Zn) con sottocampioni di suolo che sono stati precedentemente incubati per un periodo di 4 mesi con e senza Zn Il confronto tra i valori di EC50 delle attività biologiche dei suoli reinoculati ci ha permesso di dimostrare un significativo recupero della β-galactosidase, mentre per il nitrate reductase e la nitrificazione potenziale è stato trovato un chiaro e significativo shift delle curve di dose e risposta, anche se con parziale sovrapposizione del range dell’EC50 stimato. / The purpose of this thesis was to assess whether the biological activities can be used as indicators of the microbial adaptation. The tests conducted so far in the literature have focused only nitrification activity. Therefore we wanted to assess whether other biological activities can be used as indicators of adaptation. To do this you first evaluated the sensitivity of some important biological properties of the soil (nitrification, fluorescein diacetate (FDA)) and enzymatic activities (urease, nitrate reductase, phosphatase, arylsulfatase, β-galactosidase, phenol-oxidase and dehydrogenase) Zn through the use of toxicological test. Then the activities most sensitive were tests to evaluate to adapt according to the protocol by Rusk This method to exclude interferences to two chemical aging in soil, This protocol is based on the reinoculation of sterilized soil (contaminated with increasing Zn concentrations) with sub-samples of soil which have been incubated for 4 months with or without Zn. The comparison between the EC50 of the biological properties of reinoculated soils allow us to demonstrate a significant restoration was found for β-galactosidase, while for nitrate reductase and potential nitrification there was a clear and significant shift of dose response curves but with partial overlap of the EC50 ranges estimation.

Negli ultimi anni sono state pubblicate diverse normative, tra le quali ritroviamo la Decisione 2015/495 che ha emesso una lista di contaminanti con problematiche emergenti. Tra questi vi è il Triallate, erbicida pre-emergenza sul quale è stato basato questo progetto. In questo elaborato sono stati messi a confronto i risultati di uno studio triennale, il cui obiettivo era quello di monitorare le concentrazioni nelle acque di falda di due metaboliti del Triallate (DIPA e TCPSA), con i dati emersi dai modelli previsionali (FOCUS-Pearl) e verificare se tali dati erano concordi o se i valori della modellistica fornivano una tutela largamente protettiva nei confronti dell’ambiente, in sede di registrazione. / Recently, several regulations have been published, among which we find Decision 2015/495 which contains a list of contaminants with emerging problems. Among these we find Triallate, an herbicide on which this project was based. In this paper, the results of a three-year study on two metabolites of Triallate (DIPA and TCPSA) were compared with the data emerging from models (FOCUS-Pearl ). At the end we check if these data were in agreement or if the values ​​of the modeling provided a largely protective protection towards the environment.

Gli ecosistemi acquatici sono il comparto ambientale finale per molti contaminanti introdotti nell’ambiente, specialmente per quelli persistenti, provenienti da diverse attività antropiche. Gli organismi acquatici sono esposti simultaneamente a differenti classi di composti chimici e, la loro fisiologia può esserne affetta anche da basse concentrazioni ambientali che ne determinano un effetto a cascata drammatico sull’intero ciclo vitale delle stesse. Per identificare gli effetti ecotossicologici si devono scegliere delle variabili di studio che sono sensibili a cambiamenti di esposizione e quindi possono registrare informazioni a differenti livelli di organizzazione biologica (ad es.: comunità, specie, alterazioni cellulari, molecolari). Il presente lavoro ha come scopo di studiare biomarker biochimici e bioindicatori su invertebrati acquatici capaci di rispondere all’effetto dei contaminanti e predirne il rischio di tossicità, requisito fondamentale dell’attuale legislazione comunitaria ambientale. Questo lavoro, nell’ambito della Water Frame Directive (WFD), affronta questa tematica con diversi tipi di approccio per implementare un sistema di monitorizzazione efficiente. Lo SPEAR ad esempio è in grado di diagnosticare la contaminazione di ecosistemi acquatici da pesticidi operando a livello di comunità di invertebrati acquatici. Inoltre si sono presi in considerazione anche biomarker a livello cellulare in bivalvi (Tapes philipphinarum and Mya arenaria): attività enzimatiche coinvolti nelle risposte aerobiche (CCO) e antiossidative (SOD and CAT), risposte genotossicologiche come la frequenza dei micronuclei, e, infine, a livello di organismo, risposte di carattere comportamentale. / Aquatic ecosystems are the final sink for most of contaminants introduced in the environment, especially persistent organic pollutants coming from different human activities. Most of the freshwater and coastal organisms are exposed simultaneously to different classes of chemicals, and their physiology may be affected by toxic chemical even at low environmental concentrations with a cascade event on population dynamics. Identifying ecotoxicological effects requires descriptors that are sensitive to changes in exposure and thus can indicate information at different levels of biological organisation (i.e. communities, sub-individual level). The present work aims to investigate biochemical biomarkers and bioindicators in aquatic invertebrates able to detect biological effects and predict risk of toxicity, with a special focus paid to the requirements of current EU regulation. Therefore, the present work faced on different kinds of approach identified to be efficient tools within the context of the WFD requirements (Water Frame Directive, 2000/60/EC), for investigative and operational monitoring. Work include the SPEAR approach as trait based indicator descriptor of freshwater aquatic macroinvertebrates communities, able to diagnose pesticide contamination in aquatic ecosystems. Further diagnostic approaches in environmental status are included, as assay representing biological responses for different enzymes involved in the aerobic (CCO) and antioxidant responses, (SOD, and CAT), behavioural endpoints, and genotoxicity biomarker associated with micronuclei frequency in bivalve species (Tapes philipphinarum and Mya arenaria).

I prodotti fitosanitari sono considerati uno dei principali strumenti di difesa contro le più rilevanti avversità che colpiscono la produzione agricola. Per garantire che il loro utilizzo sia realmente basato su principi di sostenibilità, nel 2009 l’Unione Europea ha introdotto la cosiddetta direttiva sull’Uso Sostenibile dei Pesticidi (EU 128/2009/EC) dove lo sviluppo di appropriati indicatori di rischio insieme all’implementazione di una corretta attività di formazione e sensibilizzazione sono da considerare fondamentali per ridurre l’esposizione. Per contribuire in questa direzione, in questo studio sono stati prodotti: a) un toolbox di pratici indicatori di rischio indiretti per essere utilizzati da parte delle autorità nazionali per monitorare le performance; b) un nuovo strumento e-learning (OpenTEA) di formazione e sensibilizzazione per raccogliere e condividere i più efficienti e consistenti materiali a disposizione. Questi contributi sono stati sviluppati utilizzando un approccio pragmatico basato sia su una consultazione degli stakeholders sia su un’analisi completa del rischio (usando dei modelli previsionali di esposizione e svolgendo un’indagine sistematica “sul campo”). Tutto è stato reso possibile grazie al coinvolgimento nelle attività nel centro di ricerca OPERA, un “think tank” che attraverso il suo approccio innovativo basato su costruire reti con gli stakeholders e ponti tra scienza e politica, permette il raggiungimento di soluzioni pragmatiche condivise. / Pesticides are considered one of the principle tools of defence against the most relevant adversity affecting the agricultural production. To ensure that their use is really based on sustainability principle, in 2009 the European Union introduced the so called Directive on Sustainable Use of Pesticides (EU 128/2009/EC) where the establishment of appropriate risk indicators to monitor the performances together with the implementation of appropriate training and awareness raising to improve behaviours are considered fundamentals. To contribute in this direction, in this study were produced: a) a toolbox of practical indirect risk indicators to be used by EU Member States to monitor the performances; b) a new e-learning tool (OpenTEA) for training and awareness raising to collect and share the most efficient and scientifically sound training and communication material. These contributions were developed using a pragmatic approach focusing either on a complete stakeholder consultation process either on a comprehensive analysis of risk (looking at some exposure models and performing a systematic surveys “on the field”). All the process was possible getting involved in the OPERA research centre, a “think tank” that through its innovative approach based on building network among stakeholders and bridges between science and policy, allow the achievement of pragmatic and agreed solutions.

Fornendo energia e nutrienti, la produzione di cibo è essenziale per la vita. Tuttavia, essa rappresenta anche una criticità ambientale. La popolazione mondiale in rapida crescita, infatti, ha bisogno di un quantitativo di cibo sempre maggiore, una delle principali cause di degrado ambientale a livello globale. Il sistema agricolo è fondato su una rete di relazioni complesse che collegano la produzione agricola, funzioni e condizioni ambientali. Una produzione agricola meno impattante è, quindi, fondamentale per non compromettere la possibilità per la future generazioni di avere accesso a un quantitativo adeguato di risorse. La metodologia LCA (life cycle assessment) ha un ruolo centrale nella valutazione di sostenibilità. Analizzando l’intero ciclo di vita di un prodotto o servizio, infatti, permette di tenere in considerazione eventuali trasferimenti di impatti tra comparti ambientali o fai della filiera. Il principale obiettivo della presente tesi è contribuire al dibattito in corso riguardo all’armonizzazione degli approcci nell’applicazione della metodologia LCA a prodotti agro-alimentari per favorirne l’affidabilità e l’efficacia. / Providing energy and nutrients, food production is essential for life. However it represents also an important environmental concern. Indeed, the rapidly growing world population is requiring an increased food production which is one of the greatest causes of environmental degradation throughout the world. The agricultural system is based on complex relations that link agricultural productivity, environmental functions and environmental conditions. Therefore, moving towards less polluting production systems is of the utmost importance to satisfy the current demand for food without compromising the possibility for future generations to have access to a proper amount of food of adequate quality. Life cycle assessment (LCA) methodology is at the core of sustainability assessment. Indeed, considering the entire life cycle of a product or service, it allows to account for potential shifts of environmental impacts between environmental compartments or stages of the food supply chain. The overall aim of the present thesis is to contribute to the ongoing debate on the harmonisation of the approaches to carry out a LCA referred to agro-food products in order to foster its reliability and effectiveness.

La globalizzazione del mercato agroalimentare ha determinato una crescente attenzione da parte dei consumatori verso i prodotti alimentari, non solo in termini di qualità e di sicurezza, ma anche di origine geografica. Infatti, il territorio d’origine ha un forte impatto sull’alimento, dovuto alle condizioni pedoclimatiche che ne determinano le caratteristiche. Poiché non esistono dei metodi analitici di routine per l’autenticazione della provenienza geografica, lo scopo del progetto di ricerca è quello di determinare l’origine geografica e l’autenticità degli alimenti mediante profiling dei composti fenolici e steroli, grazie all’applicazione di tecnologie omiche, tecniche statistiche e chemometriche. La componente fenolica e/o steroli dei campioni, viene analizzata tramite cromatografia liquida (UHPLC) accoppiata ad uno spettrometro di massa (Q-TOF-MS). I dati così ottenuti, vengono elaborati mediante statistica multivariata. L’applicazione combinata di avanzate tecnologie omiche e tecniche statistiche chemometriche ha portato come risultato l’effettiva identificazione della provenienza geografica e autenticità di numerose matrici alimentari. I dati ottenuti dimostrano che i metaboliti secondari possiedono proprietà discriminanti. L’approccio di metabolomica UHPLC/Q-TOF-MS combinato a una statistica multivariata risulta essere adeguato per identificare potenziali markers. Il lavoro attuale è focalizzato sulla ricerca di nuovi metaboliti che, insieme a fenoli e steroli possano confermare la potenza di questo approccio. / Nowadays, food traceability is a growing consumer interest worldwide. Food traceability could be considered a fundamental tool for ensuring safety and high quality of food. Food quality is based not only on the safety and integrity of food, but also on the authenticity, the genuineness of the raw material and the geographical origin. The aim of the work was to investigate the potential of untargeted metabolomics to ensure the authenticity and traceability of foods. Secondary metabolites, like polyphenols and sterols, could be conveniently used to meet this goal due to their chemical diversity and their responses to environmental stimuli. Samples were analyzed through UHPLC-ESI/QTOF-MS. The obtained data were subjected to multivariate statistical analysis. The obtained results showed that secondary metabolites can be efficiently used for authenticity and traceability purposes, with regards to cultivars and geographical origin. These information confirm the role of environmental factors in shaping the actual profile of secondary metabolites in plant foods. The markers found could be used for a target quantification method, a less expensive and less sophisticated analysis, in order to provide an efficient tool that could help to guarantee food quality on routine basis.

La presenza di pesticidi nelle acque di falda è emersa come un importante problema ambientale negli ultimi decenni. In base a “Rapporto nazionale pesticidi nelle acque - Dati 2015-2016” (ISPRA, 2018), in Italia, gli erbicidi triazinici e i loro metaboliti sono tra le sostanze identificate con più frequenza nelle acque, sebbene l’atrazina sia stata bandita nel 1992 e l’utilizzo di terbutilazina sia sottoposto a severe restrizioni. Lo scopo di questo progetto è valutare e quantificare la presenza di atrazina, terbutilazina e dei loro metaboliti nelle acque di falda in aree maidicole italiane. I risultati dimostrano come le molecole oggetto di studio siano state frequentemente individuate nei campioni di acqua di falda, anche se a concentrazioni inferiori al limite stabilito dalla Commissione Europea. Considerando che l’utilizzo di questi erbicidi è proibito o fortemente regolamentato, è interessante valutare il loro comportamento in una scala temporale pluriennale al fine di mettere in evidenza la contaminazione delle acque di falda dovute all’uso diffuso e alla persistenza ambientale di tali molecole. / The presence of pesticides in groundwater has emerged as an important environmental issue in the last decades. According to “Rapporto nazionale pesticidi nelle acque - Dati 2015-2016” (ISPRA, 2018), in Italy triazine herbicides and their metabolites are among the substances most frequently detected in water. While terbuthylazine is still used under restriction, atrazine was banned in 1992. The aim of research project is to investigate the presence of atrazine, terbuthylazine and their metabolites in groundwater in Italian maize-growing areas in order to supply data and information on the groundwater quality. The results show that atrazine, terbuthylazine and their metabolites were often detected in groundwater, even if their concentrations were below the limit established by European Commission. Considering these molecules are banned or heavily regulated, it is interesting to evaluate their behavior on a multiannual time scale in order to highlight the groundwater contamination due to the widespread use and to the environmental persistence of these substances.

In agricoltura, i pesticidi sono stati usati molto frequentemente per salvaguardare le colture dagli attacchi di parassiti e dalle malattie. Questi pesticidi, oltre a uccidere gli organismi target, molte volte colpiscono anche gli organismi non-target. Tra gli organismi non-target, possiamo individuare molti microrganismi utili a determinare la fertilità e la qualità del terreno. La presenza di questi xenobiotici nel terreno può influenzare i principali cicli biogeochimici (N, C, S, P) e altre vie metaboliche (es. β-ketoadipate). In questo studio abbiamo analizzato gli effetti di isoproturon, tebuconazole e chlorpyrifos sull’abbondanza, sulla struttura e sulla diversità della comunità microbica. Inoltre, abbiamo anche studiato gli effetti di questi pesticidi sui geni coinvolti nel ciclo dell’azoto. Si è potuto notare che l’abbondanza della comunità batterica è molto influenzata dall’applicazione del fungicida tebuconazole . Per quanto riguarda gli studi sulla funzionalità e diversità della popolazione microbica, l’applicazione di questi pesticidi sembra non indurre una chiara dose-dipendente e un effetto tempo. Diversamente, in relazione all’analisi sulla diversità microbica, possiamo affermare che l’applicazione di questi tre pesticidi ha influenzato il numero di OTU rilevate; tuttavia, l’indice di diversità (H’) ci dice che l’uso di questi pesticidi porta ad un incremento della diversità all’interno dei campioni trattati. In conclusione, è possibile affermare che l’applicazione di questi pesticidi influenza l’abbondanza e la funzionalità della popolazione microbica, ma non induce una diminuzione della diversità all’interno della medesima comunità. / In agriculture, pesticides have been frequently used to protect crops from pest and disease attacks. Many times such pesticides, besides killing the target organisms, hit non-target organisms. Among the non-target organisms, we can find many useful microorganisms that determine fertility and soil quality. The presence of these xenobiotics in soil can influence the main biogeochemical cycles (N, C, S, P) and other metabolic pathways (eg. Β-ketoadipate). In this study, we investigated the effects of isoproturon, tebuconazole and chlorpyrifos on the abundance, the structure and the diversity of the microbial community. We have also studied the effects of these pesticides on the genes involved in the nitrogen cycle. It was observed that the abundance of the bacterial community is significantly affected by the application of the fungicide tebuconazole. As for the studies on the functionality and the diversity of the bacterial population, the application of these pesticides does not seem to induce a clear dose-dependent nor a time effect. On the contrary, with respect to the analysis on microbial diversity, we observed that the application of these three pesticides did influence the number of detected OTU, whereas the diversity index (H') tells us that the use of such pesticides leads to an increase of diversity within the treated samples. Finally, we can conclude that the application of these pesticides affects the abundance and function of the microbial population, but does not lead to lower diversity within the same community.