L’osteopetrosi autosomale recessiva (ARO) è un gruppo di malattie dovute a un difettoso funzionamento degli osteoclasti che preclude un rimodellamento osseo corretto. Nel 50% dei casi umani il difetto è dovuto ad una delezione nel gene Tcirg1. Il modello murino mutante oc/oc porta lo stesso difetto genetico e fenotipico umano. Nel lavoro di tesi si è dimostrato che gli epatociti fetali di 12.5 giorni di gestazione trapiantati in utero in feti mutati di 13.5 giorni di gestazione sono in grado di curare il fenotipo malato. Si è inoltre derivata una sottolinea di cellule staminali embrionali murine transgeniche per il costrutto plasmidico GOF18eGFP. Si vuole utilizzare la GFP sotto il controllo del promotore del gene Oct-4 come marcatore del livello di staminalità cellulare per microiniettare le ESC in blastocisti murine mutate oc/oc. / Autosomal recessive osteopetrosis (ARO) is a group of genetic disorders due to defects that preclude normal function of osteoclasts. In half the cases, human ARO is due to mutations in the Tcirg1 gene. The oc/oc mutant mouse closely recapitulates human Tcirg1-dependent ARO. In ths work we demonstrate that in utero injection of allogenic fetal liver cells on 12.5 days into oc/oc fetuses at 13.5 day post coitum completely rescue the osteopetrotic phenotype. Moreover, an embryonic stem cells line transgenic for GOF18eGFP was produced. The goal is to use the GFP under the transcriptional control of the Oct-4 promoter as a marker of pluripotency of the ESC that are to microinject into oc/oc blastocysts.

Enterococcus faecium è un componente fondamentale del microbiota di diversi alimenti fermentati quali formaggi e salumi e viene spesso isolato in alto numero in alimenti pronti al consumo. É inoltre largamente utilizzato come probiotico sia per l’uomo che per gli animali. Allo stesso tempo, però, questa specie batterica rappresenta una delle cause principali di infezioni nosocomiali quali endocarditi ed infezioni al tratto urinario. Studi recenti hanno dimostato che la specie E. faecium è costituita da due sub-popolazioni principali: la prima è denominate hospital associated (HA) clade “A” ed include la maggior parte dei ceppi responsabili di infezioni umane; la seconda è chiamata community associated (CA) clade “B”, e contiene principalmente ceppi commensali dell’uomo. Analisi più approfondite hanno rivelato un ulteriore suddivisione all’interno del clade A, nel sub-clade A1 (che raggruppa la maggioranza dei ceppi clinici) e nel sub-clade A2, associato agli animali e più sporadicamente ad infezioni umane. Nel 2012, EFSA ha redatto una linea guida per la valutazione della sicurezza di E. faecium usato come probiotico per gli animali, concludendo che i cepi appartenenti all’hospital-associated clade non devono essere utilizzati in nutrizione animale. Comunque, la distinzione tra le due sub-popolazioni è stata fatta utilizzando dati ottenuti prevalentemente da isolati umani e animali e solo un numero limitato di ceppi isolati dagli alimenti è stato considerato. Obiettivo di questa tesi di dottorato è stato quello di valutare la sicurezza di E. faecium negli alimenti fermentati, considerando ceppi isolati da formaggi artigianali e prodotti carnei e utilizzando sia tecniche di genomica che analisi fisiologiche. Nessuno dei ceppi alimentari studiati è risultato parte del clade A1, ma un ceppo isolato da un salame stagionato pronto al consumo ha rivelato diversi tratti tipici dei ceppi A1, tra cui particolari IS, transposase e geni di resistenza agli antibiotici. Questi risultati, così come altri dati, sottolineano la necessità di approfondire le conoscenze circa il ruolo dei ceppi di E. faecium isolati da alimenti come fattore di rischio per la salute umana. / Enterococcus faecium is commonly found in high numbers in ready to eat foods, being a member of the bacterial communities of a variety of fermented foods, including cheese and sausages, and is widely used as human and animal probiotic. However, this bacterial species is a leading cause of nosocomial infection, mainly endocarditis and urinary tract infections. Recent studies have demonstrated that E. faecium species consists of two very distinct clades: the hospital associated (HA) clade “A”, which includes most of the strains responsible for human infections, and the community associated (CA) clade “B”, that contains primarily human commensal isolates. Deeper analysis revealed a further split within clade A into sub-clade A1 (which groups the vast majority of clinical isolates), and sub-clade A2, associated with animals and sporadic human infections. In 2012, the European Food Safety Authority has issued a guideline for the safety assessment of E. faecium used as animal probiotics, concluding the strains belonging to the hospital-associated clade should not be used in animal nutrition. However, the differentiation of the two clades has been performed using data mainly deriving from human and animal isolates, and only a limited number of strains from the food chain were considered. Aim of this doctoral thesis was to assess the safety of E. faecium in fermented food, considering strains isolated from artisanal cheese and meat products, and using both whole genome-based techniques and physiological studies. None of the food isolates studied in this work belong to the epidemic clade A1, however a strain isolated from a ready to eat salami revealed several A1-specific traits, such as specific IS, transposases and antibiotic resistance genes. These results, as well as other data, underline the emergency of deeper understanding the role of E. faecium isolated from fermented foods as risk factor for human health.

Bacterial endophytes are the organisms that live inside the plant for a full or a part of their life cycle. Endophytic bacteria have captured the interest of agriculture industry due to their plant beneficial properties, such as synthesis of phytohormones, solubilization of soil nutrients, and alleviation of biotic and abiotic stresses. Several studies have reported that stress tolerant endophytic bacteria can work with a similar performance as non-stressed conditions when inoculated to the plants under stressed conditions. Combination of abiotic stresses such as salinity, drought and low nitrogen stress can have additive or agonistic effects on bacterial and plant growth, and their interactions. However, very few studies have reported the impact of combined stress on endophytic bacterial assisted plant growth promotion. Therefore, understanding the underlying mechanisms of endophytic bacterial assisted plant’s tolerance abiotic stresses may provide the means of better exploiting the beneficial abilities of endophytic bacteria in agricultural production. Thus, the aim of this thesis was to study the stress tolerance mechanisms, beneficial characteristics, and plant growth promotion characteristics of endophytic bacteria under individual and combined abiotic stresses. Transcriptome analysis of endophytic bacteria revealed that tolerance mechanisms to deal with one kind of stress is different than concurrent stresses. Salinity and drought stress largely modulated the genes involved in flagellar assembly and membrane transport, showing reduced motility under stress conditions to preserve the energy. Additionally, bacterial endophyte that can fix nitrogen was studied with maize plant growth promotion under drought and low nitrogen stress conditions. The results suggested that diazotrophic bacterial endophyte can promote plant growth under moderate individual and combined stress conditions. Plant growth promoting endophytic bacteria can be utilized as an efficient tool to increase crop production under individual and concurrent abiotic stresses.

La sfida nel 21esimo secolo è quella di fornire cibo e energia ad un mondo in continua crescita demografica e allo stesso tempo conservare l’ambiente. In questa tesi uno scenario alternativo di uso del suolo per la produzione di bioenergia è stato testato: le fasce tampone bioenergetiche. Considerate le problematiche ambientali legate al trilemma “cibo-energia-ambiente”, la struttura del Millennium Ecosystem Assessment sui servizi ecosistemici (SE) fornisce l’opportunità di esaminare l’impatto ambientale di questo nuovo scenario bioenergetico. In questa tesi ho mirato a determinare in che misura le colture bioenergetiche poliennali influenzino la fornitura multipla di SE quando coltivate come fasce tampone. Per raggiungere questo obiettivo, ho combinato una revisione sistematica della letteratura sui SE forniti da colture energetiche poliennali (CEP) con una prova sperimentale su fasce tampone bioenergetiche. Applicando una metodologia di attribuzione di punteggi agli impatti sui SE estratti dal materiale bibliografico raccolto, ho mostrato come coltivando le CEP lungo i margini dei campi coltivati esista una grande opportunità per sostenere la fornitura multipla di SE. La coltivazione delle CEP come fasce tampone adiacenti a campi agricoli può migliorare i SE di regolazione del clima, dell’acqua e della biodiversità, sostenere la salute del suolo e fornire biomassa dedicata alla produzione di bioenergia. Al contrario, la conversione di margini di campo di prati stabili ha mostrato un impatto netto negativo sulla fornitura multipla di SE. Tuttavia, due sono i principali svantaggi che sono stati individuati relativamente alla creazione e alla gestione delle fasce tampone bioenergetiche. Primo, diversi sono i fattori sito-specifici di tipo idro-pedologico lungo i margini dei campi che devono essere tenuti in considerazione poiché possono avere un impatto negativo sull’affrancamento delle colture e la loro produttività a medio-lungo termine. Secondo, riguardo la catena di approvvigionamento della biomassa, uno spazio di lavoro limitato per le macchine agricole è stato riconosciuto come principale inconveniente per le fasce tampone bioenergetiche rispetto alle CEP coltivate in pieno campo. Questo limite logistico di natura spaziale può inevitabilmente incrementare i tempi e le operazioni di taglio e raccolta della biomassa e quindi in ultima il consumo di combustili fossili. Grazie ad una prova sperimentale su fasce tampone bioenergetiche condotta in un terreno sabbioso-limoso con falda acquifera poco profonda contaminata da nitrati di origine agricola, si è dimostrato come fasce tampone coltivate con miscanto e salice siano in grado di intercettare e rimuovere i nitrati in falda (>60%) tanto quanto fasce tampone con specie avventizie. CEP come miscanto e salice, grazie ai loro apparati radicali profondi, hanno mostrato essere in grado di promuovere delle relazioni pianta-suolo-microorganismi lungo l’intero profilo del suolo utili ai fini ambientali delle fasce tampone bioenergetiche. Infatti, negli strati più profondi, una maggiore biomassa radicale ha portato le CEP a superare le specie avventizie in termini di rimozione biologica dei nitrati dal suolo e mitigazione potenziale dei gas serra. Inoltre, i risultati relativi alla produzione di biomassa e le asportazioni di N legata alla fase di raccolta hanno confermato ulteriormente come la coltivazione di CEP lungo i corsi d’acqua sia una strategia win-win: produzione di biomassa e protezione dell’ambiente. In conclusione, il potenziale rivelato dalle CEP in termini di fornitura multipla di SE suggerisce che la loro coltivazione, come elementi paesaggistici perenni in posizioni strategiche all'interno di paesaggio agricolo, è un'opzione promettente per promuovere l'intensificazione ecologicamente sostenibile degli agroecosistemi. / The 21st century will challenge agriculture to feed and fuel a growing world while conserving the environment. In this thesis an alternative bioenergy land use scenario to the conversion of marginal land has been tested: the bioenergy buffers. Given the environmental issues related to “food-energy-environment” trilemma, the Millennium Ecosystem Assessment framework on ES provides an opportunity to examine the environmental impacts of this new bioenergy land use scenario. In this thesis I aimed to determine to what extent do the perennial bioenergy crops affect the delivery of multiple ES when cultivated as bioenergy buffers. To reach this aim, I combined a systematic revision of literature on ES provided by perennial bioenergy crops with a field experiment on bioenergy buffers. Applying an impact scoring methodology to the effects on ES extracted from literature, I showed that, cultivating perennial bioenergy crops along field margins of former croplands offer a great opportunity to sustain the provision of multiple ES. The cultivation of perennial bioenergy crops on field margins can improve climate, biodiversity and water regulation services, sustain soil health and provide biomass for energetic purposes. On the contrary, grassland conversion showed a net negative impact on multiple ES provision. Nevertheless, I found two main shortcomings related to bioenergy buffers establishment and management. First, several site-specific factors along field margins must be taken into account, because they can affect crop establishment and buffers long-term productivity. Second, regarding to biomass supply chain, a limited working space for the farm machinery operations has been recognized as the main disadvantages of bioenergy buffers compared to large-scale bioenergy plantations. This spatial logistics constraint may inevitably increase harvest and collection operation times and fossil fuel consumption. Conducting a field experiment with bioenergy buffers in a nitrate-enriched shallow groundwater, I showed that miscanthus and willow buffers are able to efficiently intercept and remove from groundwater the incoming NO3-N as much as buffer strips with spontaneous species. Yet, due to their deep rooting systems, bioenergy buffers promote significant plant-microbial linkages along the soil profile. At deeper soil layers, a higher fine root biomass led perennial bioenergy crops to outperform patches of adventitious vegetation in terms of biological N removal from soil and belowground GHG mitigation potential. The results on biomass production and N removal via harvesting further confirmed that the cultivation of perennial bioenergy crops along watercourses is an effective win-win strategy: biomass production and protection of the environment. In conclusion, the revealed potential of perennial bioenergy crops on multiple ES provision implies that their cultivation as perennial landscape elements in strategic locations within landscape is a promising option to promote the ecological sustainable intensification of agroecosystems.

La Sindrome da Affaticamento Cronico/Encefalomielite Mialgica (CFS/ME), è una grave malattia multisistemica caratterizzata da anomalie immunologiche e disfunzioni del metabolismo energetico. Recenti evidenze suggeriscono l’esistenza di una forte correlazione tra disbiosi e condizione patologica. La presente ricerca ha analizzato la composizione del microbiota intestinale ed orale in pazienti con CFS/ME rispetto a controlli sani e ha determinato se eventuali differenze osservate potrebbero essere utili in futuro per l'identificazione di biomarcatori diagnostici. La composizione batterica fecale e salivare dei pazienti con CFS/ME è stata studiata mediante sequenziamento Illumina degli ampliconi del gene 16S rRNA. Il microbiota fecale dei pazienti con CFS/ME ha mostrato una significativa riduzione di Lachnospiraceae, in particolare di Anaerostipes, rispetto ai gruppi di soggetti senza CFS/ME e un incremento di Phascolarctobacterium faecium e unclassified Ruminococcus. Bacteroides vulgatus, unclassified Bacteroides, Bacteroides uniformis e unclassified Barnesiella sono risultati significativamente più abbondanti nei pazienti con CFS/ME. Il microbiota orale dei pazienti con CFS/ME ha mostrato un aumento significativo di Rothia dentocariosa. Il profilo metabolico fecale di un sottogruppo di pazienti con CFS/ME ha mostrato un aumento complessivo di SCFA e di derivati dell'indolo rispetto ai gruppi non CFS/ME, suggerendo un aumento dei processi di fermentazione. I nostri risultati supportano l'ipotesi autoimmune per la CFS/ME e se saranno confermati da studi più ampi, le differenze rilevate nei profili microbici dei pazienti CFS/ME potrebbero essere utilizzate come markers per una diagnosi più accurata e per lo sviluppo di strategie terapeutiche specifiche. / The Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis (CFS/ME), is a severe multisystemic disease characterized by immunological abnormalities and dysfunction of energy metabolism. Recent evidence suggest that there is a strong correlation between dysbiosis and pathological condition. The present research investigated the composition of the intestinal and oral microbiota in CFS/ME patients in comparison to healthy controls and determined whether any observed differences could be useful for the identification of diagnostic biomarkers. The fecal and salivary bacterial composition in CFS/ME patients was investigated by Illumina sequencing of 16S rRNA gene amplicons. The fecal microbiota of CFS/ME patients showed a significant reduction of Lachnospiraceae, particularly Anaerostipes, compared to the non-CFS/ME groups, and an increase of Phascolarctobacterium faecium and unclassified Ruminococcus. Bacteroides vulgatus, unclassified Bacteroides, Bacteroides uniformis and unclassified Barnesiella resulted significantly more abundant in CFS/ME patients. The oral microbiota of CFS/ME patients showed a significant increase of Rothia dentocariosa. The fecal metabolic profile of a subgroup of CFS/ME patients revealed an overall increase of SCFAs and indole derivatives compared to the non-CFS/ME groups, suggesting an increase in the fermentation processes. Our results support the autoimmune hypothesis for CFS/ME condition and if confirmed by larger studies, the differences detected in the microbial profiles of CFS/ME patients may be used as markers for a more accurate diagnosis and for the development of specific therapeutic strategies.