Die Rheumatoide Arthritis ist eine Autoimmunerkrankung, die mit grundlegenden Veränderungen im CD4+ T-Zellpool einhergeht. Viele Studien konnten zeigen, dass die Gruppe der T-Helferzellen bei erkrankten Personen vermehrt Anzeichen von replikativer Seneszenz und das adaptive Immunsystem deutliche Zeichen der Immunoseneszenz aufweisen. Als zum Teil ursächlich hierfür konnte ein reduzierter Thymusoutput festgestellt werden. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, aufbauend auf Erkenntnissen von Six und Kollegen anhand einer Lymphozytenvorläuferzelle, die im peripheren Blut zirkuliert, in vivo in der Lage ist, den Thymus zu besiedeln und sich in reife T-Zellen zu entwickeln, den Thymusinput abzuschätzen, um eine defiziente Thymusbesiedlung als eventuelle Ursache des reduzierten Thymusoutput festzustellen. Hierzu wurde das Blut von 28 Patienten mit Rheumatoider Arthritis und altersentsprechenden gesunden Kontrollen mittels Durchflusszytometrie auf mehrere relevante reife T-Helferzellpopulationen, naive CD4+ T-Zellen und benannte lymphozytäre Vorläuferzelle untersucht. Es konnten dann direkte Vergleiche des prozentualen Anteils bestimmter T-Helferzellgruppen zwischen Erkrankten und Gesunden gezogen sowie Korrelationen verschiedener Zellgruppen untereinander hergestellt werden. Die gewonnenen Ergebnisse wurden mit der hierzu vorliegenden Literatur verglichen und diskutiert.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

The development and function of T helper (Th) cells and regulatory T cells (Tregs) are plastic processes that are regulated by cytokines. In our project we first analyzed the effect of different cytokines on the development of induced (i) Tregs. It has been demonstrated that iTregs arise from CD4+ CD25- T cells upon stimulation with alloantigen in the presence of transforming growth factor β (TGF-β). The development of these Tregs and their proliferation were inhibited by interleukin (IL)-4 and IL-12. The aquired results also demonstrated distinct responses of naturally occuring (n) Tregs and iTregs to the regulatory action of IL-4 and an opposite role of IL-4 in maintenance of nTregs and iTregs phenotype. An important role in the induction of T cell subsets may play also mesenchymal stem cells (MSCs) which can, under specific conditions, produce TGF-β and IL-6. Depending on the current production of TGF-β or IL-6, MSCs can qualitatively regulate the ration between Tregs and Th17 cells. Anti-inflammatory Tregs and pro-inflammatory Th17 cells are induced upon stimulation in the presence of TGF-β and TGF-β and IL-6, respectively. In addition to our previous work we studied the role of IL-12 in the development of Tregs and Th17 cells. It was shown that Treg and also Th17 cell differentiation was...

The clinical efficacy of adoptive T cell therapies including CAR T therapy are limited by poor in vivo persistence and moderate anti-tumor efficacy. According to the literature, metabolism plays a critical role in the phenotypic state and fate of T cells during antigen-driven expansion. During different stages of a T cell life cycle, the predominant pathway used for metabolism changes. Naïve T rely on oxidative phosphorylation, but as the T cells becomes activated, their metabolic profile switches to become more reliant on glycolysis. Most T cells become terminally differentiated and become senescent once they have performed their cytotoxic function. A minority of the activated T cells gradually start to rely on oxidative phosphorylation once again and become memory T cells. Memory T cells can become either effector memory or central memory T cells. These memory T cells, specifically central memory T cells, are the key to T cells persistence during both ex vivo and in vivo expansion and following disappearance of the antigenic stimulus. Since the metabolic profile of the T cells plays a critical role in its differentiation state, we tested the hypothesis that inhibitors of intermediary metabolism could promote a metabolic profile that is more desirable for the optimal phenotype consistent with the memory phenotype that would favor persistence in spite of strong activation signals. The four inhibitors screened were: a PFKFB3 inhibitor, an inhibitor of a key step in glycolysis; ibrutinib, an inhibitor of Bruton’s tyrosine kinase; idelalisib, an inhibitor of PI3K subunit; and duvelisib, an inhibitor of PI3K and PI3K gamma subunits. To test this hypothesis, T cells were cultured with or without each compound and then the analysis included: phenotypic analysis by flow cytometry, quantitative analysis by counting cells with ethidium bromide acridine orange, and metabolic profiling by the Seahorse assay. This study was conducted using T cells from a human healthy volunteer that were collected by apheresis. T cells were cultured in a G-Rex plate for 15 days with complete media supplemented with recombinant human IL-2 (30 U/mL). Cells were activated on day 1 and day 8 by the addition of anti-CD3/CD28 beads and test metabolic inhibitor compounds were added every 4 days. T cells cultured with idelalisib, duvelisib, and ibrutinib had increased expansion (approximately50-fold: idelalisib/ duvelisib and 21-fold ibrutinib) when compared to control (cells with beads alone) with only 6-fold expansion. Phenotypic analysis performed using flow cytometry showed an increased percentage of CD27+ CD28+ in the CD8+ and CD4+ T cell cell populations in the idelalisib treated group and decreased number of senescent T cells that are double negative for CD27 and CD28. Consistent with our hypothesis, metabolic analysis showed that cells treated with idelalisib and duvelisib were more reliant on oxidative phosphorylation, rather than glycolysis as compared to the control cultures. Cells treated with duvelisib also showed an increased spare respiratory capacity (SRC), which is associated with more efficacious memory T cells. The results of these studies show that metabolism plays a critical role in the long-term survival of T cells. We demonstrate that inhibiting intermediary metabolism, specifically inhibiting PI3K, favorably alters the metabolic state of the T cells leading to increased cell numbers and T cells with a phenotype consistent with enhanced ex vivo and in vivo proliferation and persistence.

A lectina ArtinM, extraída de sementes de Artocarpus heterophyllus e caracterizada como um homotetrâmero constituído de subunidades de 16 kDa, tem alta afinidade de ligação a manotriose Man? 1-3 [Man? 1-6] Man, que constitui o core de N-glicanas. ArtinM é dotada de interessantes propriedades biológicas: (1) ativa neutrófilos a partir do reconhecimento de N-glicanas dos receptores CXCR2 e TLR2; (2) induz a desgranulação de mastócitos por interagir com N-glicanas de Fc?R ou com N-glicanas de IgE ligadas a Fc?R; (3) estimula a produção de IL-12, por reconhecer N-glicanas contidas no ectodomínio de TLR2 da superfície de células apresentadoras de antígeno (APCs); (4) exerce atividade imunomoduladora, que direciona o padrão de resposta para o perfil Th1; (5) confere resistência a infecções por patógenos intracelulares, como Paracoccidioides brasiliensis, Leishmania amazonensis e Leishmania major, Neospora caninum e Candida albicans Células T CD4+ participam de funções essenciais do sistema imune; durante o estabelecimento de uma resposta imune, podem ser desenvolvidas subpopulações de células T CD4+ adequadas para gerar respostas eficientes de combate a patógenos, manutenção da tolerância e regulação da imunidade. A ativação das células T CD4+ depende de um primeiro sinal, desencadeado pelo complexo TCR/CD3, e de um segundo sinal, oriundo de moléculas coestimulatórias como CD28. A ativação e expansão de células T CD4+ são limitadas pela ação de moléculas inibitórias, principalmente por CTLA-4. Lectinas podem ativar as células T, sendo a fitohemaglutinina (PHA) e a Concanavalin A (ConA) os exemplos mais conhecidos. Além disso, está bem caracterizado que o alvo de reconhecimento de ConA localiza-se no complexo TCR/CD3. No presente estudo buscou-se caracterizar os efeitos da lectina ArtinM sobre células T CD4+ murinas e investigar os possíveis mecanismos responsáveis pelos efeitos exercidos. Foram avaliados, inicialmente, os efeitos diretos de ArtinM sobre as células T CD4+, no que se refere à produção de citocinas, expressão de moléculas coestimulatórias e inibitórias e indução de diferenciação celular. Passou-se então à identificação de possíveis receptores de superfície reconhecidos por ArtinM e responsáveis pelo desencadeamento da ativação celular. Finalmente, buscou-se apontar moléculas sinalizadoras envolvidas nos efeitos diretos de ArtinM. A primeira evidência da interação direta de ArtinM com células T CD4+ foi proporcionada por aglutinação celular. Uma curva dose-resposta revelou que 5µg/ml foi a melhor concentração para adquirir significativa produção de citocinas Th1 (IL-2 e IFN-?) e Th17 (IL-6 e IL-17A) pelas células T CD4+. O estímulo com a concentração ótima de ArtinM mostrou que após 12 horas de incubação houve um significativo aumento nos níveis de IL-2, IFN-?, IL-6 e IL-17A no sobrenadante celular; persistindo no curso de 48 horas de observação. A secreção concomitante de IFN-? e IL-17A motivou a avaliação, por citometria de fluxo, da ocorrência de dupla marcação intracelular dessas citocinas. O estímulo, por 24 horas, com ArtinM, levou a importante aumento da frequência de células duplo-positivas para IFN-? e IL-17. Uma vez comprovado pelo padrão de citocinas secretadas que ArtinM promove a ativação das células T CD4+, investigou-se a expressão das moléculas CD25 e CTLA-4. ArtinM aumentou a expressão de ambas as moléculas, de maneira dose-dependente. Curiosamente, a detecção tanto de CD28, como de CTLA-4, foi precoce e persistente, diferindo do padrão temporal de expressão proporcionado por outros ativadores de células T CD4+. Com vistas a determinar o mecanismo através do qual ArtinM atua nas células T CD4+, alvos potenciais de reconhecimento foram ensaiados: CD3?, CD3??, CD28, CD45 e CD4. Esses receptores foram selecionados com base em predição de potenciais sítios Nglicosilados. Dessa forma, anticorpos específicos para essas moléculas foram utilizados para analisar a sua capacidade de inibir a atividade de ArtinM de induzir as células T CD4+ a produzir citocinas, como IL-2, IFN-?, IL-6 e IL-17A. Apenas o anticorpo anti-CD3?? foi capaz de impedir a secreção das citocinas induzidas por ArtinM. Além disso, esse anticorpo inibiu a marcação de células T CD4+ por ArtinM biotinilada. Esses dados indicam que ArtinM exerce sua atividade sobre células T CD4+ através do reconhecimento de glicanas na cadeia ? do receptor CD3, não excluindo-se, entretanto, a ocorrência da interação de ArtinM com outras glicoproteínas na superfície de linfócitos T CD4+. Também foi verificado que ArtinM possui alta especificidade por glicanas na superfície dessas células, pois foram necessárias elevadas concentrações de manotriose para inibir em 50% a ligação de ArtinM à superfície das células T CD4+. Através do uso de inibidores específicos para moléculas sinalizadoras, constatou-se que PI3K, PTK, p42/44MAPK, p38MAPK, JNK e PKC estão implicadas na sinalização para a produção das citocinas de perfis Th1 e Th17, induzida por ArtinM. Esse conjunto de resultados indica que ArtinM é um potente e rápido ativador de células T CD4+. A ativação celular induzida por ArtinM está relacionada com a ligação à cadeia ? do receptor CD3 e se associa à alta expressão de moléculas coestimuladoras e inibitórias. Ademais, demonstrou-se que ArtinM promove a diferenciação das células T CD4+ naive em células Th1 e Th17, utilizando moléculas sinalizadoras que são conhecidas como críticas para a indução de citocinas que caracterizam essas subpopulações celulares. / The lectin ArtinM, extracted from seeds of Artocarpus heterophyllus and characterized as a homotetramer consisted of 16 kDa subunits, has high binding affinity to the manotriose Man? 1-3 [Man? 1-6] Man, which is the core of N-glycans. ArtinM is endowed with interesting biological properties: (1) it activates neutrophils through the recognition of Nglycans attached to CXCR2 and TLR2 receptors; (2) induces degranulation of mast cells by interacting with N-glycans of Fc?R or to N-glycans of IgE bound to Fc?R; (3) stimulates the production of IL-12 through the recognition of N-glycans of the TLR2 ectodomain, expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs); (4) exerts immunomodulatory activity, which accounts for Th1 immunity (5) confers resistance to intracellular pathogens, such as P. brasiliensis, Leishmania amazonensis and Leishmania major, Neospora caninum e Candida albicans. CD4+ T cells participate in essential functions of the immune system. During the development of an immune response, CD4+ T cells are activated and give origin to subpopulations of cells that are suitable for establishing effective responses to combat pathogens, for tolerance maintenance, and for adequate immuneregulation. The activation of CD4+ T cells depends on a first signal, triggered by the TCR/CD3 complex, and a second signal, provided by costimulatory molecules. The activation and expansion of CD4+ T cells is limited by the action of inhibitory molecules. Lectins may activate T cells, and Phytohemagglutinin (PHA) and Concanavalin A (ConA) are the best know examples. Furthermore, it is well characterized that the target for ConA recognition is localized in the TCR/CD3 complex. The present study was delineated to characterize the effects of the lectin ArtinM on murine CD4+ T cells and to investigate the possible mechanisms accounting for the observed effects. It was investigated the ArtinM direct effects on CD4+ T cells, concerning its ability to induce the production of cytokines, the expression of costimulatory and inhibitory molecules and cell differentiation. In addition, the possible surface receptors recognized by ArtinM and responsible for triggering cell activation were also assessed. Finally, signaling molecules involved in the direct effects of ArtinM were approached. The first evidence of direct interaction of ArtinM with CD4+ T cells was provided by cell agglutination. A dose-response curve has revealed that 5µg/ml was the best ArtinM concentration to achieve significant production of Th1 (IL-2 and IFN-?) and Th17 (IL-6 and IL-17A) cytokines by TCD4+ cells. Stimulus with the optimum ArtinM concentration has showed that after 12 hours incubation there was a significant augmentation of IL-2, IFN-?, IL- 6 and IL-17A levels in the cell supernatant; which has persisted in the course of 48 hours observation. The concomitant secretion of IFN-? and IL-17A led us to evaluate, by flow cytometry, the intracellular expression of these cytokines. After 24 hours stimulation with ArtinM, there was a significant increase in the frequency of cells IFN-?+IL-17+. Once the cytokines detection indicated that CD4+ T cells have been activated by ArtinM, the expression of CD25 and CTLA-4 molecules was assessed. ArtinM increased the expression of both molecules, in a dose-dependent manner. Interestingly, both cell surface molecules, CD25 and CTLA-4, were early and persistently detected a temporal pattern that is distinct from the provided by other inducers of CD4+ T cell activation. In order to determine the mechanism by which ArtinM acts on CD4+ T cells, potential targets of recognition were assessed: CD3??, CD3?, CD28, CD45 and CD4. These receptors were selected on the basis of prediction of N-glycosylation sites. Specific antibodies for these molecules were assayed regarding their ability to inhibit the ArtinM of inducing TCD4+ cells to produce cytokines, such as IL-2, IFN-?, IL-6 and IL-17A. Only anti-CD3 antibody was able to prevent the cytokines secretion induced by ArtinM. In addition, anti-CD3 antibody has inhibited the T CD4+ cell labeling by biotynil-ArtinM. These data indicate that ArtinM exerts its biological activity on T CD4+ cells through recognition of CD3 receptor ? chain glycans, without excluding the occurrence of ArtinM interactions with other glycoproteins on the surface of T CD4+ lymphocytes. The interaction of ArtinM with glycans at the surface of these cells was found to occur with great specificity, since high concentrations of the manotriose - Man? 1-3 [Man? 1-6] Man - were required to inhibit the binding. By using specific inhibitors of signaling molecules, we have found that PI3K, PTK and p42/44MAPK are relevant cytokine production profiles of Th1 and Th17 cells after stimulation with ArtinM. All toghether, these results indicate that ArtinM is a potent and rapid activator of CD4+ T cells. The activation induced by ArtinM is triggered by its binding to the CD3 receptor ? chain, which induces high expression of costimulator and inhibitory molecules. Moreover, it was demonstrated that ArtinM promotes the differentiation of naive CD4+ T cells into Th1 and Th17 cells by committing signaling molecules that are known as critical for the induction of cytokines that characterize these subpopulations of cells.

As células T regulatórias (Tregs) são essenciais para a manutenção da tolerância periférica, prevenção de doenças autoimunes e limitantes nas doenças inflamatórias crônicas. Além disso, essas células exercem um papel fundamental no controle da rejeição de transplantes. Diferentes protocolos mostraram que é possível obter Tregs a partir de células T naive CD4+ in vitro. Para tal, é consenso que o TGF-? e a interleucina-2 (IL-2) são capazes de direcionar as células T naive CD4+ a se tornarem regulatórias após um estímulo antigênico (anti-CD3/CD28). Nosso grupo recentemente notou que, durante a imunomodulação de linfócitos T pelas células estromais mesenquimais (CTMs), estas eram capazes de produzir adenosina que, por sua vez, participa do processo de imunorregulação. Outros trabalhos indicam que as CTMs suprimem a proliferação dos linfócitos T pela geração de Tregs e que as CTMs induzem a geração de Tregs através da regulação negativa da via TCR e da via AKTmTOR. Evidências apontam que a adenosina pode atuar regulando negativamente a via mTOR. Portanto, acredita-se que a adenosina possa participar do processo de geração de Tregs através da modulação da via mTOR. Além disso, estudos recentes indicam que a ativação de receptores de adenosina, mais especificamente A2a, com agentes agonistas, leva ao aumento da produção de células Tregs, enquanto que a utilização de agentes antagonistas destes receptores leva à diminuição da diferenciação de Tregs. Porém, estes estudos mostram a geração de Tregs a partir de células T naive de camundongos. Visto a grande importância das Tregs no contexto imunológico, a produção eficiente de Tregs in vitro tem importância fundamental para o desenvolvimento de novos protocolos terapêuticos para o tratamento de doenças autoimunes e no combate à rejeição de transplantes. Assim, o objetivo central deste trabalho foi avaliar a participação de agonistas e antagonistas de receptores de adenosina na indução de células T regulatórias geradas in vitro (iTreg) pela ativação de células T CD4+ naive isoladas de sangue de cordão umbilical (SCU) humano. Para isso, células mononucleares foram isoladas de bolsas de SCU e as células T naive foram isoladas imunomagnéticamente. Essas células foram ativadas com beads ligadas a anticorpos anti-CD2/CD3/CD28 e cultivadas por cinco dias na presença de IL-2 e diferentes concentrações de drogas agonistas e antagonistas de receptores de adenosina. Em seguida, foram avaliados os principais marcadores de células T regulatorias por meio de citometria de fluxo e o meio de cultura foi coletado ao final da geração para quantificação de citocinas. Além disso, o RNA total foi extraído de todas as condições de cultivo para a análise da expressão de genes envolvidos na geração e desenvolvimento das Tregs, por PCR quantitativo. O potencial de supressão de células T efetoras também foi avaliado. / Regulatory T cells (Tregs) are essential for the maintenance of peripheral tolerance, prevention of autoimmune and limiting diseases in chronic inflammatory diseases. In addition, these cells play a key role in the control of transplant rejection. Different protocols have shown that it is possible to obtain Tregs from naive CD4+ T cells in vitro. To this end, there is consensus that TGF-? and interleukin-2 (IL-2) are capable of directing the naive CD4 + T cells to become regulatory following an antigenic stimulus (anti-CD3/CD28).. Our group recently noted that during the immunomodulation of T lymphocytes by mesenchymal stromal cells (MSCs), they were able to produce adenosine which in turn participates in the immunoregulation process. Other studies indicate that MSCs suppress the proliferation of T lymphocytes by generation of Tregs and that MSCs induce generation of Tregs by downregulation of the TCR pathway and the AKT-mTOR pathway. Evidence indicates that adenosine may act by downregulating the mTOR pathway. Therefore, it is believed that adenosine may participate in the generation of Tregs by modulating the mTOR pathway. In addition, recent studies indicate that activation of adenosine receptors, more specifically A2a, with agonist agents, leads to increased production of Treg cells, whereas the use of antagonistic agents of these receptors leads to a decrease in Treg differentiation.. However, these studies show the generation of Tregs from naive T cells of mice. In view of the great importance of Tregs in the immunological context, the efficient production of Tregs in vitro is of fundamental importance for the development of new therapeutic protocols for the treatment of autoimmune diseases and in the fight against transplant rejection. Thus, the central objective of this study was to evaluate the participation of adenosine receptor agonists and antagonists in induction of regulatory T cells generated in vitro (iTreg) by the activation of naive CD4+ T cells isolated from human umbilical cord blood (SCU). For this, mononuclear cells were isolated from SCU and naive T cells were immunomagnetic isolated. These cells were activated with beads bound to anti-CD2/CD3/CD28 antibodies and cultured for five days in the presence of IL-2 and different concentrations of agonist drugs and antagonists of adenosine receptors. Next, the major regulatory T-cell markers were assessed by flow cytometry and the culture medium was collected at the end of the generation for quantification of cytokines. In addition, total RNA was extracted from all culture conditions for the analysis of the expression of genes involved in the generation and development of Tregs by quantitative PCR. The potential for suppression of effector T cells was also evaluated.

A criação e atualização de bases de conhecimentos com dados que comprovem, ou não, a eficácia de métodos, técnicas ou produtos de software podem ser facilitadas por meio de estudos experimentais e suas replicações em diferentes contextos, para que a base de conhecimento possa ser ampliada e consolidada. Porém, a condução dessas replicações gera uma grande quantidade de dados que devem ser coletados e armazenados, e posteriormente analisados, sendo que a gestão dessas informações de forma manual é propensa a erros. Nesse contexto, o Projeto Readers - um projeto de pesquisa colaborativa formado por pesquisadores brasileiros e norte-americanos - no qual este trabalho está inserido, teve como objetivos principais desenvolver, validar, empacotar e consolidar uma base de conhecimento sobre algumas técnicas, como por exemplo a PBR (Perspective Based Reading), que é uma técnica de leitura para detecção de defeitos em artefatos de software. Com as várias replicações de estudos experimentais que foram conduzidas no âmbito desse projeto, em particular replicações do Experimento PBR (Basili et al., 1996), ficou evidenciada a necessidade de apoio computacional em diversas etapas do processo de experimentação. Sendo assim, neste trabalho foi definida, modelada e implementada a ferramenta ExpVVT com a finalidade de automatizar as atividades de Planejamento e Operação do Experimento PBR. A ferramenta foi implementada com base em uma estrutura de meta-tabelas, o que facilita possíveis alterações no âmbito desse experimento. Salienta-se que o Pacote de Laboratório, o qual contém todos os artefatos necessários para que um estudo experimental possa ser replicado, também fica armazenado eletronicamente, com o apoio da ferramenta, o que facilita o registro de sua evolução. O uso da ferramenta foi explorado simulando-a com os dados de uma das replicações do Experimento PBR que foi conduzida no contexto do Projeto Readers. Embora tenha sido apenas uma simulação, pode-se perceber o auxílio que essa ferramenta pode trazer para futuras replicações desse experimento, reduzindo os custos associados com todo material necessário para uma replicação e também guiando os participantes do experimento, para que as atividades sejam feitas de forma mais controlada. / The creation and update of knowledge bases with data that provide evidences of the efficacy, or non-efficacy, of software methods, techniques or products can be facilitated by experimental studies and their replications in diverse contexts, so that the knowledge base can grow and be consolidated. However, replications generate great amount of data which must be collected, stored, and on later, analyzed, making the non-automated management of such information very error-prone. In this context, the Readers Project ? a collaborative research project formed by Brazilian and North-American researchers ? which this work is part of, has had as main goals the development, validation, packaging and consolidation of a knowledge base on some techniques, such as PBR (Perspective Based Reading), which is a reading technique used to defect detection in software artifacts. With the several replications of experimental studies that were conducted along this project, in particular the replications of the PBR Experiment (Basili et al., 1996), it has become evident the need of computational support in several activities of the experimentation process. Therefore, in this work, the ExpVVT tool was defined, designed and implemented with the goal to automate the Planning and Operation activities of the PBR Experiment. The tool was implemented based on a meta-table structure, which facilitates possible evolutions in this experiment context. It is emphasized that the Lab Package, which contains all the necessary artifacts needed to replicate an experimental study, is also stored electronically, with the tool support, which facilitates the tracing of its evolution. The tool?s use was explored simulating with data of some of the PBR Experiment replications which were conducted at the Readers Project context. Although just a single simulation took place, it can already be noticed the support that the tool can provide to future replications of this experiment, reducing the costs associated with every necessary material in a replication and also guiding the experiment participants, so that the activities are made in a more controlled way.

A lectina ArtinM, extraída de sementes de Artocarpus heterophyllus e caracterizada como um homotetrâmero constituído de subunidades de 16 kDa, tem alta afinidade de ligação a manotriose Man? 1-3 [Man? 1-6] Man, que constitui o core de N-glicanas. ArtinM é dotada de interessantes propriedades biológicas: (1) ativa neutrófilos a partir do reconhecimento de N-glicanas dos receptores CXCR2 e TLR2; (2) induz a desgranulação de mastócitos por interagir com N-glicanas de Fc?R ou com N-glicanas de IgE ligadas a Fc?R; (3) estimula a produção de IL-12, por reconhecer N-glicanas contidas no ectodomínio de TLR2 da superfície de células apresentadoras de antígeno (APCs); (4) exerce atividade imunomoduladora, que direciona o padrão de resposta para o perfil Th1; (5) confere resistência a infecções por patógenos intracelulares, como Paracoccidioides brasiliensis, Leishmania amazonensis e Leishmania major, Neospora caninum e Candida albicans Células T CD4+ participam de funções essenciais do sistema imune; durante o estabelecimento de uma resposta imune, podem ser desenvolvidas subpopulações de células T CD4+ adequadas para gerar respostas eficientes de combate a patógenos, manutenção da tolerância e regulação da imunidade. A ativação das células T CD4+ depende de um primeiro sinal, desencadeado pelo complexo TCR/CD3, e de um segundo sinal, oriundo de moléculas coestimulatórias como CD28. A ativação e expansão de células T CD4+ são limitadas pela ação de moléculas inibitórias, principalmente por CTLA-4. Lectinas podem ativar as células T, sendo a fitohemaglutinina (PHA) e a Concanavalin A (ConA) os exemplos mais conhecidos. Além disso, está bem caracterizado que o alvo de reconhecimento de ConA localiza-se no complexo TCR/CD3. No presente estudo buscou-se caracterizar os efeitos da lectina ArtinM sobre células T CD4+ murinas e investigar os possíveis mecanismos responsáveis pelos efeitos exercidos. Foram avaliados, inicialmente, os efeitos diretos de ArtinM sobre as células T CD4+, no que se refere à produção de citocinas, expressão de moléculas coestimulatórias e inibitórias e indução de diferenciação celular. Passou-se então à identificação de possíveis receptores de superfície reconhecidos por ArtinM e responsáveis pelo desencadeamento da ativação celular. Finalmente, buscou-se apontar moléculas sinalizadoras envolvidas nos efeitos diretos de ArtinM. A primeira evidência da interação direta de ArtinM com células T CD4+ foi proporcionada por aglutinação celular. Uma curva dose-resposta revelou que 5µg/ml foi a melhor concentração para adquirir significativa produção de citocinas Th1 (IL-2 e IFN-?) e Th17 (IL-6 e IL-17A) pelas células T CD4+. O estímulo com a concentração ótima de ArtinM mostrou que após 12 horas de incubação houve um significativo aumento nos níveis de IL-2, IFN-?, IL-6 e IL-17A no sobrenadante celular; persistindo no curso de 48 horas de observação. A secreção concomitante de IFN-? e IL-17A motivou a avaliação, por citometria de fluxo, da ocorrência de dupla marcação intracelular dessas citocinas. O estímulo, por 24 horas, com ArtinM, levou a importante aumento da frequência de células duplo-positivas para IFN-? e IL-17. Uma vez comprovado pelo padrão de citocinas secretadas que ArtinM promove a ativação das células T CD4+, investigou-se a expressão das moléculas CD25 e CTLA-4. ArtinM aumentou a expressão de ambas as moléculas, de maneira dose-dependente. Curiosamente, a detecção tanto de CD28, como de CTLA-4, foi precoce e persistente, diferindo do padrão temporal de expressão proporcionado por outros ativadores de células T CD4+. Com vistas a determinar o mecanismo através do qual ArtinM atua nas células T CD4+, alvos potenciais de reconhecimento foram ensaiados: CD3?, CD3??, CD28, CD45 e CD4. Esses receptores foram selecionados com base em predição de potenciais sítios Nglicosilados. Dessa forma, anticorpos específicos para essas moléculas foram utilizados para analisar a sua capacidade de inibir a atividade de ArtinM de induzir as células T CD4+ a produzir citocinas, como IL-2, IFN-?, IL-6 e IL-17A. Apenas o anticorpo anti-CD3?? foi capaz de impedir a secreção das citocinas induzidas por ArtinM. Além disso, esse anticorpo inibiu a marcação de células T CD4+ por ArtinM biotinilada. Esses dados indicam que ArtinM exerce sua atividade sobre células T CD4+ através do reconhecimento de glicanas na cadeia ? do receptor CD3, não excluindo-se, entretanto, a ocorrência da interação de ArtinM com outras glicoproteínas na superfície de linfócitos T CD4+. Também foi verificado que ArtinM possui alta especificidade por glicanas na superfície dessas células, pois foram necessárias elevadas concentrações de manotriose para inibir em 50% a ligação de ArtinM à superfície das células T CD4+. Através do uso de inibidores específicos para moléculas sinalizadoras, constatou-se que PI3K, PTK, p42/44MAPK, p38MAPK, JNK e PKC estão implicadas na sinalização para a produção das citocinas de perfis Th1 e Th17, induzida por ArtinM. Esse conjunto de resultados indica que ArtinM é um potente e rápido ativador de células T CD4+. A ativação celular induzida por ArtinM está relacionada com a ligação à cadeia ? do receptor CD3 e se associa à alta expressão de moléculas coestimuladoras e inibitórias. Ademais, demonstrou-se que ArtinM promove a diferenciação das células T CD4+ naive em células Th1 e Th17, utilizando moléculas sinalizadoras que são conhecidas como críticas para a indução de citocinas que caracterizam essas subpopulações celulares. / The lectin ArtinM, extracted from seeds of Artocarpus heterophyllus and characterized as a homotetramer consisted of 16 kDa subunits, has high binding affinity to the manotriose Man? 1-3 [Man? 1-6] Man, which is the core of N-glycans. ArtinM is endowed with interesting biological properties: (1) it activates neutrophils through the recognition of Nglycans attached to CXCR2 and TLR2 receptors; (2) induces degranulation of mast cells by interacting with N-glycans of Fc?R or to N-glycans of IgE bound to Fc?R; (3) stimulates the production of IL-12 through the recognition of N-glycans of the TLR2 ectodomain, expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs); (4) exerts immunomodulatory activity, which accounts for Th1 immunity (5) confers resistance to intracellular pathogens, such as P. brasiliensis, Leishmania amazonensis and Leishmania major, Neospora caninum e Candida albicans. CD4+ T cells participate in essential functions of the immune system. During the development of an immune response, CD4+ T cells are activated and give origin to subpopulations of cells that are suitable for establishing effective responses to combat pathogens, for tolerance maintenance, and for adequate immuneregulation. The activation of CD4+ T cells depends on a first signal, triggered by the TCR/CD3 complex, and a second signal, provided by costimulatory molecules. The activation and expansion of CD4+ T cells is limited by the action of inhibitory molecules. Lectins may activate T cells, and Phytohemagglutinin (PHA) and Concanavalin A (ConA) are the best know examples. Furthermore, it is well characterized that the target for ConA recognition is localized in the TCR/CD3 complex. The present study was delineated to characterize the effects of the lectin ArtinM on murine CD4+ T cells and to investigate the possible mechanisms accounting for the observed effects. It was investigated the ArtinM direct effects on CD4+ T cells, concerning its ability to induce the production of cytokines, the expression of costimulatory and inhibitory molecules and cell differentiation. In addition, the possible surface receptors recognized by ArtinM and responsible for triggering cell activation were also assessed. Finally, signaling molecules involved in the direct effects of ArtinM were approached. The first evidence of direct interaction of ArtinM with CD4+ T cells was provided by cell agglutination. A dose-response curve has revealed that 5µg/ml was the best ArtinM concentration to achieve significant production of Th1 (IL-2 and IFN-?) and Th17 (IL-6 and IL-17A) cytokines by TCD4+ cells. Stimulus with the optimum ArtinM concentration has showed that after 12 hours incubation there was a significant augmentation of IL-2, IFN-?, IL- 6 and IL-17A levels in the cell supernatant; which has persisted in the course of 48 hours observation. The concomitant secretion of IFN-? and IL-17A led us to evaluate, by flow cytometry, the intracellular expression of these cytokines. After 24 hours stimulation with ArtinM, there was a significant increase in the frequency of cells IFN-?+IL-17+. Once the cytokines detection indicated that CD4+ T cells have been activated by ArtinM, the expression of CD25 and CTLA-4 molecules was assessed. ArtinM increased the expression of both molecules, in a dose-dependent manner. Interestingly, both cell surface molecules, CD25 and CTLA-4, were early and persistently detected a temporal pattern that is distinct from the provided by other inducers of CD4+ T cell activation. In order to determine the mechanism by which ArtinM acts on CD4+ T cells, potential targets of recognition were assessed: CD3??, CD3?, CD28, CD45 and CD4. These receptors were selected on the basis of prediction of N-glycosylation sites. Specific antibodies for these molecules were assayed regarding their ability to inhibit the ArtinM of inducing TCD4+ cells to produce cytokines, such as IL-2, IFN-?, IL-6 and IL-17A. Only anti-CD3 antibody was able to prevent the cytokines secretion induced by ArtinM. In addition, anti-CD3 antibody has inhibited the T CD4+ cell labeling by biotynil-ArtinM. These data indicate that ArtinM exerts its biological activity on T CD4+ cells through recognition of CD3 receptor ? chain glycans, without excluding the occurrence of ArtinM interactions with other glycoproteins on the surface of T CD4+ lymphocytes. The interaction of ArtinM with glycans at the surface of these cells was found to occur with great specificity, since high concentrations of the manotriose - Man? 1-3 [Man? 1-6] Man - were required to inhibit the binding. By using specific inhibitors of signaling molecules, we have found that PI3K, PTK and p42/44MAPK are relevant cytokine production profiles of Th1 and Th17 cells after stimulation with ArtinM. All toghether, these results indicate that ArtinM is a potent and rapid activator of CD4+ T cells. The activation induced by ArtinM is triggered by its binding to the CD3 receptor ? chain, which induces high expression of costimulator and inhibitory molecules. Moreover, it was demonstrated that ArtinM promotes the differentiation of naive CD4+ T cells into Th1 and Th17 cells by committing signaling molecules that are known as critical for the induction of cytokines that characterize these subpopulations of cells.

O objetivo do estudo foi investigar o construto da tarefa de múltiplas acelerações a partir de parâmetros biomecânicos de saltos verticais. 19 jogadoras da seleção brasileira adulta de basquetebol feminino realizaram o teste de múltiplas acelerações (teste T), salto vertical com contramovimento (SV) e salto vertical com contramovimento precedido de corrida (SVcorrida). Os parâmetros biomecânicos do SV foram, tempo de fase concêntrica (Tcon), pico de força de propulsão (PFP), tempo decorrido entre início da fase concêntrica e o pico de força de propulsão (TPFP), taxa de desenvolvimento de força (TDF) e impulso (I); para SVcorrida, velocidade média de aproximação (Velmédia), tempo total do movimento (Ttotal), pico de força passiva (PFPa), tempo decorrido entre início da fase de apoio e pico de força passiva (TPFPa), pico de força de propulsão (PFP), tempo decorrido entre início da fase de apoio e pico de força de propulsão (TPFPp), Load Rate (LR) e taxa de desenvolvimento de força (TDF). Para análise dos dados, inicialmente, recorreu-se a análise de componentes principais, revelando que 61,3% da variância total do SV foi explicada pelo componente predominantemente temporal (Tcon, TPFP e PFP) e 20,7% pelo componente predominantemente cinético (I e TDF); para SVcorrida, 58,7% da variância total foi explicada pelo componente predominantemente temporal (Ttotal, TPFPa, TPFPp, LR e TDF), 15,4% pelo componente predominantemente cinético (PFPa e PFP) e 12,8% pelo componente velocidade (Velmédia). Adicionalmente, foram reveladas correlações significantes de 0,55 (Tcon), -0,54 (Velmédia) e -0,49 (PFP) com o teste T, evidenciando um construto determinado pela capacidade de se gerar elevada força na fase concêntrica, reduzir o tempo de fase concêntrica e se aproximar do ponto de mudança de direção com elevada velocidade. / The main aim of the study was to investigate the multiple-acceleration task construct from vertical jumps biomechanics parameters. Nineteen female basketball players from Brazilian national team performed the multiple-acceleration test (T test), countermovement jump (VJ) and countermovement jump preceded by run (VJr). The VJ biomechanics parameters observed were: concentric phase duration (CPD), propulsion peak force (PPF), time to reach propulsion peak force (TPPF), rate of force development (RFD) and impulse (I); for VJr the parameters were mean velocity (MV), movement total duration (MTD), passive peak force (PaPF), time to reach passive peak force (TPaPF), propulsion peak force (PPF), time to reach propulsion peak force (TPpPF), load rate (LR) and rate of force development (RFD). Data were first analyzed by principal component analysis. The results showed that 61.3% of VJ variance could be explained by time factor (CPD, TPPF and PPF), and 20.7% by kinetic factor (I and RFD). To VJr, 58.7% of total variance could be explained by time factor (MTD, TPaPF, TPpPF, LR, RFD) and 15.4% by kinetic factor (PPF and PaPF) and 12.8% by velocity factor (MV). Furthermore, significant correlations were found between T test with CPD, MV and PPF (0.55, -0.54 and -0.49, respectively), revealing a T test construct related to the ability of generating high level of force in concentric phase, diminishing time of concentric phase, and to reach the change direction point with greatest possible speed.