Le cilié Paramecium tetraurelia est un modèle intéressant pour l'étude de la diversité et de l'évolution des voies d'ARN interférence (ARNi) chez les eucaryotes. L'une des voies d'ARNi végétatives peut être induite en nourrissant les paramécies de bactéries produisant un ARN double-brin (ARNdb) homologue à un gène donné, dont l'expression est inactivée de manière post-transcriptionnelle par la production de siARN de 23 nt. Un crible de mutagénèse a permis d'obtenir des mutants mendéliens déficients pour l'ARNi, dont les génomes ont été séquencés afin d'identifier sans a priori des gènes impliqués dans cette voie. 6 gènes ont été identifiés: un Dicer, deux ARN polymérases ARN-dépendantes (RDR1 et 2), une nucléotidyl-transférase (CID1) et deux gènes codant de nouvelles protéines (PDS1 et 2). Pour étudier leur rôle dans la biosynthèse ou l'action des siARN, ces derniers ont été séquencés à partir de cellules sauvages ou mutantes, nourries d'un ARNdb homologue à un gène non essentiel. L'analyse bio-informatique a montré que des siARN dits 'primaires' sont produits à partir de l'ARNdb bactérien, tandis que des siARN dits 'secondaires' sont produits à partir de la totalité de l'ARNm endogène ciblé, et sont majoritairement de polarité anti-sens. Alors que la production des siARN primaires dépend de tous les gènes étudiés, les résultats n'impliquent que RDR2 dans celle des siARN secondaires. Enfin, j'ai montré que certains clusters de siARN endogènes dépendent de RDR1 et de CID1, tandis que d'autres dépendent de RDR2. La paramécie produit également des siARN antisens aux ARN ribosomaux bactériens, suggérant de nouvelles hypothèses quant à la fonction naturelle de cette voie. / The ciliate Paramecium tetraurelia is an interesting model to study the diversity and evolution of RNA interference (RNAi) pathways. One of the vegetative RNAi pathways is induced by feeding cells with bacteria producing double-stranded RNA (dsRNA) homologous to a given gene, which is then post-transcriptionally silenced through the production of 23-nt siRNAs. A forward genetic screen allowed us to obtain Mendelian mutants deficient in dsRNA-induced RNAi, and mutated genes were identified by whole-genome resequencing. 6 genes were identified: one Dicer, two RNA-dependent RNA polymerases (RDR1 et 2), one nucleotidyl-transferase (CID1) and two genes encoding novel poteins (PDS1 and 2). To study their roles in siRNA biosynthesis or action, we sequenced small RNAs from wild-type or mutants cells fed with a dsRNA homologous to a non-essential endogenous gene. Bioinformatic analyses showed that 'primary' siRNAs are produced from the bacterial dsRNA trigger, while 'secondary' siRNAs, predominantly of antisense polarity, are produced from the whole length of the targeted endogenous mRNA. While primary siRNA production requires all of the genes studied, the results only implicate RDR2 in the production of secondary siRNAs. Finally, I showed that some clusters of endogenous siRNAs depend on RDR1 and CID1, whereas others depend on RDR2. Paramecium was also shown to produce siRNAs that are antisense to bacterial ribosomal RNAs, suggesting new hypotheses about the possible natural functions of this pathway.

Mon travail de thèse s'est focalisé sur la machinerie enzymatique impliquée dans la réplication du génome ARN du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère-Coronavirus (SRAS-CoV). J'ai montré in vitro que l'activité ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp) portée par nsp12 nécessite le complexe nsp7/nsp8, qui agit comme facteur de processivité. Grâce à ce complexe polymérase hautement actif, j'ai pu en suite étudier le mécanisme de "proofreading" (correction d'épreuve) associé aux coronavirus, pour lequel seulement des preuves indirectes avaient été assemblées. En effet, les coronavirus codent pour une activité exonucléase 3'-5' (nsp14-ExoN) qui lorsqu'elle est absente, entraine 14-fois plus d'erreurs de réplication en contexte cellulaire. In vitro, nous avons pu montrer que nsp14-ExoN est capable d'exciser l'ARN double brin ainsi qu'un nucléotide mésapparié en 3' de l'ARN en cours d'élongation. J'ai pu apporter pour la première fois une preuve directe de l'existence d'un système de réparation des erreurs au cours de la synthèse, mené par le complexe nsp7/nsp8/nsp12/nsp14. En effet, le complexe nsp7/nsp8/nsp12 ralentit jusqu'à 30-fois quand il rajoute une base mésappariée. Par sequençage, nous avons pu montrer la réparation de cette base mésappariée en presence de nsp14. Enfin, grâce à ce système in vitro nous avons une base pour comprendre l'inefficacité de la ribavirine sur des patients atteints du SRAS. En effet, la ribavirine, incorporée par le complexe polymérase, serait également excisée par nsp14, annihilant tout potentiel effet mutagenique. En conclusion, ce système va permettre de guider le développement d'antiviraux de type nucleoside analogues contre les coronavirus. / This work focused on the enzymatic machinery involved in Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus (SARS-CoV) RNA replication and transcription. Firstly, I established a robust in vitro polymerase assay with the canonical SARS-CoV RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) nsp12. I showed that nsp12, in order to engage processive RNA synthesis, needs two viral proteins, i.e. nsp7 and nsp8. This nsp7/nsp8 complex not only activates nsp12-RdRp, but also acts as a processivity factor. Thus, using this processive polymerase complex, I could investigate SARS-CoV proofreading for which only indirect evidences were reported. Indeed, coronaviruses encode for a 3'-5' exonuclease (nsp14-ExoN), putatively involved in a mechanism that proofreads coronavirus RNA during viral replication. We first showed in vitro that nsp14-ExoN, which is stimulated by nsp10, is able to excise specifically dsRNA as well as all primer/templates bearing a 3' mismatch on the primer. Moreover, we could confirm by sequencing that a RNA 3' mismatch was indeed corrected in vitro by the nsp7/nsp8/nsp12/nsp14 complex. We provide for the first time direct evidence that nsp14-ExoN, in coordination with the polymerase complex, is able to proofread RNA. Interestingly, using this in vitro system we found an element that could possibly explain the inefficacy of ribavirin therapeutic treatment on SARS-patients: ribavirin, which is incorporated by the SARS-CoV polymerase complex, would also be excised by nsp14. In conclusion, this system will drive future development of antivirals, particularly of the nucleoside analogue type, against coronaviruses.