Les lipoxygénases (LOXs, EC 1.13.11.12) sont des dioxygénases qui catalysent l'hydroperoxidation des acides gras polyinsaturés. Bien que de nombreuse isoformes de LOXs aient été caractérisé chez de nombreux végétaux, leur rôle physiologique reste inconnu. Dans le but d'éclaircir le rôle des LOXs dans l'olive et leur contribution dans l'élaboration de l'arôme, nous avons cloné et caractérisé un ADNc codant pour une isoforme de LOX d'olive exprimé dans les derniers stades de maturation du fruit. Cet ADNc présente un cadre de lecture ouvert qui code pour une protéine de 864 acides aminés. Cette LOX d'olive fait partie des LOXs de type-1 et présente un fort pourcentage d'identité avec la LOX de noisette (77,3%) et la LOX de tabac (76,3%). L'enzyme recombinante présente une double spécificité, elle produit des 9- et des 13-hydroperoxydes dans un rapport 2:1. Bien que l'activité LOX soit détectée à tous les stades de développement des olives, la 9/13-LOX est uniquement exprimé dans les stades noirs. Nos résultats suggèrent qu'il existe au moins deux gènes lox exprimés dans les olives noires, et que la 9/13-LOX est associé aux phénomènes de maturation et de sénescence. Cependant, en considérant sa double spécificité de substrat et son profil d'expression, nous ne pouvons pas exclure que cette enzyme puisse jouer un rôle dans l'élaboration de l'arôme. Nous avons modifié l'accessibilité au site actif de la LOX d'olive en mutant les résidus Phe277 et Tyr280 situés à l'entrée du site actif par des résidus à chaîne latérale courte (Ala et Ile). Nous avons exprimé les mutants F277A, Y280I et F277A/Y280I chez E. coli et nous les avons partiellement purifié. Les mutants F277A et F277A/Y280I présentent un taux de conversion de l'acide linoléique 4 fois supérieur à celui de la LOX d'olive non mutée et ont des paramètres cinétiques similaires à la LOX1 de soja.

Cette étude a porté sur l’analyse de l’énantiosélectivité de la lipase de Burkholderia cepacia (BCL) pour les acides 2-substitués, synthons chiraux d’intérêt pharmaceutique, avec pour objectif d’examiner le rôle de l’accès au site actif enfoui de BCL sur l’énantiosélectivité et de développer une procédure d’ingénierie permettant de créer des mutants d’énantiosélectivité améliorée. Pour traiter le problème, une nouvelle approche de calcul, basée sur des algorithmes de planification de mouvements issus de la robotique a été développée. Elle permet l’exploration conformationnelle des espaces multi-dimensionnels contraints et a été appliquée au calcul des trajectoires de plusieurs racémiques dans le site actif de BCL et à l’identification de résidus pouvant potentiellement gêner le déplacement du substrat le long du site actif. Les résultats obtenus in silico ont révélé une corrélation qualitative avec les valeurs d’énantiosélectivité et ont permis de proposer des cibles de mutagénèse. Sur cette base, l’ingénierie du site actif de BCL a été entreprise pour moduler sélectivement l’accès des énantiomères R et S à la triade catalytique. Un système d’expression hétérologue de BCL chez E. coli compatible avec une expression en microplaque, a été développé. Une librairie de 57 (3x19) mono-mutants sur les positions : Leu17, Val266 et Leu287 a été construite par iPCR puis criblée en utilisant une procédure à moyen débit pour identifier les variants actifs pour l’hydrolyse du pNPB. L’énantiosélectivité de ces mutants a ensuite été évaluée pour l’hydrolyse du racémique (R,S)-2 bromophényl acétate de 2-chloro-éthyle, par utilisation d’une nouvelle procédure de criblage en deep-wells. Ce crible a permis de mettre en évidence plusieurs mutants dont les plus prometteurs ont été caractérisés. Ainsi les mutants Leu17Ser et Leu17Met présentent une augmentation de l’énantiosélectivité d’un facteur 10 accompagnée d’une augmentation de leur activité d’un facteur 4 à 5. Le mutant Val266Gly présente, quant à lui, une inversion de l’énantiosélectivité pour le substrat d’intérêt. L’étude des trajectoires par les techniques de planification combinée à une représentation sous la forme de carte de voxels a été réalisée en parallèle. Pour les mutants sélectionnés, une bonne corrélation a été observée entre les résultats obtenus in silico et expérimentalement. De plus, cela a permis de proposer de nouvelles combinaisons de mutations ayant conduit à l’identification de deux double-mutants Leu17Met/Val266Met et Leu17Ser/Leu287Ile d’énantiosélectivité supérieure à 150 pour le substrat modèle, révélant ainsi l’intérêt de l’approche semi-rationnelle proposée / This work has been focused on the understanding of the Burkholderia cepacia lipase (BCL) enantioselectivity towards 2-substituted acids which are chiral building blocks of pharmaceutical interest. The main objective of this work was the investigation of the potential role of substrate accessibility toward the buried active site of BCL on enantioselectivity and the development of an engineering procedure for the design of enantioselective mutants. To study further this hypothesis, a novel computational approach, based on motion-planning algorithms, originally used in robotics, was developed. It allows the conformational exploration of constrained high-dimensional spaces and was applied to the computation of trajectories for a set of racemates within the catalytic site. This methodology also enables the identification of residues potentially hindering substrates displacement along the active site. Results obtained in silico were correlated qualitatively with experimental values of enantioselectivity. On the basis of these results, engineering of the narrow active site of BCL has been undertaken to modulate selectively the access of R and S enantiomers to the catalytic triade. An heterologous expression system of BCL in E. coli compatible with production at microplate scale was developed. A library of 57 (3x19) variants targeted at positions Leu17, Val266 and Leu287 was built by iPCR and subsequently screened using a medium-throughput procedure to identify active variants against pNPB hydrolysis. Next, the enantioselectivity of these mutants was evaluated towards a given racemate, the (R,S)-2-chloro ethyl 2-bromophenylacetate, using a novel screening procedure developed in deep wells. Such screening enabled the identification of several variants amongst which the most promising were characterized. Mutants Leu17Ser and Leu17Met showed a remarkable 10-fold increase of their enantioselectivity and a 4- and 5-fold improvement of their specific activity. Compared to the wild-type enzyme, mutant Val266Gly displayed a reversed enantioselectivity for the substrate of interest. Investigation of the trajectories using motion-planning techniques combined to a voxel map representation was carried out. For selected variants, a fair correlation was observed between in silico and experimental results. Moreover, this enabled us to suggest novel combinations of mutations that led to the identification of two double-mutants Leu17Met/Val266Met and Leu17Ser/Leu287Ile showing an enantioselectivity value higher than 150 for the racemic substrate, revealing thus the effiency of the semi-rational strategy