L’objectif de notre travail était d’étudier les bascules métaboliques chez Yarrowia li-polytica d’un métabolisme purement oxydatif vers l’accumulation de lipides puis à l’excretion d’acide citrique.Le développement d’un procédé D-stat et d’un mode de conduite fed-batch nous a permis, dans un premier temps, de quantifier les ratios N/C caractéristiques pour chacune des bascules étudiées. Nos résultats montrent que les ratios rN/rC critiques aux bascules métaboliques sont de 0,085 molN.Cmol-1 et de 0,018-0,022 molN.Cmol-1 pour l’accumulation de lipides et production de citrate, respectivement.L’analyse systémique des cultures réalisées nous a permis de mettre en évidence des mécanismes de co-régulation de certaines enzymes du métabolisme lipidique ainsi qu’une prépondérance de mécanismes post-transcriptionnels dans l’établissement des bascules étudiées.Enfin, l’utilisation de souches génétiquement modifiées au niveau de l’ATP citrate lyase, la malate déshydrogénase et de la glycérol-3-phosphate déshydogénase a permis d’évaluer l’impact de ces enzymes sur le métabolisme lipidique / This thesis aimed at studying the metabolic shifts in Yarrowia lipolytica from the pure oxidative metabolism to lipid accumulation and citric acid excretion.The development of a D-stat culture and of a monitoring fed-batch strategy allowed us to determine the N/C ratio characteristic for each of metabolic shifts. rN/rC ratio were determined equal to 0,085 molN.Cmol-1 and 0,018-0,022 molN.Cmol-1 for the lipid accumu-lation and the citric acid production, respectively.Systemic analysis of the cultivations showed coregulation phenomena among some enzymes of the lipidic metabolism and post-transcriptional modifications in the onset of the metabolic shifts.Finally, the impact of enzymes (ATP citrate lyase, malate dehydrogenase and gly-cérol-3-phosphate dehydrogenase) on the lipidic metabolism was evaluated through systemic analysis of 3 genetically modified strains

Yarrowia lipolytica est une levure oléagineuse qui possède un remarquable potentiel de croissance et d'accumulation de lipides dans des milieux hydrophobes. Au cours de cette étude nous avons approfondi nos connaissances du métabolisme lipidique chez cette levure en mettant l'accent sur la capacité d'accumulation et de dégradation des lipides, la régulation et les interactions des différentes voies métaboliques. L'étude des enzymes du métabolisme des microorganismes oléagineux et de leurs particularités fonctionnelles, en comparaison avec celles des microorganismes non oléagineux, a permis de se focaliser sur des enzymes candidates pour être impliquées dans le caractère oléagineux. L'objectif de cette étude est de combiner les connaissances physiologiques sur cette levure avec les outils génétiques existants afin d'utiliser Y. lipolytica comme une usine cellulaire pour la production de grandes quantités de lipides ayant un intérêt industriel. Afin de rediriger les flux de carbone vers la synthèse de lipides, le gène GUT2, qui code l'un de deux isomères de la glycérol-3-phosphate déshydrogénase, ainsi que la voie de la β-oxydation ont été invalidés chez Y. lipolytica, conduisant à une forte augmentation de l'accumulation des lipides. Afin d'identifier l'étape limitante de la synthèse des TAG et de construire des souches aux profils lipidiques modifiés nous avons joué sur le niveau d'expression des acyltransférases et des désaturases. La contribution relative des acyltransférases dépend de la phase de croissance et leurs affinités vis-à-vis des substrats donneurs d'acyle sont complémentaires. La modification des désaturases a permis d'accumuler des acides gras spécifiques, démontrant ainsi qu'il est possible de moduler le profil des lipides accumulés chez Y. lipolytica. Cette étude nous a permis de construire des souches hyperaccumulatrices aux profils lipidiques tels qu'ils permettront de leur trouver des applications biotechnologiques dans la filière des biocarburants ou dans l'industrie oléochimique en tant qu'unités alternatives pour la production de substrats spécifiques.

L’accumulation de lipides chez une espèce levurienne Yarrowia lipolytica souche sauvage a été caractérisée par l’analyse dynamique et systémique des différents états métaboliques identifiés lors des cultures sous conditions environnementales parfaitement maitrisées, à hautes densités cellulaires selon deux stratégies bien distinctes. En premier lieu sur substrat osidique avec le phosphore comme élément inducteur de l’accumulation de lipides, stratégie originale pour déclencher l’accumulation de lipides chez cette souche. Et deuxièmement sur co-susbtrats glucose et oléate et sans aucune limitation nutritionnelle.Ces stratégies de conduites ont permis de dégager les points suivants :- La limitation phosphore déclenche une accumulation en lipides mais aussi en polysaccharides de réserves mobilisables mais non transitoire contrairement à la limitation azote.- La teneur en phosphore de la biomasse catalytique est très variable. De ce fait, le taux de croissance de la biomasse catalytique n’est pas contrôlable par le débit en phosphore.- Le phosphore joue un rôle dans la régulation de l’entrée de glucose dans la cellule, et permet d’éviter la production de citrate lorsque les voies de production de biomasse et de lipides sont en débordement sur une large gamme de rapport C/P (de 0 à 8000 Cmole.mole-1).- La capacité maximale d’accumulation en réserves carbonées chez Y. lipolytica wT est identique quelle que soit la méthode d’accumulation (limitation azote, limitation phosphore, co-substrats glucose / oléate) et est égale à 0,5 Cmole/CmoleX-1. Il existe donc un phénomène de régulation de la levure encore inconnu et limitant l’accumulation en réserves carbonées chez cette souche.Ces résultats ont permis d’identifier des points clés dans l’accumulation en réserves carbonées de cette espèce levurienne et de proposer un mode de conduite original faisant l’objet d’un dépôt de brevet / Lipid accumulation by the yeast Yarrowia lipolytica wT was characterized by dynamic and systemic analysis of different metabolic states in a microbial culture under fully controlled environmental conditions with high cell concentration and under two different strategies:Glucose as the substrate and phosphorus limitation as an inducer of lipid accumulation, an original strategy for lipid accumulation in Y. lipolytica wT.A co-substrate strategy with glucose and oleic acid and without any nutritional limitation.These strategies allowed showing the following points:- Phosphorus limitation triggers a lipid accumulation and a non-transient accumulation of reserve polysaccharide that can be consumed by biomass when necessary, contrary to nitrogen limitation- Phosphorus rate in catalytic biomass shows great variations. Catalytic growth rate cannot be governed by phosphorus input. - Phosphorus has a role in regulating cellular glucose uptake and allows avoiding citric acid production due to overflow of carbon input over a large range of C/P ratios (0 to 8000 Cmol.mol-1)- Maximum capacity of reserve carbon accumulation in Y. lipolytica wT is similar for any culture strategy tested (under nitrogen limitation, phosphorus limitation or with glucose and oleic acid co-substrates) and is equal to 0,5 Cmol/CmolX-1. There is an unknown phenomenon of carbon regulation limiting reserve carbon accumulation in Y. lipolytica wT. Results allowed identifying key points in reserve carbon accumulation in this particular yeast strain and suggesting an original process, claim of a patent