As deficiências da proteína trifuncional mitocondrial (MTP) e da desidrogenase de acil-CoA de cadeia longa hidroxilada (LCHAD) são defeitos hereditários da β-oxidação de ácidos graxos. Pacientes afetados por essas deficiências apresentam acúmulo de 3-hidroxiácidos de cadeia longa, como os ácidos 3-hidroxidodecanóico (3HDA), 3-hidroxitetradecanóico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico (3HPA) em tecidos e líquidos biológicos. A apresentação clínica é caracterizada por encefalopatia com coma, letargia, convulsão, retardo mental e hipotonia, além de disfunção hepática, cardiomiopatia, fraqueza muscular e retinopatia. Considerando que a fisiopatologia dos sintomas neurológicos dessas doenças ainda não está bem estabelecida e que tem sido levantada a hipótese de que os ácidos graxos acumulados nessas doenças possam exercer efeitos tóxicos, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos in vitro dos ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA sobre parâmetros de estresse oxidativo e da homeostase mitocondrial em cérebro de ratos de 30 dias de vida. Inicialmente, observamos que o 3HDA, 3HTA e 3HPA induziram um aumento na peroxidação lipídica evidenciado por um aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Os ácidos 3HTA e 3HPA também causaram dano oxidativo proteico, visto que aumentaram o conteúdo de carbonilas e diminuíram o conteúdo de grupamentos sulfidrila. Além disso, 3HTA e 3HPA diminuíram os níveis de glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante não-enzimático presente no cérebro, sem no entanto, alterar a produção de nitratos e nitritos. O ácido 3HTA apresentou o efeito mais pronunciado nos parâmetros testados e a adição dos antioxidantes e sequestradores de radicais livres trolox e deferoxamina (DFO) foram capazes de prevenir parcialmente o dano oxidativo lipídico, ao passo que DFO preveniu totalmente a redução dos níveis de GSH. Além disso, os ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA aumentaram o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuíram os valores do índice de controle respiratório. 3HTA e 3HPA também diminuíram o potencial de membrana e o conteúdo de equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondrial, sugerindo um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa. Além disso, o 3HTA diminuiu o estado 3 da respiração e a razão ADP/O quando utilizado glutamato/malato como substrato, mas não quando utilizado piruvato/malato ou sucinato como substratos, sugerindo que o transporte de glutamato e/ou sua oxidação possam estar sendo inibidos pela presença deste ácido. Nossos resultados sugerem que os ácidos graxos acumulados na deficiências da LCHAD e MTP induzem estresse oxidativo e comprometem a homeostase mitocondrial, mecanismos que potencialmente podem estar envolvidos no dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados por essas deficiências. / Mitochondrial trifunctional protein (MTP) and isolated long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencies are inborn errors of metabolism of fatty acid oxidation. Affected patients present blood and tissue accumulation of the 3-hydroxy fatty acids, such as 3-hydroxydodecanoic (3HDA), 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids. Clinical presentation is characterized by a encephalopathic crises with coma, lethargy, seizures, mental retardation and hypotonia, besides hepatic disfunction, cardiomiopathy and muscle weakness and retinopathy. Considering that the pathophisiology of the neurological damage found in LCHAD/MTP-deficient patients is not yet clear, and it has been proposed that accumulating fatty acids could present toxic effects, the aim of the present work was to investigate the in vitro effects of 3HDA, 3HTA and 3HPA on oxidative stress parameters and on mitochondrial homeostasis in 30-day-old rat brain. It was first verified that 3HDA, 3HTA and 3HPA significantly induced lipid peroxidation, as determined by increased thiobarbituric acid-reactive substances levels. In addition, carbonyl formation was significantly increased by 3HTA and 3HPA, whereas sulfhydryl content was decreased, which indicates that these fatty acids elicit protein oxidative damage. 3HTA and 3HPA also diminished the reduced glutathione (GSH) levels, the main brain non-enzymatic antioxidant defense, without affecting nitrate and nitrite production. Finally, we observed that 3HTA elicited the most pronounced effects on the tested parameters and the addition of antioxidants and free radical scavengers trolox and deferoxamine (DFO) were able to partially prevent lipid oxidative damage, whereas DFO fully prevented the reduction on GSH levels induced by this fatty acid. We also found that 3HDA, 3HTA and 3HPA markedly increased state 4 respiration and diminished the respiratory control ratio. 3HTA and 3HPA also diminished the mitochondrial membrane potential and the matrix NAD(P)H levels, suggesting an uncoupler effect of oxidative fosforilation . In addition, 3HTA decreased state 3 of respiration and ADP/O ratio, when used glutamate/malate as substrates, but not when piruvate/malate or succinate were used as substrates, suggesting that glutamate transport and/or oxidation could be inhibited by this fatty acid. Taken together, these results suggest that the fatty acids accumulating in LCHAD/MTP induce oxidative stress and impair mitochondrial homeostasis, mechanisms that potentially may be involved on the neurological damage found in affected patientes.

A deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCAD) é o mais frequente defeito de oxidação de ácidos graxos, caracterizado bioquimicamente pelo acúmulo tecidual predominante dos ácidos graxos de cadeia média octanoato (AO), decanoato (AD) e cis-4-decenoato (AcD). Embora os sinais clínicos dos afetados sejam fundamentalmente neurológicos, os mecanismos fisiopatológicos do dano do sistema nervoso central apresentado pelos pacientes afetados por esse distúrbio ainda não estão esclarecidos. Tem sido, no entanto, levantada a hipótese de que os ácidos graxos acumulados nesta doença possam exercer efeitos tóxicos. Neste cenário, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos in vitro dos ácidos AO, AD e AcD sobre parâmetros de função mitocondrial e de estresse oxidativo em cérebro de ratos de 30 dias de vida, uma vez que o metabolismo energético é muito ativo e as defesas antioxidantes estão diminuídas neste tecido. Inicialmente, observamos que todos os ácidos graxos testados dimuíram o potencial de membrana mitocondrial em preparações mitocondriais de cérebro de ratos, sendo que as concentrações mais altas testadas do AD e do AcD exerceram efeitos comparáveis ao de um clássico desacoplador da fosforilação oxidativa, sugerindo que estes ácidos graxos atuem como desacopladores. Os ácidos AO, AD e AcD também aumentaram o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuíram os valores do índice de controle respiratório. Além disso, o AD e o AcD diminuíram o estado 3 da respiração tanto com glutamato/malato quanto com succinato como substratos, enquanto que o AO dimiuiu o mesmo parâmetro apenas com o succinato. Também encontramos uma diminuição na razão ADP/O na presença de AD e AcD. O atractilosídeo, inibidor do translocador de nucleotídeos de adenina (ANT), foi capaz de impedir parcialmente o efeito desacoplador do AD, sem alterar os efeitos do AO e do AcD, sugerindo um envolvimento deste translocador no efeito desacoplador do AD. O AO e o AD também diminuíram o consumo de oxigênio em mitocôndrias desacopladas. O AcD também diminuiu a produção de peróxido de hidrogênio, sendo seu efeito maior do que o da rotenona, que inibe o fluxo reverso de elétrons. Os AO e AD diminuíram as atividades dos complexos I-III e IV da cadeia transportadora de elétrons, e o AD também inibiu a atividade do complexo II-III. Todos os três ácidos graxos testados diminuíram o conteúdo de equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondrial e a posterior adição de rotenona apenas reverteu o efeito do AO, sugerindo que estes equivalentes estejam sendo perdidos para o meio extramitocondrial. Os ácidos AD e AcD também induziram um maior inchamento mitocondrial, sugerindo que estes ácidos graxos possam atuar como desacopladores provavelmente devido a uma permeabilização nãoseletiva da membrana mitocondrial interna. Também avaliamos o efeito dos mesmos ácidos graxos sobre parâmetros de estresse oxidativo. Observamos que o AO, o AD e o AcD induziram um aumento na peroxidação lipídica em córtex cerebral de ratos, evidenciado por um aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e na medida de quimioluminescência espontânea. Os AD e AcD também causaram dano oxidativo proteico, visto que aumentaram o conteúdo de carbonilas e diminuíram o conteúdo de grupamentos sulfidrila. Além disso, todos os ácidos graxos testados diminuíram as defesas antioxidantes não-enzimáticas, evidenciado pela diminuição do potencial antioxidante total do tecido (TRAP). Entretanto apenas o AD e o AcD diminuíram os níveis de glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante não-enzimático presente no cérebro. O AcD não ocasionou um aumento nos níveis de TBA-RS em preparações mitocondriais de cérebro de ratos, sugerindo que outros componenentes celulares sejam essenciais para os efeitos pró-oxidantes deste ácido graxo. Entretanto, não foi observado nenhum efeito do AD sobre níveis de GSH e o conteúdo de grupamentos sulfidrila em preparações citosólicas, sugerindo um papel para a mitocôndria nos efeitos causados por este ácido graxo. Devemos também enfatizar que os efeitos mais pronunciados foram verificados pelo AcD, seguido do AD e por último do AO. Estes resultados, tomados em seu conjunto, indicam que os principais metabólitos acumulados na deficiência de MCAD exercem efeitos neurotóxicos importantes. Dessa forma, é possível que uma disfunção mitocondrial e o estresse oxidativo, possivelmente com outros mecanismos, atuem sinergicamente, colaborando para o dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados pela deficiência da MCAD. / Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) deficiency (MCADD) is the most frequent fatty acid oxidation disorder, leading to the accumulation of octanoic (AO), decanoic (AD) and cis-4-decenoic (AcD) acids. Considering that the pathophisiology of the neurological damage found in MCAD-deficient patients is not clear yet, and that a role for neurotoxic accumulating metabolites has been considered, the aim of the present work was to investigate the in vitro effect of AO, AD and AcD on mitochondrial function and oxidative stress parameters in 30-dayold rat brain. Initially we investigated the effect of these fatty acids on mitochondrial homeostasis, and we found that all these three metabolites diminished the mitochondrial membrane potential in mitochondrial preparations of rat brain, and the effects of the highest concentration of AD and AcD were similar to the CCCP effect, a classical uncoupler, suggesting that these fatty acids act as uncouplers of oxidative phosphorylation. AO, AD and AcD also increased state 4 respiration and decreased respiratory control ratio. AD and AcD also decreased state 3 respiration with either glutamate/malate or succinate as substrates, while AO only decreased in the presence of succinate. We also observed a decrease in the ADP/O ratio caused by AD and AcD. Atractyloside, an inhibitor of adenine nucleotide transporter (ANT), mildly prevented the uncoupler effect of AD, without any effect of AcD- and AO-induced effects, suggesting a role for ANT on AD-induced effects. AO and AD also diminished uncoupled state (state U) in mitochondrial preparations. AcD also decreased hydrogen peroxide production, and this effect was greater than rotenone effect, which inhibits the reverse electron flow. AO and AD inhibited the activities of the respiratory chain complexes I-III and IV, and AD also inhibited complex II-III activity. All the fatty acids tested decreased mitochondrial matrix NAD(P)H content, and the further addition of rotenone only reverted AO-induced effect, indicating that these reduced equivalents might be lost from the mitochondrial matrix. AD and AcD also induced a mitochondrial swelling, suggesting that these fatty acids act as uncouplers probably due to a non-selective mitochondrial inner-membrane. We also evaluated the effect of the same fatty acids on oxidative stress parameters. We first observed that lipid peroxidation was increased in the presence of AO, AD and AcD, as observed by the increase in the thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels and spontaneous chemiluminescence. AD and AcD also caused protein oxidative damage, since they increased carbonyl content and decreased sulfhydryl group content. All the fatty acids tested also decreased the non-enzymatic antioxidant defenses, as they decreased the total radical-trapping antioxidant potential (TRAP). However, only AD and AcD decreased reduced glutathione (GSH) levels, the major antioxidant in the cell. AcD did not induce an increase in TBA-RS levels in mitochondrial preparations, suggesting that mitochondria were not involved in AcD-induced effects. Furthermore, AD did not alter GSH levels and sulfhydryl group content in cytosolic preparations, suggesting a role for mitochondria in AD-induced effects. Taken together, these results suggest that the MCADD accumulating fatty acids cause important neurotoxic effects. Thus, it is feasible that a mitochondrial dysfunction and oxidative stress, allied to other possible toxic effects, act synergistically, collaborating to the neurological damage found in MCAD-deficient patients.

As deficiências da proteína trifuncional mitocondrial (MTP) e da desidrogenase de acil-CoA de cadeia longa hidroxilada (LCHAD) são defeitos hereditários da β-oxidação de ácidos graxos. Pacientes afetados por essas deficiências apresentam acúmulo de 3-hidroxiácidos de cadeia longa, como os ácidos 3-hidroxidodecanóico (3HDA), 3-hidroxitetradecanóico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico (3HPA) em tecidos e líquidos biológicos. A apresentação clínica é caracterizada por encefalopatia com coma, letargia, convulsão, retardo mental e hipotonia, além de disfunção hepática, cardiomiopatia, fraqueza muscular e retinopatia. Considerando que a fisiopatologia dos sintomas neurológicos dessas doenças ainda não está bem estabelecida e que tem sido levantada a hipótese de que os ácidos graxos acumulados nessas doenças possam exercer efeitos tóxicos, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos in vitro dos ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA sobre parâmetros de estresse oxidativo e da homeostase mitocondrial em cérebro de ratos de 30 dias de vida. Inicialmente, observamos que o 3HDA, 3HTA e 3HPA induziram um aumento na peroxidação lipídica evidenciado por um aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Os ácidos 3HTA e 3HPA também causaram dano oxidativo proteico, visto que aumentaram o conteúdo de carbonilas e diminuíram o conteúdo de grupamentos sulfidrila. Além disso, 3HTA e 3HPA diminuíram os níveis de glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante não-enzimático presente no cérebro, sem no entanto, alterar a produção de nitratos e nitritos. O ácido 3HTA apresentou o efeito mais pronunciado nos parâmetros testados e a adição dos antioxidantes e sequestradores de radicais livres trolox e deferoxamina (DFO) foram capazes de prevenir parcialmente o dano oxidativo lipídico, ao passo que DFO preveniu totalmente a redução dos níveis de GSH. Além disso, os ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA aumentaram o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuíram os valores do índice de controle respiratório. 3HTA e 3HPA também diminuíram o potencial de membrana e o conteúdo de equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondrial, sugerindo um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa. Além disso, o 3HTA diminuiu o estado 3 da respiração e a razão ADP/O quando utilizado glutamato/malato como substrato, mas não quando utilizado piruvato/malato ou sucinato como substratos, sugerindo que o transporte de glutamato e/ou sua oxidação possam estar sendo inibidos pela presença deste ácido. Nossos resultados sugerem que os ácidos graxos acumulados na deficiências da LCHAD e MTP induzem estresse oxidativo e comprometem a homeostase mitocondrial, mecanismos que potencialmente podem estar envolvidos no dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados por essas deficiências. / Mitochondrial trifunctional protein (MTP) and isolated long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencies are inborn errors of metabolism of fatty acid oxidation. Affected patients present blood and tissue accumulation of the 3-hydroxy fatty acids, such as 3-hydroxydodecanoic (3HDA), 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids. Clinical presentation is characterized by a encephalopathic crises with coma, lethargy, seizures, mental retardation and hypotonia, besides hepatic disfunction, cardiomiopathy and muscle weakness and retinopathy. Considering that the pathophisiology of the neurological damage found in LCHAD/MTP-deficient patients is not yet clear, and it has been proposed that accumulating fatty acids could present toxic effects, the aim of the present work was to investigate the in vitro effects of 3HDA, 3HTA and 3HPA on oxidative stress parameters and on mitochondrial homeostasis in 30-day-old rat brain. It was first verified that 3HDA, 3HTA and 3HPA significantly induced lipid peroxidation, as determined by increased thiobarbituric acid-reactive substances levels. In addition, carbonyl formation was significantly increased by 3HTA and 3HPA, whereas sulfhydryl content was decreased, which indicates that these fatty acids elicit protein oxidative damage. 3HTA and 3HPA also diminished the reduced glutathione (GSH) levels, the main brain non-enzymatic antioxidant defense, without affecting nitrate and nitrite production. Finally, we observed that 3HTA elicited the most pronounced effects on the tested parameters and the addition of antioxidants and free radical scavengers trolox and deferoxamine (DFO) were able to partially prevent lipid oxidative damage, whereas DFO fully prevented the reduction on GSH levels induced by this fatty acid. We also found that 3HDA, 3HTA and 3HPA markedly increased state 4 respiration and diminished the respiratory control ratio. 3HTA and 3HPA also diminished the mitochondrial membrane potential and the matrix NAD(P)H levels, suggesting an uncoupler effect of oxidative fosforilation . In addition, 3HTA decreased state 3 of respiration and ADP/O ratio, when used glutamate/malate as substrates, but not when piruvate/malate or succinate were used as substrates, suggesting that glutamate transport and/or oxidation could be inhibited by this fatty acid. Taken together, these results suggest that the fatty acids accumulating in LCHAD/MTP induce oxidative stress and impair mitochondrial homeostasis, mechanisms that potentially may be involved on the neurological damage found in affected patientes.

A deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCAD) é o mais frequente defeito de oxidação de ácidos graxos, caracterizado bioquimicamente pelo acúmulo tecidual predominante dos ácidos graxos de cadeia média octanoato (AO), decanoato (AD) e cis-4-decenoato (AcD). Embora os sinais clínicos dos afetados sejam fundamentalmente neurológicos, os mecanismos fisiopatológicos do dano do sistema nervoso central apresentado pelos pacientes afetados por esse distúrbio ainda não estão esclarecidos. Tem sido, no entanto, levantada a hipótese de que os ácidos graxos acumulados nesta doença possam exercer efeitos tóxicos. Neste cenário, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos in vitro dos ácidos AO, AD e AcD sobre parâmetros de função mitocondrial e de estresse oxidativo em cérebro de ratos de 30 dias de vida, uma vez que o metabolismo energético é muito ativo e as defesas antioxidantes estão diminuídas neste tecido. Inicialmente, observamos que todos os ácidos graxos testados dimuíram o potencial de membrana mitocondrial em preparações mitocondriais de cérebro de ratos, sendo que as concentrações mais altas testadas do AD e do AcD exerceram efeitos comparáveis ao de um clássico desacoplador da fosforilação oxidativa, sugerindo que estes ácidos graxos atuem como desacopladores. Os ácidos AO, AD e AcD também aumentaram o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuíram os valores do índice de controle respiratório. Além disso, o AD e o AcD diminuíram o estado 3 da respiração tanto com glutamato/malato quanto com succinato como substratos, enquanto que o AO dimiuiu o mesmo parâmetro apenas com o succinato. Também encontramos uma diminuição na razão ADP/O na presença de AD e AcD. O atractilosídeo, inibidor do translocador de nucleotídeos de adenina (ANT), foi capaz de impedir parcialmente o efeito desacoplador do AD, sem alterar os efeitos do AO e do AcD, sugerindo um envolvimento deste translocador no efeito desacoplador do AD. O AO e o AD também diminuíram o consumo de oxigênio em mitocôndrias desacopladas. O AcD também diminuiu a produção de peróxido de hidrogênio, sendo seu efeito maior do que o da rotenona, que inibe o fluxo reverso de elétrons. Os AO e AD diminuíram as atividades dos complexos I-III e IV da cadeia transportadora de elétrons, e o AD também inibiu a atividade do complexo II-III. Todos os três ácidos graxos testados diminuíram o conteúdo de equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondrial e a posterior adição de rotenona apenas reverteu o efeito do AO, sugerindo que estes equivalentes estejam sendo perdidos para o meio extramitocondrial. Os ácidos AD e AcD também induziram um maior inchamento mitocondrial, sugerindo que estes ácidos graxos possam atuar como desacopladores provavelmente devido a uma permeabilização nãoseletiva da membrana mitocondrial interna. Também avaliamos o efeito dos mesmos ácidos graxos sobre parâmetros de estresse oxidativo. Observamos que o AO, o AD e o AcD induziram um aumento na peroxidação lipídica em córtex cerebral de ratos, evidenciado por um aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e na medida de quimioluminescência espontânea. Os AD e AcD também causaram dano oxidativo proteico, visto que aumentaram o conteúdo de carbonilas e diminuíram o conteúdo de grupamentos sulfidrila. Além disso, todos os ácidos graxos testados diminuíram as defesas antioxidantes não-enzimáticas, evidenciado pela diminuição do potencial antioxidante total do tecido (TRAP). Entretanto apenas o AD e o AcD diminuíram os níveis de glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante não-enzimático presente no cérebro. O AcD não ocasionou um aumento nos níveis de TBA-RS em preparações mitocondriais de cérebro de ratos, sugerindo que outros componenentes celulares sejam essenciais para os efeitos pró-oxidantes deste ácido graxo. Entretanto, não foi observado nenhum efeito do AD sobre níveis de GSH e o conteúdo de grupamentos sulfidrila em preparações citosólicas, sugerindo um papel para a mitocôndria nos efeitos causados por este ácido graxo. Devemos também enfatizar que os efeitos mais pronunciados foram verificados pelo AcD, seguido do AD e por último do AO. Estes resultados, tomados em seu conjunto, indicam que os principais metabólitos acumulados na deficiência de MCAD exercem efeitos neurotóxicos importantes. Dessa forma, é possível que uma disfunção mitocondrial e o estresse oxidativo, possivelmente com outros mecanismos, atuem sinergicamente, colaborando para o dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados pela deficiência da MCAD. / Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) deficiency (MCADD) is the most frequent fatty acid oxidation disorder, leading to the accumulation of octanoic (AO), decanoic (AD) and cis-4-decenoic (AcD) acids. Considering that the pathophisiology of the neurological damage found in MCAD-deficient patients is not clear yet, and that a role for neurotoxic accumulating metabolites has been considered, the aim of the present work was to investigate the in vitro effect of AO, AD and AcD on mitochondrial function and oxidative stress parameters in 30-dayold rat brain. Initially we investigated the effect of these fatty acids on mitochondrial homeostasis, and we found that all these three metabolites diminished the mitochondrial membrane potential in mitochondrial preparations of rat brain, and the effects of the highest concentration of AD and AcD were similar to the CCCP effect, a classical uncoupler, suggesting that these fatty acids act as uncouplers of oxidative phosphorylation. AO, AD and AcD also increased state 4 respiration and decreased respiratory control ratio. AD and AcD also decreased state 3 respiration with either glutamate/malate or succinate as substrates, while AO only decreased in the presence of succinate. We also observed a decrease in the ADP/O ratio caused by AD and AcD. Atractyloside, an inhibitor of adenine nucleotide transporter (ANT), mildly prevented the uncoupler effect of AD, without any effect of AcD- and AO-induced effects, suggesting a role for ANT on AD-induced effects. AO and AD also diminished uncoupled state (state U) in mitochondrial preparations. AcD also decreased hydrogen peroxide production, and this effect was greater than rotenone effect, which inhibits the reverse electron flow. AO and AD inhibited the activities of the respiratory chain complexes I-III and IV, and AD also inhibited complex II-III activity. All the fatty acids tested decreased mitochondrial matrix NAD(P)H content, and the further addition of rotenone only reverted AO-induced effect, indicating that these reduced equivalents might be lost from the mitochondrial matrix. AD and AcD also induced a mitochondrial swelling, suggesting that these fatty acids act as uncouplers probably due to a non-selective mitochondrial inner-membrane. We also evaluated the effect of the same fatty acids on oxidative stress parameters. We first observed that lipid peroxidation was increased in the presence of AO, AD and AcD, as observed by the increase in the thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels and spontaneous chemiluminescence. AD and AcD also caused protein oxidative damage, since they increased carbonyl content and decreased sulfhydryl group content. All the fatty acids tested also decreased the non-enzymatic antioxidant defenses, as they decreased the total radical-trapping antioxidant potential (TRAP). However, only AD and AcD decreased reduced glutathione (GSH) levels, the major antioxidant in the cell. AcD did not induce an increase in TBA-RS levels in mitochondrial preparations, suggesting that mitochondria were not involved in AcD-induced effects. Furthermore, AD did not alter GSH levels and sulfhydryl group content in cytosolic preparations, suggesting a role for mitochondria in AD-induced effects. Taken together, these results suggest that the MCADD accumulating fatty acids cause important neurotoxic effects. Thus, it is feasible that a mitochondrial dysfunction and oxidative stress, allied to other possible toxic effects, act synergistically, collaborating to the neurological damage found in MCAD-deficient patients.

As deficiências da proteína trifuncional mitocondrial (MTP) e da desidrogenase de acil-CoA de cadeia longa hidroxilada (LCHAD) são defeitos hereditários da β-oxidação de ácidos graxos. Pacientes afetados por essas deficiências apresentam acúmulo de 3-hidroxiácidos de cadeia longa, como os ácidos 3-hidroxidodecanóico (3HDA), 3-hidroxitetradecanóico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico (3HPA) em tecidos e líquidos biológicos. A apresentação clínica é caracterizada por encefalopatia com coma, letargia, convulsão, retardo mental e hipotonia, além de disfunção hepática, cardiomiopatia, fraqueza muscular e retinopatia. Considerando que a fisiopatologia dos sintomas neurológicos dessas doenças ainda não está bem estabelecida e que tem sido levantada a hipótese de que os ácidos graxos acumulados nessas doenças possam exercer efeitos tóxicos, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos in vitro dos ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA sobre parâmetros de estresse oxidativo e da homeostase mitocondrial em cérebro de ratos de 30 dias de vida. Inicialmente, observamos que o 3HDA, 3HTA e 3HPA induziram um aumento na peroxidação lipídica evidenciado por um aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Os ácidos 3HTA e 3HPA também causaram dano oxidativo proteico, visto que aumentaram o conteúdo de carbonilas e diminuíram o conteúdo de grupamentos sulfidrila. Além disso, 3HTA e 3HPA diminuíram os níveis de glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante não-enzimático presente no cérebro, sem no entanto, alterar a produção de nitratos e nitritos. O ácido 3HTA apresentou o efeito mais pronunciado nos parâmetros testados e a adição dos antioxidantes e sequestradores de radicais livres trolox e deferoxamina (DFO) foram capazes de prevenir parcialmente o dano oxidativo lipídico, ao passo que DFO preveniu totalmente a redução dos níveis de GSH. Além disso, os ácidos 3HDA, 3HTA e 3HPA aumentaram o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuíram os valores do índice de controle respiratório. 3HTA e 3HPA também diminuíram o potencial de membrana e o conteúdo de equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondrial, sugerindo um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa. Além disso, o 3HTA diminuiu o estado 3 da respiração e a razão ADP/O quando utilizado glutamato/malato como substrato, mas não quando utilizado piruvato/malato ou sucinato como substratos, sugerindo que o transporte de glutamato e/ou sua oxidação possam estar sendo inibidos pela presença deste ácido. Nossos resultados sugerem que os ácidos graxos acumulados na deficiências da LCHAD e MTP induzem estresse oxidativo e comprometem a homeostase mitocondrial, mecanismos que potencialmente podem estar envolvidos no dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados por essas deficiências. / Mitochondrial trifunctional protein (MTP) and isolated long-chain 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) deficiencies are inborn errors of metabolism of fatty acid oxidation. Affected patients present blood and tissue accumulation of the 3-hydroxy fatty acids, such as 3-hydroxydodecanoic (3HDA), 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids. Clinical presentation is characterized by a encephalopathic crises with coma, lethargy, seizures, mental retardation and hypotonia, besides hepatic disfunction, cardiomiopathy and muscle weakness and retinopathy. Considering that the pathophisiology of the neurological damage found in LCHAD/MTP-deficient patients is not yet clear, and it has been proposed that accumulating fatty acids could present toxic effects, the aim of the present work was to investigate the in vitro effects of 3HDA, 3HTA and 3HPA on oxidative stress parameters and on mitochondrial homeostasis in 30-day-old rat brain. It was first verified that 3HDA, 3HTA and 3HPA significantly induced lipid peroxidation, as determined by increased thiobarbituric acid-reactive substances levels. In addition, carbonyl formation was significantly increased by 3HTA and 3HPA, whereas sulfhydryl content was decreased, which indicates that these fatty acids elicit protein oxidative damage. 3HTA and 3HPA also diminished the reduced glutathione (GSH) levels, the main brain non-enzymatic antioxidant defense, without affecting nitrate and nitrite production. Finally, we observed that 3HTA elicited the most pronounced effects on the tested parameters and the addition of antioxidants and free radical scavengers trolox and deferoxamine (DFO) were able to partially prevent lipid oxidative damage, whereas DFO fully prevented the reduction on GSH levels induced by this fatty acid. We also found that 3HDA, 3HTA and 3HPA markedly increased state 4 respiration and diminished the respiratory control ratio. 3HTA and 3HPA also diminished the mitochondrial membrane potential and the matrix NAD(P)H levels, suggesting an uncoupler effect of oxidative fosforilation . In addition, 3HTA decreased state 3 of respiration and ADP/O ratio, when used glutamate/malate as substrates, but not when piruvate/malate or succinate were used as substrates, suggesting that glutamate transport and/or oxidation could be inhibited by this fatty acid. Taken together, these results suggest that the fatty acids accumulating in LCHAD/MTP induce oxidative stress and impair mitochondrial homeostasis, mechanisms that potentially may be involved on the neurological damage found in affected patientes.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde. / Ethylmalonic acid (EMA) accumulates in tissues and biological fluids of patients affected by short-chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (SCADD) and ethylmalonic encephalopathy, illnesses characterized by neurological and muscular symptoms. Considering that the mechanisms responsible for the brain and skeletal muscle damage in these diseases are poorly known, in the present work we investigated the effects of acute EMA administration on oxidative stress parameters in cerebral cortex and skeletal muscle from 30-day-old rats. Animals received three subcutaneous injections of EMA (6 mol/g; 90 min interval between injections) and were killed 1 h after the last injection. Control animals received saline in the same volumes. EMA administration significantly increased thiobarbituric acid-reactive substances levels in cerebral cortex and skeletal muscle, indicating an increased lipid peroxidation. In addition, carbonyl content was increased in EMA-treated animal skeletal muscle when compared to the saline group. EMA administration also significantly increased DCFH oxidation and superoxide production (reactive species markers), and decreased glutathione peroxidase activity in cerebral cortex, while glutathione levels were decreased in skeletal muscle. The present results show that acute EMA administration elicits oxidative stress in rat brain and skeletal muscle, suggesting that oxidative damage may be involved in the pathophysiology of the brain and muscle symptoms found in patients affected by SCADD and ethylmalonic encephalopathy. / O ácido etilmalônico (EMA) se acumula em tecidos e fluidos biológicos de pacientes afetados pela deficiência da desidrogenase de acil-coenzima A de cadeia curta (SCADD) e pela encefalopatia etilmalônica (EE). Ambas as doenças caracterizam-se por sintomas neurológicos e musculares. O presente trabalho investigou os efeitos da administração aguda de EMA sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral e músculo esquelético de ratos de 30 dias de vida. Os animais receberam três injeções subcutâneas de EMA (6 μmol/g; 90 minutos de intervalo entre as injeções) e foram eutanasiados 1 hora após a última injeção. Os animais do grupo controle receberam solução salina nos mesmos volumes. A administração de EMA aumentou significativamente os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e o conteúdo de grupamentos carbonila em córtex cerebral e músculo esquelético, quando comparados ao grupo controle. A administração aguda de EMA também aumentou significativamente a oxidação de 2’,7’-diclorofluoresceína reduzida e a geração de ânion superóxido. Por outro lado, a atividade da enzima glutationa peroxidase em córtex cerebral foi inibida pela administração de EMA, em comparação ao grupo controle. Adicionalmente, os níveis de glutationa reduzidas encontraram-se diminuídos no músculo esquelético dos animais que receberam a administração aguda de EMA. Os resultados do presente estudo mostram que a administração aguda de EMA induz estresse oxidativo em córtex cerebral e músculo esquelético de ratos jovens, sugerindo que o dano oxidativo possa estar envolvido na fisiopatologia dos danos neurológicos e musculares encontradas em pacientes afetados por SCADD e EE.

A deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCAD) é o mais frequente defeito de oxidação de ácidos graxos, caracterizado bioquimicamente pelo acúmulo tecidual predominante dos ácidos graxos de cadeia média octanoato (AO), decanoato (AD) e cis-4-decenoato (AcD). Embora os sinais clínicos dos afetados sejam fundamentalmente neurológicos, os mecanismos fisiopatológicos do dano do sistema nervoso central apresentado pelos pacientes afetados por esse distúrbio ainda não estão esclarecidos. Tem sido, no entanto, levantada a hipótese de que os ácidos graxos acumulados nesta doença possam exercer efeitos tóxicos. Neste cenário, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos in vitro dos ácidos AO, AD e AcD sobre parâmetros de função mitocondrial e de estresse oxidativo em cérebro de ratos de 30 dias de vida, uma vez que o metabolismo energético é muito ativo e as defesas antioxidantes estão diminuídas neste tecido. Inicialmente, observamos que todos os ácidos graxos testados dimuíram o potencial de membrana mitocondrial em preparações mitocondriais de cérebro de ratos, sendo que as concentrações mais altas testadas do AD e do AcD exerceram efeitos comparáveis ao de um clássico desacoplador da fosforilação oxidativa, sugerindo que estes ácidos graxos atuem como desacopladores. Os ácidos AO, AD e AcD também aumentaram o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuíram os valores do índice de controle respiratório. Além disso, o AD e o AcD diminuíram o estado 3 da respiração tanto com glutamato/malato quanto com succinato como substratos, enquanto que o AO dimiuiu o mesmo parâmetro apenas com o succinato. Também encontramos uma diminuição na razão ADP/O na presença de AD e AcD. O atractilosídeo, inibidor do translocador de nucleotídeos de adenina (ANT), foi capaz de impedir parcialmente o efeito desacoplador do AD, sem alterar os efeitos do AO e do AcD, sugerindo um envolvimento deste translocador no efeito desacoplador do AD. O AO e o AD também diminuíram o consumo de oxigênio em mitocôndrias desacopladas. O AcD também diminuiu a produção de peróxido de hidrogênio, sendo seu efeito maior do que o da rotenona, que inibe o fluxo reverso de elétrons. Os AO e AD diminuíram as atividades dos complexos I-III e IV da cadeia transportadora de elétrons, e o AD também inibiu a atividade do complexo II-III. Todos os três ácidos graxos testados diminuíram o conteúdo de equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondrial e a posterior adição de rotenona apenas reverteu o efeito do AO, sugerindo que estes equivalentes estejam sendo perdidos para o meio extramitocondrial. Os ácidos AD e AcD também induziram um maior inchamento mitocondrial, sugerindo que estes ácidos graxos possam atuar como desacopladores provavelmente devido a uma permeabilização nãoseletiva da membrana mitocondrial interna. Também avaliamos o efeito dos mesmos ácidos graxos sobre parâmetros de estresse oxidativo. Observamos que o AO, o AD e o AcD induziram um aumento na peroxidação lipídica em córtex cerebral de ratos, evidenciado por um aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e na medida de quimioluminescência espontânea. Os AD e AcD também causaram dano oxidativo proteico, visto que aumentaram o conteúdo de carbonilas e diminuíram o conteúdo de grupamentos sulfidrila. Além disso, todos os ácidos graxos testados diminuíram as defesas antioxidantes não-enzimáticas, evidenciado pela diminuição do potencial antioxidante total do tecido (TRAP). Entretanto apenas o AD e o AcD diminuíram os níveis de glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante não-enzimático presente no cérebro. O AcD não ocasionou um aumento nos níveis de TBA-RS em preparações mitocondriais de cérebro de ratos, sugerindo que outros componenentes celulares sejam essenciais para os efeitos pró-oxidantes deste ácido graxo. Entretanto, não foi observado nenhum efeito do AD sobre níveis de GSH e o conteúdo de grupamentos sulfidrila em preparações citosólicas, sugerindo um papel para a mitocôndria nos efeitos causados por este ácido graxo. Devemos também enfatizar que os efeitos mais pronunciados foram verificados pelo AcD, seguido do AD e por último do AO. Estes resultados, tomados em seu conjunto, indicam que os principais metabólitos acumulados na deficiência de MCAD exercem efeitos neurotóxicos importantes. Dessa forma, é possível que uma disfunção mitocondrial e o estresse oxidativo, possivelmente com outros mecanismos, atuem sinergicamente, colaborando para o dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados pela deficiência da MCAD. / Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) deficiency (MCADD) is the most frequent fatty acid oxidation disorder, leading to the accumulation of octanoic (AO), decanoic (AD) and cis-4-decenoic (AcD) acids. Considering that the pathophisiology of the neurological damage found in MCAD-deficient patients is not clear yet, and that a role for neurotoxic accumulating metabolites has been considered, the aim of the present work was to investigate the in vitro effect of AO, AD and AcD on mitochondrial function and oxidative stress parameters in 30-dayold rat brain. Initially we investigated the effect of these fatty acids on mitochondrial homeostasis, and we found that all these three metabolites diminished the mitochondrial membrane potential in mitochondrial preparations of rat brain, and the effects of the highest concentration of AD and AcD were similar to the CCCP effect, a classical uncoupler, suggesting that these fatty acids act as uncouplers of oxidative phosphorylation. AO, AD and AcD also increased state 4 respiration and decreased respiratory control ratio. AD and AcD also decreased state 3 respiration with either glutamate/malate or succinate as substrates, while AO only decreased in the presence of succinate. We also observed a decrease in the ADP/O ratio caused by AD and AcD. Atractyloside, an inhibitor of adenine nucleotide transporter (ANT), mildly prevented the uncoupler effect of AD, without any effect of AcD- and AO-induced effects, suggesting a role for ANT on AD-induced effects. AO and AD also diminished uncoupled state (state U) in mitochondrial preparations. AcD also decreased hydrogen peroxide production, and this effect was greater than rotenone effect, which inhibits the reverse electron flow. AO and AD inhibited the activities of the respiratory chain complexes I-III and IV, and AD also inhibited complex II-III activity. All the fatty acids tested decreased mitochondrial matrix NAD(P)H content, and the further addition of rotenone only reverted AO-induced effect, indicating that these reduced equivalents might be lost from the mitochondrial matrix. AD and AcD also induced a mitochondrial swelling, suggesting that these fatty acids act as uncouplers probably due to a non-selective mitochondrial inner-membrane. We also evaluated the effect of the same fatty acids on oxidative stress parameters. We first observed that lipid peroxidation was increased in the presence of AO, AD and AcD, as observed by the increase in the thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels and spontaneous chemiluminescence. AD and AcD also caused protein oxidative damage, since they increased carbonyl content and decreased sulfhydryl group content. All the fatty acids tested also decreased the non-enzymatic antioxidant defenses, as they decreased the total radical-trapping antioxidant potential (TRAP). However, only AD and AcD decreased reduced glutathione (GSH) levels, the major antioxidant in the cell. AcD did not induce an increase in TBA-RS levels in mitochondrial preparations, suggesting that mitochondria were not involved in AcD-induced effects. Furthermore, AD did not alter GSH levels and sulfhydryl group content in cytosolic preparations, suggesting a role for mitochondria in AD-induced effects. Taken together, these results suggest that the MCADD accumulating fatty acids cause important neurotoxic effects. Thus, it is feasible that a mitochondrial dysfunction and oxidative stress, allied to other possible toxic effects, act synergistically, collaborating to the neurological damage found in MCAD-deficient patients.