Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-26T17:48:32Z No. of bitstreams: 1 clarissa_c_menezes_ioc_bcm_0054_2011.pdf: 2530597 bytes, checksum: 62f04a75c90de18a85463693ba14fb9b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-26T17:48:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 clarissa_c_menezes_ioc_bcm_0054_2011.pdf: 2530597 bytes, checksum: 62f04a75c90de18a85463693ba14fb9b (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A bactéria Pseudomonas aeruginosa (PA) é um dos principais agentes etiológicos de pneumonias nosocomiais, cujo tratamento é dificultado por sua resistência a antibióticos e pela secreção de fatores de virulência. Novas alternativas para o tratamento destas infecções incluem manipular o sistema de comunicação bacteriano conhecido como quorum sensing (QS), reduzindo a expressão destes fatores de virulência e prevenindo seus efeitos deletérios em células e sistemas eucariotos. Os efeitos do componente de QS de PA 3-oxo dodecanoil homoserina lactona (3-oxo C12 HSL) nos pulmões não são conhecidos; portanto, a primeira etapa de nosso trabalho consistiu na caracterização dos efeitos desta molécula no ambiente pulmonar. Para isso, camundongos swiss desafiados com 3-oxo C12 HSL por via intratraqueal tiveram amostras de sangue, lavado bronco-alveolar (BAL) e tecido pulmonar e coletadas seis horas após o procedimento. Nossos resultados demonstram que inflamação pulmonar causada por 3-oxo C12 HSL se caracteriza pela migração de células mononucleares e neutrófilos para o espaço alveolar, níveis elevados de atividade mieloperoxidase no tecido pulmonar e formação de edema. A resposta inflamatória causada por 3-oxo C12 HSL não alterou os níveis de TNF-α, MIF, IL- 10 e IL-12 no tempo analisado. Foram observados aumentos nos níveis de IL-6, CCL2/MCP-1, CXCL1/KC e LTB4 no BAL de animais desafiados, sendo o aumento deste eicosanóide acompanhado por uma indução de corpúsculos lipídicos. Evidências in vitro relatam o envolvimento do receptor nuclear PPARγ nos efeitos pró-inflamatórios atribuídos a 3-oxo C12 HSL; portanto, decidimos estudar os efeitos do tratamento com o agonista de PPARγ rosiglitazona no modelo de inflamação pulmonar causado por este componente de QS. Nós observamos que o tratamento com rosiglitazona (0,5 mg/kg) uma hora após o estímulo diminuiu a formação de corpúsculos lipídicos e de edema pulmonar, causando também uma redução na migração de células mononucleares e neutrófilos e uma menor atividade mieloperoxidase no pulmão dos animais tratados. A redução da migração de células mononucleares parece estar associada à uma redução dos níveis de CCL2/MCP-1, enquanto o decréscimo nos neutrófilos parece envolver a modulação de CXCL1/KC. A instilação com 3-oxo C12 HSL diminuiu a expressão da enzima paraoxonase (PON) no tecido pulmonar, fenômeno que não foi revertido pelo tratamento com rosiglitazona nesta dose. Estudos demonstram que o PPARγ está envolvido na expressão de PON e que a superexpressão desta enzima é capaz de proteger animais da mortalidade por PA em função de sua atividade lactonase; por este motivo, decidimos testar uma dose maior de rosiglitazona (5 mg/kg) para alcançar mais um benefício nesta proposta terapêutica. O tratamento com rosiglitazona nesta dose foi capaz de reverter a redução da expressão de paraoxonase causada por 3-oxo C12 HSL, diminuindo a formação de edema, a migração de neutrófilos e os níveis de atividade mieloperoxidase no pulmão de animais desafiados. O número de células mononucleares recuperado no BAL de animais estimulados e tratados com a droga não foi reduzido, bem como os níveis de CCL2/MCP-1. De fato, a droga por si só causou um aumento de CCL2/MCP-1 que parece ter contribuído para a indução de corpúsculos lipídicos observada. Devido ao envolvimento de macrófagos e da quimiocina CCL2/MCP-1 no processo de eliminação bacteriana, estudos em modelos de pneumonia por PA precisam ser conduzidos para melhor avaliar esta dose de rosiglitazona e validar esta droga como uma estratégia terapêutica no combate à esta bactéria. / Pseudomonas aeruginosa (PA) is a major pathogen involved in nosocomial pneumonia. These infections are difficult to manage due bacterial antibiotic resistance and secretion of virulence factors; therefore, current approaches to treat PA infections now focus on manipulating the bacteria communication system known as quorum sensing in order to reduce the production of those virulence factors and mitigate their deleterious effects to the host. Since there are no reports about the effects of the PA main quorum sensing component 3-oxo dodecanoyl homoserine lactone (3-oxo C12 HSL) in the lung the first step of our work consisted in investigating the host pulmonary response to this molecule in a mouse model. In order to do so, swiss mice submitted to intratracheal instillation with 3- oxo C12 HSL had blood, BAL and lung tissue samples collected six hours after the procedure. Our results show that the inflammatory response elicited by 3-oxo C12 HSL is characterized by the migration of both mononuclear cells and neutrophils to the alveolar space, together with high levels of myeloperoxidase activity in lung tissue and development of pulmonary edema. We found that the levels of TNF-α, MIF, IL-10 and IL-12 were not altered, while there was a significant increase in IL-6 CCL2/MCP-1 and CXCL1/KC in BAL. The increase in LTB4 levels in the BAL of defied animal was accompanied by an induction of lipid bodies. In vitro evidences report the involvement of the nuclear receptor PPARγ in the inflammatory events ascribed to 3-oxo C12 HSL; therefore, we decided to study the effects of PPARγ agonist rosiglitazone in the pulmonary inflammation caused by this quorum sensing component. We observed that rosiglitazone administration (0,5 mg/kg) one hour after stimulation was able to reduce the formation of lipid bodies and pulmonary edema, besides decreasing the migration of mononuclear cells, neutrophils and myeloperoxidase activity in the lung of defied animals. This reduction in the migration of mononuclear cells seems to be due to a decrease in the levels of CCL2/MCP-1, while the impairment in neutrophil migration seems to involve the modulation of CXCL1/KC. 3-oxo C12 HSL instillation also decreased paraoxonase (PON) expression in lung tissue, which was not reverted by rosiglitazone treatment at this dose. Since it was reported that PPARγ is able to regulate PON expression and that the overexpression of this enzyme seems to protect animals from PA mortality due its lactonase activity we searched to modulate this enzyme with a higher dose of rosiglitazone (5 mg/kg) in order to achieve this extra benefit in our proposal. We observed that this dose was able to revert the decrease in PON expression caused by 3-oxo C12 HSL, reducing the pulmonary edema, neutrophil migration and myeloperoxidase activity in defied animals. There was no reduction in the number of mononuclear cells recovered from the BAL of stimulated animals, which was also observed for CCL2/MCP-1 levels. In fact, the drug itself at his dose caused an increase in CCL2/MCP-1 that possibly accounted for the induction of lipid bodies. Because macrophages and CCL2/MCP-1 have a crucial role in the clearance of bacteria, this dose of rosiglitazone has to be tested in a PA pneumonia model so the effects observed in our investigation can be validate rosiglitazone as an therapeutic approach to the treatment of these infections.