Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1425522 bytes, checksum: 6c4fc6ad33dadc94d0af11b40c2fa78f (MD5) Previous issue date: 2010-09-20 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Somatic embryogenesis is a useful tool for plant propagation and a suitable model system for deciphering early events during embryo development. Molecular and genetic studies focused in plant development have reported the involvement of SERK (Somatic Embryogenesis Receptor Kinase) gene in the acquisition of embryogenic competence. In order to increase the efficiency of plant regeneration processes we need to understand it better. Therefore, the purpose of the present work was to determine if the SERK gene is present in the soybean genome and analyze its expression during somatic embryogenesis. Genes encoding tree novel members of the Leucine-rich repeat receptor like kinase (LRR-RLK) superfamily have been identified. These genes was named GmSERK1, GmSERK2 and GmSERK3, since they share a conserved intron/exon structure with other members of the SERK family and encode a signal peptide, a leucine zipper domain, five LRR, the SPP domain, a single transmembrane domain and a kinase domain with 11 subdomains, features that distinguishes SERK proteins from other proteins belonging to the LRRRLK superfamily. To investigate the position of GmSERK proteins in the plant LRR-RLKs superfamily, the conserved parts of the extracellular or intracellular domains were compared to other published LRR-RLKs sequences taken from literature. In the LRR domain, SERK proteins share all conserved amino acids of the plant LRR consensus sequence. Moreover, conservations of an aspartic acid (D) at position 1, an asparagine (N) at position 4 and a glycine (G) at position 16 were observed, although they are not consensus between other LRRs. A phylogenetic tree was constructed based on kinase domains and results showed that SERK proteins form a distinct branch in the phylogenetic tree and GmSERKs clustered most closely with SERK gene members such as Medicago truncatula (MtSERK1), ix Teobroma cacao (TcSERK) and Solanum tuberosum (StSERK1). Treatment of explants with 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (40 mg/L) was effective in inducing somatic embryos derived from the cultivar CAC-1 and a large number of globular embryos could be viewed after 30 days. However, it was observed a strong effect of the genotype in the morphogenic response. Unlike CAC-1, explants derived from the cultivar CS303 showed a low frequency of induction and only a small number of somatic embryos were obtained. Analysis of gene expression, performed by in situ hybridization, showed that a high level of GmSERK1 transcripts could be detected in embryogenic tissues of CAC-1 during the induction of somatic embryogenesis. In contrast, immature cotyledons of soybean cultivar CS303 showed low levels of GmSERK1 transcripts. These results suggest the involvement of GmSERK1 gene with somatic embryogenesis, probably acting as an important player in acquisition of embryogenic competence. / A embriogênese somática é uma ferramenta útil para a propagação de plantas e consiste num sistema modelo adequado para a elucidação de eventos iniciais do desenvolvimento embrionário. Estudos genéticos e moleculares focados no desenvolvimento vegetal têm relatado o envolvimento do gene SERK (Somatic Embryogenesis Receptor Kinase) no processo de aquisição de competência embriogênica. Para que seja possível o aumento da eficiência dos processos de regeneração de plantas, é preciso compreendê-los melhor. Dessa forma, os objetivos do presente trabalho foram determinar se o gene SERK está presente no genoma da soja e analisar a sua expressão durante a indução de embriogênese somática. Genes que codificam três novos membros da superfamília de receptores cinase ricos em leucina (LRR-RLK - Leucine-rich repeat receptor like kinase) foram identificados. Esses genes foram denominados GmSERK1, GmSERK2 e GmSERK3, já que compartilham com outros membros da família SERK uma conservada estrutura íntron/éxon e codificam um peptídeo sinal, um zíper de leucina, cinco repetições de leucina (LRR), um domínio rico em prolina (SPP - serine proline proline), um domínio transmembrana e um domínio cinase com 11 subdomínios, características que distinguem os receptores SERK dos demais membros da superfamília LRR-RLK. Com o objetivo de verificar a posição das proteínas GmSERK dentro da superfamília de LRR-RLKs de plantas, partes conservadas de seus domínios extracelular e intracelular foram comparadas a outras sequências de LRR-RLKs retiradas da literatura. Em relação ao domínio LRR, verificou-se que as proteínas SERK apresentam todos os aminoácidos conservados da sequência consenso das LRR de plantas. Além disso, a conservação dos resíduos de ácido aspártico (D) na posição 1, asparagina (N) na posição 4 e glicina (G) na posição 16 em proteínas da família SERK foi observado, embora não seja consenso entre as LRRs de plantas. Uma árvore filogenética foi construída com base nos domínios cinase e os resultados mostraram que as proteínas SERK formam um ramo distinto dos outros tipos de receptores LRR-RLKs e as GmSERKs agrupam-se melhor com outros membros da família SERK, como as de Medicago truncatula (MtSERK1), Teobroma cacao (TcSERK) e Solanum tuberosum (StSERK1). O tratamento dos explantes com ácido 2,4-diclorofenoxiacético (40 mg/L) mostrou-se eficiente em induzir embriões somáticos a partir da cultivar CAC- 1 e um grande número de embriões globulares pode ser visualizado após 30 dias de cultivo. Entretanto, um grande efeito do genótipo na resposta morfogênica foi observado. Ao contrário de CAC-1, explantes derivados da cultivar CS303 apresentaram uma baixa freqüência de indução e apenas um pequeno número de embriões somáticos foi obtido. As análises de expressão, realizadas por meio da técnica de hibridização in situ, mostraram que um alto nível de transcritos correspondentes ao gene GmSERK1 pôde ser detectado em tecidos embriogênicos de CAC-1 durante a fase de indução de embriogênese somática. Em contraste, cotilédones imaturos da cultivar de soja CS303 apresentaram um baixo acúmulo de transcritos de GmSERK1. Estes resultados sugerem o envolvimento do gene GmSERK1 no processo de embriogênese somática, provavelmente atuando como um importante fator na aquisição de competência embriogênica.

(in English): This thesis focuses on pragmatic competence of Czech students of Japanese, specifically on the speech act of refusal. The aim is to find out how students differ in comparison to native speakers of Japanese. Another aim is to compare Japanese students based on the length of their stay in Japan, their Japanese proficiency, and the textbook used at the beginner level. The theoretical part describes pragmatic competence, politeness theory, the speech act of refusal and its specifics in Japanese. The practical part focuses at the analysis of refusals from the Discourse Completion Task (DCT) using semantic formulas. Usage of these formulas by native speakers and student are then compared. Found differences from the native speakers are further examined among students according to Japanese proficiency, length of their stay in Japan and textbook used at the begginer level. Finally, the results are summarized.