La dystrophine est une très grande protéine codée le gène DMD et située sous la membrane plasmique des fibres musculaires. Elle joue un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité de la cellule musculaire lors des cycles de contraction/relaxation. Cette protéine filamenteuse est composée de quatre domaines structuraux dont le domaine central composé de 24 répétitions homologues à la spectrine. Chaque répétition est organisée en faisceau de trois α-hélices appelé « coiled-coil ». Des mutations du gène DMD sont à l’origine des myopathies de Duchenne (DMD) et de Becker (BMD) qui s’accompagnent d’un déficit total ou d’une dystrophine mutée et induisent de ruptures fréquentes de la membrane des cellules musculaires. La connaissance de la structure de la dystrophine est nécessaire au développement de thérapies à ce jour inexistantes pour les myopathies. Au laboratoire, des données structurales du domaine central de la dystrophine ont été acquises par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS, Small Angles X-ray Scattering). Cette thèse présente le développement d’une approche multi-échelle combinant des données expérimentales SAXS et des données in silico pour la reconstruction de modèles haute-résolution des fragments du domaine central de la dystrophine et d’un fragment muté observé dans une mutation BMD fréquente. Nous avons également cartographié l’interaction de ce domaine central avec deux de ses partenaires fonctionnels importants, l’actine filamenteuse et avec la nitroxyde synthase neuronale (nNOS) et proposé les premiers modèles atomiques des complexes macromoléculaires correspondants. L’ensemble de ces résultats permettra à terme l’optimisation de thérapies pour le traitement des dystrophies musculaires. / Dystrophin is a large protein encoded by DMD gene and located under the plasma membrane of muscle fibers. It plays an essential role in maintaining the integrity of muscle cells during contraction/relaxation cycles. This filamentous protein is composed of four structural domains including the central domain consisting of 24 spectrin-like repeats and four hinges. Each repetition is folded in three α-helices in a ‘coiled-coil’ assembly. Mutations in the DMD gene leads to Duchenne muscular dystrophy (DMD) and Becker (MDBs), which are accompanied by frequent plasma membrane ruptures, due to the loss or modification of dystrophin protein. There are very few structural data available concerning the central domain of dystrophin, which is subject to many mutations involved in DMD and BMD diseases. However, the description and the understanding to an atomic level of dystrophin structure and its interaction is essential for optimization of therapies. Given the impossibility to solve its structure by X-ray crystallography or NMR, structural data of the dystrophin central domain were acquired by small angles X-rays scattering (SAXS, Small Angles X-ray Scattering). This thesis presents the development of an innovative multi-scale approach combining experimental SAXS and in silico derived data, allowing the reconstruction of high-resolution models of dystrophin central domain fragments. Structural data were also obtained on a mutated dystrophin frequently observed in BMDs. Furthermore, we also mapped the interactions of the central domain with two of its majors functional partners, Filamentous actin and neuronal nitroxyde synthase (nNOS) and proposed models of the related macromolecular complexes. At long-term, all of these results will allow optimization of therapies for the treatment of muscular dystrophies.

Au sein des synapses comme dans les régions extra synaptiques, la diffusion latérale joue un rôle critique dans la densité membranaire des récepteurs. En face des zones actives, l’accumulation de récepteurs détermine en particulier l’efficacité de la transmission synaptique. Il est important de comprendre les paramètres cellulaires qui jouent sur l’accès au compartiment synaptique, qu’ils soient d’origine moléculaires ou morphologiques. Dans les synapses excitatrices, la tige de l’épine dendritique se comporte comme une barrière à la diffusion. Cette barrière pourrait être fonction de la longueur et du diamètre de la tige (paramètre géométrique), ou résider dans la présence d’éléments spécifiques constituant des obstacles à la diffusion. Une sous-population d’épines contient dans sa tige une forme spécialisée de réticulum endoplasmique, appelé appareil épineux et constituée d’un empilement des accules de réticulum. Une protéine liant l’actine, nommée synaptopodine, est associée de façon étroite à l’appareil épineux et participe aux mécanismes de plasticité synaptique. La question centrale de ce travail de thèse était de définir si la présence de synaptopodine influait sur les caractéristiques de la diffusion dans la tige de l’épine, et d’identifier les mécanismes sous-jacents. Afin d’étudier la diffusion membranaire, j’ai utilisé trois protéines recombinantes différentes: une protéine associée au feuillet extérieur de la membrane plasmique (GFP-GPI), une protéine avec un domaine transmembranaire et une courte séquence intracellulaire (TMD-pHluorin), et la sous-unitéGluR5 du récepteur métabotropique (mGluR5) contenant 7 domaines transmembranaires et une séquence intracellulaire volumineuse. Les trois constructions portent une étiquette (GFP ou pHluorin) du côté extracellulaire. Les propriétés diffusives de ces molécules ont été mesurées par un suivi de particules uniques, à base de quantum dots. Ces expériences ont révélé que la diffusion des protéines membranaires est fonction du diamètre de la structure cylindrique considérée, et par conséquent moins rapide dans la tige de l’épine que dans le tronc du dendrite. Mais les propritétés diffusives dépendent aussi de la taille et delà complexité des molécules membranaires considérées. En effet, la diffusion de molécules comportant des domaines transmembranaires est particulièrement faible dans les tiges contenant de la synaptopodine. Cet aspect a été approfondi par l’utilisation de traitements pharmacologiques, qui ont permis de modifier la structure interne de la tige dendritique. Les variations des tailles des domainesoccupés par l’actine-F, et par lesaggrégats de synaptopodine, ont été observées à l’échelle nanoscopique en utilisant l’imagerie PALM/STORM. En conditions contrôle, la synaptopodine occupe la partie centrale de la tige. La dépolymérisation indirecte de l’actine-F par le 4-Aminopyridineentraîne une diminution des zones occupées par ces deux composants, corrélée à une augmentation de la vitesse de diffusion de mGluR5. En revanche, la dépolymérisation par la latrunculin-A (effet direct sur l’actine) induit une augmentation de la taille des clusters de synaptopodine et donc de la surface occupée par ceux-ci dans la tige. Les mesures de la diffusion de la sous-unité mGluR5 réalisées dans ces conditions montrent une accélération de la vitesse de diffusion, indiquant que la mobilité de mGluR5 n’est pas régulée par une interaction directe avec la synaptopodine. En conclusion, je propose un rôle de stabilisation mutuel pourl’actine-F et la synaptopodinedans la tige des épines dendritiques de neurones d’hippocampe en culture. Les épines contenant de la synaptopodine dans leur tige auraient une organisation unique du cytosquelette qui agirait comme une barrière additionnelle pour la diffusion de récepteurs aux neurotransmetteurs. / Lateral diffusion in and outside synapses plays a key role in the accumulation of receptors at synapses, which critically determines the efficacy of synaptic neurotransmission. Therefore, to better understand the trapping of neurotransmitter receptors in synapses, it is important to investigate the mechanisms that may affect receptors diffusion and their capacity to reach synapses. The neck of dendritic spine imposes a diffusional barrier that is considered to depend on the length and diameter of the spine neck. The origin of this barrier could be purely geometrical or could be induced by the presence of specific barriers/obstacles for diffusion. A subpopulation of spines contains a specialized form of endoplasmic reticulum in the spine neck called spine apparatus. The actin-binding protein synaptopodin (SP) is tightly associated with the spine apparatus and participates in synaptic plasticity mechanisms. The central question of my research was to assess whether the presence of the SP affects the diffusion of receptors in the spine neck and to characterize the underlying molecular mechanisms. To study membrane diffusion, I have developed three different probes: a construct associated with the outer leaflet of the plasma membrane (GFP-GPI), a construct with one transmembrane domain and a short intracellular sequence (TMD-pHluorin), and a recombinant metabotropic mGluR5 receptor construct containing an extracellular domain tagged with pHluorin, seven transmembrane domains, as well as a large intracellular region. The diffusion properties of these molecules were measured by single particle tracking using quantum dots. My experiments revealed that the diffusion of membrane proteins was slower in the spine neck than in the dendrite as a result of the different diameter of the two compartments. Furthermore, the diffusion properties depended on the molecular size and complexity of the membrane proteins. Interestingly, the diffusion of membrane proteins with transmembrane domains was particular slow in spine necks containing SP. This could be the result of direct molecular interactions between the membrane proteins and SP or due to spatial constraints that are related to the structural organization of spine necks expressing SP. To address these questions further I used pharmacological treatments to change the internal organization of the spine neck, and measured their effect on the diffusion properties of mGluR5. The distribution of SP and F-actin in the spine neck was determined on the nanoscopic scale using PALM/STORM imaging. This showed that under control condition SP occupies only the central region of the spine neck. Activity-dependent depolymerization of F-actin by 4-Aminopyridine led to a simultaneous decrease of the amount of F-actin and SP and enhanced the diffusion of mGluR5 in all analyzed neck regions. Disruption of F-actin by latrunculin A induced the re-distribution of SP and the formation of larger SP clusters, occupying an increased region within the spine neck. The recruitment of SP was accompanied by an acceleration of mGluR5 diffusion in SP-positive spines, demonstrating that the mobility of mGluR5 is not controlled by direct interactions with SP. Instead, the diffusion of mGluR5 is dependent on the organization of the spine cytoskeleton. In conclusion, I propose that SP and the polymerization of actin filaments have a reciprocal effect on the stability of each other in the spine neck of cultured hippocampal neurons. Spine necks bearing SP have a unique F-actin cytoskeletal organization that acts as an additional diffusion barrier for neurotransmitter receptors such as mGluR5.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Lors de leur différenciation, les neurones développent deux types de prolongements cytoplasmiques, dendrites et axones. L'élaboration de ces prolongements est médiée par les éléments du cytosquelette, plus particulièrement, les microtubules et les microfilaments d'actine (actine-F). L'expression de la protéine associée aux microtubules-2 (MAP-2) est nécessaire au développement des neurites mineures, les premiers prolongements cytoplasmiques émis par un neurone. Ceux-ci n'ont pas une identité dendritique ou axonale. Par la suite, l'expression de MAP2 est nécessaire au développement et au maintien des dendrites. L'expression de MAP2 est régulée par épissage alternatif au cours de la différenciation neuronale. Il existe quatre isoformes de la protéine MAP2, MAP2a, MAP2b, MAP2c et MAP2d. MAP2b et MAP2c sont les isoformes les mieux caractérisées. Elles peuvent être subdivisées en deux domaines: un domaine de liaison aux microtubules situé en C-terminal et un domaine de projection en N-terminal. Le domaine de liaison aux microtubules est responsable de l'interaction de MAP2 avec les microtubules alors que le rôle du domaine de projection n1est toujours pas clairement défini. MAP2c est exprimée dans les neurones immatures alors que MAP2b est présente dans les neurones immatures et matures. Dans les neurones immatures, ces deux isoformes se retrouvent dans les neurites mineures et elles sont ciblées préférentiellement dans les dendrites au cours de la différenciation neuronale. Le rôle respectif de MAP2b et MAP2c dans l'élaboration de prolongements cytoplasmiques par un neurone demeure inconnu. MAP2b et MAP2c diffèrent par la présence d'une séquence additionnelle de 1372 acides aminés dans le domaine de projection de MAP2b. L'insertion d'une séquence aussi importante dans le domaine de projection de MAP2b indique que ce domaine joue un rôle important. Le but de la présente étude consiste à mieux comprendre le rôle de cette séquence dans la fotmation de prolongements cytoplasmiques. Pour cette analyse fonctionnelle, nous avons produit six formes tronquées de MAP2b qui contiennent des délétions dans le domaine de projection de MAP2b. Ces formes tronquées de MAP2b ont été exprimées dans les cellules ovariennes Spodoptera frugiperda (Sf9). En effet, ce système cellulaire est très intéressant puisque nous avons démontré que l'expression de MAP2b et MAP2c dans ces cellules résulte en la formation de prolongements cytoplasmiques. Cependant, ces deux isoformes de MAP2 induisent des patterns distincts de formation de prolongements cytoplasmiques. 60% des cellules qui expriment MAP2c développent des prolongements alors que 14% des cellules qui expriment MAP2b ont des prolongements. De plus, les cellules qui expriment MAP2c ont la tendance à développer des prolongements multiples alors que celles qui expriment MAP2b présentent un seul prolongement. Nos présents résultats démontrent que le domaine de projection de MAP2b a un effet inhibiteur sur la capacité du domaine de liaison aux microtubules à induire la formation de prolongements cytoplasmiques. En effet, 53% des cellules qui n'expriment que le domaine de liaison aux microtubules ont des prolongements en comparaison à 14% des cellules qui expriment MAP2b. De plus, l'expression de trois formes tronquées de MAP2b qui ont une délétion partielle de la séquence additionnelle de 1372 acides aminés induit un plus grand pourcentage de cellules avec prolongements (27%, 31 % et 41 % ). Toutefois, la séquence commune à MAP2c et MAP2b qui est située à l'extrémité 5' du domaine de projection semble favoriser la formation de plusieurs prolongements puisque sa délétion résulte en un plus faible pourcentage de cellules avec des prolongements multiples. Nos résultats suggèrent donc que l'insertion de la séquence additionnelle de 1372 acides aminés dans le domaine de projection de MAP2b diminue sa capacité à induire la formation de prolongements cytoplasmiques. Étant donné que MAP2b et MAP2c sont capables de se lier à l'actine-F et aux microtubules, nous avons examiné la distribution de ces deux éléments du cytosquelette dans les cellules Sf9 qui expriment les différentes formes tronquées de MAP2b. Toutes les formes tronquées de MAP2b induisent la formation de faisceaux de microtubules à l'exception des formes tronquées qui correspondent aux domaines de projection de MAP2c et de MAP2b. Dans les cellules qui présentent des prolongements, on note une réorganisation de l'actine-F. Dans les cellules qui expriment la forme mutante correspondant au domaine de projection de MAP2b, l'actine-F est distribuée sous forme d'un anneau sous la membrane plasmique. De plus, le domaine de projection a une distribution similaire. Ceci suggère que le domaine de projection de MAP2b interagit avec l'actine-F. Donc la séquence additionnelle de 13 72 acides aminés pourrait contenir un domaine de liaison à l'actine. En conclusion, nos résultats indiquent que MAP2b aurait une moins grande capacité que MAP2c à promouvoir la formation de neurites mais elle pourrait contribuer à leur stabilisation au cours de la différenciation neuronale par le fait qu'elle contient des domaines additionnels de liaison à l'actine.