Il y a une dizaine d'années, de nouvelles flavoenzymes nommées hydroxylases flavine-dépendantes à deux composants ont été identifiées chez certains microorganismes. Le rôle physiologique de ces enzymes est maintenant bien connu. Elles sont impliquées dans les processus de biosynthèse et de biodégradation d'une multitude de molécules organiques. Ces hydroxylases sont composées de deux enzymes distinctes. La première est une flavine réductase qui catalyse la formation de flavine réduite nécessaire au fonctionnement de la seconde enzyme, une monooxygénase flavine-dépendante. Au début de notre projet, le mécanisme enzymatique de ces nouvelles hydroxylases était encore inconnu. Pour comprendre le détail de leur fonctionnement, nous avons choisi d'étudier le système ActVA-ActVB, un nouveau membre de la famille des hydroxylases flavine-dépendantes impliqué dans la dernière étape de biosynthèse de l'actinorhodine, un antibiotique naturel synthétisé par Streptomyces coelicolor. La caractérisation préalable de ActVB avait permis de montrer que cette enzyme était une NADH:FMN oxydoréductase capable de catalyser la réduction du FMN par le NADH selon un mécanisme de type séquentiel ordonné. Nos résultats ont permis d'identifier ActVA-Orf5, une monooxygénase flavine-dépendante capable d'utiliser la flavine réduite fournie par ActVB pour catalyser l'hydroxylation du précurseur de l'actinorhodine, la DHK. Le mécanisme de transfert de flavine entre les deux protéines a été étudié. Pour cela, les constantes de dissociation du FMNox et FMNred vis-à-vis de ActVA et ActVB ont été déterminées. Nos donnés montrent clairement qu'à l'état réduit, la flavine est bien plus affine pour la monooxygénase ActVA que pour la réductase ActVB alors qu'à l'état oxydé, elle possède une meilleure affinité pour la réductase que pour la monooxygénase. Cette différence d'affinité permet d'orienter le transfert de flavine d'une protéine à l'autre sans nécessiter d'interaction entre les deux protéines. Nous avons montré de plus que ActVA avait la capacité de stabiliser un intermédiaire activé de l'oxygène, une espèce électrophile nommée C(4a)-hydroperoxyflavine, au sein de son site actif. Cet intermédiaire réagit très rapidement avec la DHK nucléophile pour former son analogue hydroxylé : la DHK-OH. En accord avec ce mécanisme, il semble que le pouvoir nucléophile du substrat est très important pour cette réaction car seule la forme réduite à deux électrons de DHK (hydroquinone) est hydroxylée. D'autre part, ActVA ne semble pas être très spécifique car elle parvient également à catalyser l'hydroxylation de l'énantiomère de la DHK, la NNM-A et de l'analogue lactonique de la NNM-A, la NNM-D. Finalement le système ActVA-ActVB n'a pas la capacité de dimériser la DHK-OH pour former l'actinorhodine et l'enzyme intervenant dans la dernière étape de cette biosynthèse reste à identifier.

Le monoxyde d'azote est exclusivement synthétisé chez les mammifères par une famille d'hémoprotéines, les NO-Synthases. Le cœur de l'activité des NO-Synthases est l'activation de l'oxygène c'est-à-dire l'activation de l'intermédiaire réactionnel FeIIO2. Cette étape est contrôlée par la réactivité intrinsèque du fer, par les transferts de proton et les transferts d'électron. Elle doit être parfaitement maîtrisée car elle contrôle le chemin catalytique emprunté et la nature du produit final. Comprendre l'étape d'activation de l'oxygène est essentiel à la compréhension du rôle biologique et/ou pathologique de la NO-Synthase de mammifère. Cette question s'étend aux NO-Synthases bactériennes pour lesquelles on ne connait ni le mécanisme moléculaire ni la fonction biologique. Ce manuscrit propose une analyse approfondie de l'étape d'activation de l'oxygène de la NO-Synthase. Dans un premier temps, nous avons étudié l'influence de l'environnement proximal sur la réactivité intrinsèque du fer et l'activation de l'oxygène. Nous avons généré des protéines mutées qui modifient les propriétés électroniques de la liaison proximale de l'hème. Ces protéines mutées ont été caractérisées par différentes spectroscopies (résonance paramagnétique électronique, Raman de résonance). Dans un second temps nous avons directement étudié le complexe FeIIO2, en présence d'analogues de substrat, grâce à des analyses de cinétique rapide en flux continu et en flux arrêté (stopped-flow). Dans un troisième temps, le rôle du cofacteur tetrahydrobioptérine dans le transfert de proton et d'électron a été étudié par une méthode de piégeage à des temps très courts : le freeze-quench. L'ensemble de nos résultats montrent que l'activation de l'oxygène est régulée par les propriétés électro-donneuses du ligand proximal et par le réseau de liaisons H distal. Nous mettons en évidence des différences dans le rôle redox du cofacteur tetrahydrobioptérine entre la NO-Synthase de mammifère et la NO-Synthase bactérienne. La difficulté majeure pour comprendre l'étape d'activation de l'oxygène de la NO-Synthase réside dans la complexité et la rapidité de la réaction catalytique. Dans ce contexte, nous avons cherché à adapter une méthodologie qui a prouvé son efficacité dans le cas des cytochromes P450 : la cryo-réduction couplée à des sauts en température.