La microscopie de fluorescence est devenue un outil incontournable en biologie. En particulier, il est possible de suivre dans le temps et dans l’espace en cellules vivantes l’activité de protéines en utilisant des biosenseurs FRET génétiquement encodés. Mon travail de thèse a consisté à développer de nouvelles méthodes de microscopie de fluorescence quantitative pour dépasser les limitations rencontrées dans le suivi de biosenseurs FRET. En premier lieu, j’ai eu à développer une méthodologie pour le suivi de deux biosenseurs FRET génétiquement encodés par mesure de durée de vie (FLIM) en simultané avec une seule longueur d’onde d’excitation. En effet, il n’est pas facile de suivre deux activités biochimiques par biosenseurs FRET dans un même échantillon vivant par microscopie de fluorescence à cause de l’existence de fuites spectrales dans les canaux de détection des différentes protéines fluorescentes et l’utilisation de deux longueurs d’onde d’excitation pour chacun des deux donneurs. En combinant les deux couples de protéines fluorescentes mTFP1/ShadowG et LSSmOrange/mKate2, les artefacts de fuite spectrale ont pu être négligés. Il a été possible de suivre les activités kinases des protéines ERK et PKA en simultané par FLIM. À l’aide de cette méthodologie, nous avons pu mettre en évidence une activation de la voie PKA lors d’une stimulation à l’EGF. En second lieu, j’ai développé une méthode pour le suivi de biosenseur FRET par la technique de spectroscopie à corrélation croisée de fluorescence (FCCS). Le suivi d’activité de certaines protéines peut s’avérer difficile du fait de leur faible expression au sein de l’échantillon vivant et de leur localisation. La méthode de FCCS nécessite une faible concentration de fluorophores et peut donc s’adapter à ces échantillons. Le FRET a un effet direct sur l’amplitude de corrélation croisée lorsque celle-ci est mesurée en suivant la co-diffusion de deux protéines fluorescentes attachées à un même biosenseur. Une diminution de ratio d’amplitude des courbes d’autocorrélation (verte ou rouge) sur l’amplitude de la courbe de corrélation croisée correspond à la présence de FRET. Nous avons pu mesurer cette diminution dans des cellules exprimant le biosenseur FRET Aurora A WT (FRET) en comparaison avec un mutant K162M (non FRET). Ces premiers résultats sont très prometteurs pour l’utilisation de cette approche au suivi d’un biosenseur faiblement exprimé en cellules vivantes. L’amélioration du suivi de biosenseur FRET, par les méthodes de microscopie de fluorescence quantitative présentées dans ce travail, doit pouvoir permettre la réponse à des questions d’intérêt biologiques nécessitant le suivi multiplex de FRET ou la mesure de biosenseurs à faible niveau d’expression, là où les techniques conventionnelles se heurtaient à leur limitation. / Fluorescence microscopy has become an invaluable tool in biology. In particular, it allows to follow in time and space the activity of proteins, using genetically encoded FRET biosensors, in live cell imaging. In my thesis work, I have developed new quantitative fluorescence microscopy methods to overcome the limitations encountered in monitoring FRET biosensors. First, I developed a methodology to monitor simultaneously two genetically encoded FRET biosensors by lifetime measures (FLIM) with a single excitation wavelength. Previously, it was not easy to follow two biochemical activities by FRET biosensors in the same live sample by fluorescence microscopy. Two reasons for that: the existence of spectral bleed through in the detection channel of each fluorescent proteins and the use of two excitation wavelengths for the two donors. By combining two fluorescent proteins pairs: mTFP1 / ShadowG and LSSmOrange / mKate2, the “spectral bleed through” artifact became negligible. It became then possible to follow the kinase activity of PKA and ERK proteins simultaneously by FLIM. Using this methodology, we were able to show an activation of the PKA pathway upon stimulation with EGF. Second, I developed a method to monitor FRET biosensor by fluorescence cross-correlation spectroscopy technique (FCCS). Monitoring the activity of certain proteins may be difficult due to their low expression in living sample and their sub-cellular localization. The FCCS methods requires a low concentration of fluorophores and can therefore be adapted to these samples. FRET has a direct effect on the cross-correlation amplitude when it is measured by following the co-diffusion of two fluorescent proteins attached to a same biosensor. An amplitude ratio decrease, of the autocorrelation curves (green or red) on the amplitude of the cross-correlation curve, corresponds to the presence of FRET. We were able to measure this ratio decreases in cells expressing the FRET biosensor Aurora A wild type (FRET) compared to the K162M mutant one (non-FRET). These first results are very promising to monitor the activity of a weakly expressed protein in living cells biosensor using this approach. The improvement of FRET biosensor monitoring, by quantitative fluorescence microscopy methods presented in this work, will help to answer biological questions of interest requiring the measurement of multiplex FRET monitoring or biosensors at low level expression, where conventional techniques are facing these limitations

Ce projet porte sur l’étude de plusieurs plantes d’intérêt de la Lorraine afin d’extraire par voie sèche et d’analyser des substances bioactives pour une valorisation de la flore locale. Un procédé de broyage et de tamisage de matériel végétal en de fines particules est utilisé afin de concentrer les composés bioactifs dans les poudres résultantes. Les poudres présentent des tailles de particules allant de 20 µm à 500 µm. Les propriétés phytochimiques de chaque classe granulométrique sont comparées à celle des parties de plantes non tamisées. Ces activités sont liées aux métabolites secondaires notamment les polyphénols et les dérivés terpéniques, qui sont caractérisés et quantifiés par des analyses LC-MS et GC-MS. Au cours de ce travail ont été développés : - la validation d’une nouvelle technique de séparation différentielle en fonction de la granulométrie des poudres par comparaison avec des extraits de plantes non tamisées ; - le dosage des différents constituants chimiques par des méthodes spectrométriques (UV/Visible), la caractérisation par des techniques analytiques telles que la LC-MS et GC-MS ; - l’évaluation du potentiel antioxydant/anti-radicalaire et anti-acétylcholinestérase réalisée par voie chimique in vitro en fonction des classes granulométriques. Cette étude démontre l’intérêt que présente ce nouveau procédé d’extraction différentiel des composés bioactifs issue de matrices végétales. Un enrichissement en produits actifs est observé au niveau de certaines classes granulométriques. Au niveau des activités antioxydantes pour toutes les plantes et de l’activité anti-acétylcholinestérase dans le cas du saule blanc, on observe des variations significatives en fonction de la taille de particules des échantillons des poudres superfines. L’étude de l’activité anti-acétylcholinestérase a été complétée par une modélisation in silico afin de mettre en évidence l’interaction entre les composés et les sites actifs de l’enzyme acétylcholinestérase / This project focuses on the study of 12 plants coming from Lorraine region. The study aims to improve the exploitation of local flora using a dry extraction process. A milling and a sieving process up to fine particles of plant material is used to concentrate the bioactive compounds in the resulting powders. The powders were classified according to the particle size which were ranging from 20 µm to 500 µm. The phytochemical properties of each particle size fraction are compared to non-sieved plant parts. These activities are linked to secondary metabolites including polyphenols and terpene derivatives, which are characterized and quantified by LC-MS and GC-MS analyses. It was developed in this work a new validation technique of differential separation depending on the particle size of the powders compared with extracts of non-sieved plant parts. The quantification of chemical compound classes was done by UV-Visible methods and their identification was conducted using LC-PDA/MS and GC-MS characterization technics. The evaluations of the antioxidant activity and anti-acetylcholinesterase activity is carried out in vitro according to the particle sizes. This study demonstrates the usefulness of this new differential extraction process of bioactive compounds from vegetal matrices. The Enhancing of the concentration of the active products is observed according to the particle sizes. In silico modeling study of anti-acetylcholinesterase activity is employed to highlight the interactions between the active sites and some anticipated active compounds in the extract

La découverte de nouveaux agents antipaludiques est primordiale. A travers le monde, les chercheurs se sont focalisés sur plusieurs stratégies. Les plus développées sont : soit les tests de molécules issues de bibliothèques chimiques dans une recherche phénotypique (comme le test direct d’agents sur des cultures de parasites in vitro), soit la recherche de nouvelles molécules agissant sur l’activité d’une cible ou d’une voie spécifique et essentielle. Cette thèse est centrée sur le second type d’approche. Nous nous sommes intéressés aux transporteurs membranaires de P. falciparum. Pour cela, nous exprimons les protéines d’intérêt dans la levure et nous les purifions. Nous optimisons les tests fonctionnels, dans le but de : a) déterminer l’effet des molécules sur les cibles spécifiques ; b) tester leur effet sur les cultures d’érythrocytes infectés par P. falciparum in vitro ; c) vérifier leur toxicité sur des cellules de mammifères ; et d) réaliser le test des molécules les plus efficaces in vivo dans un modèle de paludisme murin. Notre travail actuel est focalisé sur l’ATPase6 de P. falciparum (PfATP6) et l’adénylate translocase (PfAdT), deux protéines membranaires essentielles localisées respectivement sur le réticulum endoplasmique et la membrane mitochondriale. Nous exprimons de manière hétérologue PfATP6 dans les membranes de levure, nous purifions la protéine et mesurons une activité ATPase spécifique. Nous avons ainsi pu tester une bibliothèque chimique importante et identifier des inhibiteurs spécifiques. Ces derniers ont ensuite été testés pour évaluer leur effet sur les stades érythrocytaires du parasite in vitro et leur cytotoxicité sur des cellules de mammifères. Pour le transporteur PfAdT, nous procédons comme pour PfATP6, mais nous avons choisi un autre type de test fonctionnel dans lequel la protéine est directement exprimée sur la membrane plasmique d’E. coli. Cela devrait permettre de mesurer le transport d’ATP radiomarqué, et l’identification d’inhibiteurs spécifiques dont les effets pourront être évalués sur des cultures de parasites in vitro et dans des essais de cytotoxicité. / New drug discovery for malaria treatment urges, now more than ever. There is no optimal solution to the search for new antimalarials. Worldwide, researchers have focused their energies on several strategies. The most commonly employed are: either by screening molecules issued from chemical libraries in a phenotypic way (i.e., direct testing of drugs on in vitro parasite cultures), or by searching for new molecules acting upon the activity of a specific essential target or pathway. This PhD thesis centers on the second type of approach. We are interested in targeting membrane transporters of P. falciparum. For this, we plan to express proteins of interest in yeast and proceed to their isolation. With optimized functional tests, we aim to: a) Determine the effect of molecules upon specific targets; b) Test their effect on P. falciparum in vitro erythrocytes cultures; c) As well as verify their toxicity on mammalian cells; and d) Perform in vivo testing of the best molecules on a rodent model for malaria. Our actual work is focused on the P. falciparum Ca2+ - ATPase 6 (PfATP6) and adenylate translocase (PfAdT), two essential membrane proteins localized on the endoplasmic-reticulum and the mitochondrial membrane, respectively. We were able to express heterologously PfATP6 in yeast membranes, purify the protein and measure a specific ATPase activity. With this, we have tested a large chemical library and identified specific inhibitors. These were then tested for their effect on in vitro blood stages of P. falciparum and for their cytotoxicity on mammalian cells. For the ATP/ADP carrier PfAdT, we proceeded as previously done with PfATP6 but we have also chosen another type of functional test where we express directly this protein in the plasma membrane of E. coli. This will enable in the future the measurement of radiolabelled ATP uptake, and the identification of specific inhibitors that could then be tested for their effect on P. falciparum in vitro cultures and for their cytotoxicity.