Bestärkt durch das gesellschaftliche und wirtschaftliche Interesse an nachhaltigen und ressourcenschonenden Formen des Bauens gewinnen Holzkonstruktionen wieder unverkennbar an Bedeutung. Mit dieser Entwicklung bilden sich neue Konstruktionsprinzipien und Materialkombinationen im Bauwesen heraus, zu deren ingenieurtechnischer Beurteilung zum Teil keine ausreichenden Erkenntnisse vorliegen. Verbundkonstruktionen aus Holz und Glas sind eine innovative Bauweise, die zu einer höheren Materialeffizienz in Fassaden beiträgt, deren Wirkungsweise aber noch nicht ausreichend hinterfragt wurde. Werden Holz und Glas durch eine tragende Klebung verbunden, lässt sich das vielfach ungenutzte Tragpotenzial ausschöpfen, das eine in Scheibenebene belastete Verglasung aufweist. Die Qualität der Klebung entscheidet dabei über die Eigenschaften und das Leistungsvermögen des Bauteils. Die üblicherweise an dieser Schnittstelle eingesetzten Silikonklebstoffe weisen eine hohe Nachgiebigkeit und eine vergleichsweise geringe Festigkeit auf. Wenn die Verbundelemente als Aussteifung mitwirken sollen, bleibt ihr Einsatz deswegen auf Gebäude mit höchstens zwei Geschossen limitiert. Die vorliegende Arbeit trägt entscheidend zur Erweiterung der baulichen Möglichkeiten bei, indem sie der Anwendbarkeit von hochfesten Klebstoffen, die für den Einsatz im Bauwesen nur wenig erforscht sind, auf vielschichtige Weise nachgeht. Im Fokus stehen aussteifende Holz-Glas-Verbundelemente für die Fassade. Weder die Bauart noch das Bauprodukt Klebstoff sind derzeit in Deutschland in einer Norm erfasst. Das Klären der baurechtlichen Rahmenbedingungen ist daher unerlässlich und erfolgt mit engem Bezug zum konstruktiven Glasbau. Zusätzlich zur wissenschaftlichen Interpretation wird dadurch eine praxisnahe Bewertung der Versuchsergebnisse möglich, was ein Alleinstellungsmerkmal dieser Arbeit darstellt. Das Verformungsvermögen des Klebstoffs spielt eine zentrale Rolle bei der Materialauswahl und Gestaltung der Holz-Glas-Verbundelemente. Der Einfluss der Klebstoffsteifigkeit auf das Tragverhalten eines Einzelelements und auf dessen Interaktion mit den anderen Bestandteilen des Tragwerks wird an einem Modellgebäude untersucht. Auf Basis dieser Parameterstudie lassen sich drei Steifigkeitsbereiche definieren, auf die sich die Klebstoffauswahl für die weiteren Untersuchungen stützt. Der experimentelle Teil der Arbeit beginnt mit der ausführlichen Charakterisierung von sieben Klebstoffen. Davon werden zwei höherfeste Klebstoffe als geeignet identifiziert. Ein Silikonklebstoff wird als Referenzmaterial zur aktuellen Anwendungspraxis festgelegt. Das Hauptaugenmerk der folgenden Experimente richtet sich auf Aspekte der Alterungsbeständigkeit und des zeitabhängigen Materialverhaltens unter langandauernder mechanischer Beanspruchung. In labormaßstäblichen Alterungsprüfungen werden die Klebstoffproben unterschiedlichen Schadeinwirkungen ausgesetzt, die im Glas- und Fassadenbau relevant sind. Darüber hinaus erfolgen Kriechversuche an kleinen und großen Scherprüfkörpern. Letztere stellen einen besonderen Mehrwert dar, da sie eine realistische Klebfugengeometrie aufweisen und die Ergebnisse dadurch dem tatsächlichen Bauteilverhalten nahekommen. Für diese Zeitstandversuche wurde eine bislang einzigartige Versuchsanlage aus sechs Prüfrahmen mit Gasdruckfederbelastung entwickelt. Im Ergebnis zeigt sich, dass mit den gewählten höherfesten Klebstoffen die Festigkeit der nicht gealterten Klebschichten erwartungsgemäß gesteigert werden kann. Der Bruch des Fügepartners Holz wird zum maßgebenden Versagenskriterium. Die Verformungen des Verbundelements reduzieren sich gegenüber einer Silikonklebung deutlich. Allerdings offenbaren sich in einzelnen Alterungsszenarien und unter langandauernder Belastung auch Schwachstellen dieser Klebstoffe. Ihre Verwendung kann daher nur mit konstruktiven Kompensationsmaßnahmen oder durch Abschirmen der kritischen Einwirkungsgrößen empfohlen werden. Entsprechende Vorschläge werden bei der abschließenden Bewertung der Ergebnisse unterbreitet. Verfahren und Beurteilungsmethoden, die in dieser Arbeit angewendet und entwickelt werden, erleichtern die zukünftige Bewertung weiterer aussichtsreicher Klebstoffe für den Holz-Glas-Verbund.:1 Einleitung 13 1.1 Motivation 13 1.2 Zielsetzung 18 1.3 Abgrenzung 20 1.4 Vorgehensweise 21 2 Die Holz-Glas-Verbundbauweise 25 2.1 Tragprinzip und Wirkungsweise 25 2.2 Forschungsschwerpunkte und Anwendungen 27 2.2.1 Geklebte Verglasungssysteme für Fenster 27 2.2.2 Träger 28 2.2.3 Wandscheiben und Schubfelder 32 2.2.4 Verbundplatten 36 2.3 Tragendes Glas im Verbund 37 2.3.1 Relevanz für Holz-Glas-Verbundlösungen 37 2.3.2 Historische Vorbilder 37 2.3.3 Verbundglas und Verbund-Sicherheitsglas 38 2.3.4 Verbundträger 40 2.3.5 Wandscheiben aus Glas 43 2.4 Konstruktionsprinzipien von tragenden Wand und Fassadenelementen aus Holz und Glas 46 2.4.1 Aufbau 46 2.4.2 Verglasung 46 2.4.3 Ausbildung der Klebfuge 48 2.4.4 Marktreife Systeme mit Koppelleiste 49 2.4.5 Identifizieren geeigneter Tragsysteme 52 2.4.6 Skelett-, Tafel- und Massivholzbauweise 53 2.5 Zusammenfassung wesentlicher Erkenntnisse 55 3 Klebverbindungen im Glasbau 57 3.1 Fügen von Glas 57 3.1.1 Besondere Merkmale des Fügewerkstoffs 57 3.1.2 Wirkprinzip und Fügeverfahren 60 3.1.3 Vor- und Nachteile von Klebverbindungen 61 3.1.4 Glasoberfläche 65 3.2 Typische Anwendungsbeispiele im Glasbau 67 3.2.1 Klassifizierung 67 3.2.2 Einordung der Holz-Glas-Verbundbauweise 69 3.2.3 Structural Sealant Glazing 71 3.2.4 Ganzglaskonstruktionen 74 3.3 Planungsstrategien 76 3.3.1 Sicheres Bauteilversagen 76 3.3.2 Redundanz und Versagensszenarien 78 3.3.3 Besonderheiten bei geklebten Verglasungen 80 3.4 Baurechtliche Rahmenbedingungen 82 3.4.1 Normung und Verfahrensweise in Deutschland 82 3.4.2 Harmonisierung auf europäischer Ebene 84 3.4.3 ETAG 002 – Leitlinie für Structural Glazing 86 3.4.4 Der Weg zur geklebten Glaskonstruktion 88 4 Einfluss der Klebstoffsteifigkeit auf aussteifende Holz-Glas-Verbundtragwerke 91 4.1 Aussteifung von Holzbauten 91 4.2 Berechnungsverfahren 92 4.2.1 Begründung der Auswahl der Verfahren 92 4.2.2 Verteilung von Horizontallasten auf die Wandscheiben eines Aussteifungssystems 93 4.2.3 Wandscheibe als Schubfeld 95 4.2.4 Federmodelle 97 4.3 Randbedingungen für die Analyse 101 4.3.1 Modellgebäude 101 4.3.2 Konstruktive Gestaltung 103 4.3.3 Lastannahmen 104 4.4 Parameterstudie 107 4.4.1 Nachgiebigkeit der Kernwände 107 4.4.2 Nachgiebigkeit eines Verbundelements 108 4.4.3 Auswirkung der Elementanordnung 112 4.4.4 Lastumlagerung bei Ausfall von Elementen 114 4.4.5 Horizontallastanteil auf Fassade und Kern 116 4.5 Rückschlüsse auf die Tragsystemgestaltung und die Klebstoffauswahl 120 5 Materialauswahl und -charakterisierung 123 5.1 Untersuchungsprogramm 123 5.2 Materialeigenschaften der Fügeteile 124 5.2.1 Glas 124 5.2.2 Holz und Holzwerkstoffe 126 5.3 Klebstoffe 128 5.3.1 Auswahlkriterien für Holz-Glas-Klebungen 128 5.3.2 Vorauswahl der Klebstoffsysteme 130 5.4 Experimentelle Methoden zur Charakterisierung der Klebstoffe 134 5.4.1 Dynamisch-mechanische Analyse 134 5.4.2 Einaxialer Zugversuch 135 5.4.3 Scherversuch 138 5.5 Versuchsergebnisse 141 5.5.1 Glasübergangstemperatur 141 5.5.2 Spannungs-Dehnungs-Beziehung 145 5.5.3 Einpunktkennwerte 150 5.5.4 Scherfestigkeit und Bruchbildanalyse 151 5.6 Klebstoffauswahl für die Hauptuntersuchungen 155 6 Experimentelle Untersuchungen an Klebverbindungen im Labormaßstab 157 6.1 Methodik 157 6.1.1 Untersuchungsgegenstand 157 6.1.2 Beurteilungsgrundlagen 158 6.1.3 Untersuchungsprogramm 159 6.1.4 Auswertungsmethoden 162 6.2 Geometrie und Herstellung der Prüfkörper 164 6.2.1 Prüfkörper zum Bestimmen der Haftfestigkeit vor und nach künstlicher Alterung 164 6.2.2 Scherprüfkörper für Kriechversuche 165 6.2.3 Vorbereiten und Konditionieren der Proben 166 6.3 Verfahren zur mechanischen Prüfung und zur künstlichen Alterung 168 6.3.1 Zug- und Scherversuche 168 6.3.2 Lagerung unter UV-Bestrahlung 170 6.3.3 Lagerung in Reinigungsmittellösung 171 6.3.4 Holzfeuchtewechsel bei +20 °C 172 6.3.5 Lagerung in schwefeldioxidhaltiger Atmosphäre 173 6.3.6 Kriechversuche 174 6.4 Auswertung der Versuchsergebnisse 176 6.4.1 Anfangsfestigkeit im Scherversuch 176 6.4.2 Anfangsfestigkeit im Zugversuch 181 6.4.3 Sichtbare Veränderungen der Klebschicht 183 6.4.4 Restfestigkeit nach Alterung 185 6.4.5 Analyse der Versagensmuster 189 6.4.6 Kriechverhalten 192 6.4.7 Restfestigkeit nach Vorbelastung 198 7 Experimentelle Untersuchungen an bauteilähnlichen Prüfkörpern 201 7.1 Untersuchungsprogramm und Methodik 201 7.1.1 Ziel der Untersuchungen 201 7.1.2 Materialien 202 7.1.3 Großer Scherprüfkörper 203 7.1.4 Herstellung der Prüfkörper 205 7.1.5 Versuchsprogramm – Bauteilversuche 207 7.2 Entwicklung eines Kriechprüfstands 210 7.2.1 Prüfrahmen 210 7.2.2 Lasteinleitung 211 7.2.3 Belastungsvorgang 212 7.2.4 Messtechnik und Monitoring 213 7.2.5 Modifikation für Kurzzeitversuche 214 7.3 Große Scherversuche unter Kurz- und Langzeiteinwirkung 215 7.3.1 Tragfähigkeit bei kurzzeitiger Lasteinwirkung 215 7.3.2 Spannungsverteilung im Glas 219 7.3.3 Kriechversuche mit 1000 Stunden Laufzeit 221 7.3.4 Verlängerte Kriechversuche am Klebstoff mit mittlerer Steifigkeit 226 7.3.5 Tragfähigkeit nach Vorbelastung 230 8 Bewertung und Handlungsempfehlung 231 8.1 Alterungsverhalten 231 8.2 Korrelation der Ergebnisse aus Fügeteil- und 233 Bauteilversuchen 8.2.1 Versuche bei kurzzeitiger Lasteinwirkung 233 8.2.2 Versuche bei langandauernder Lasteinwirkung 235 8.3 Der Vorzugsklebstoff und seine Einsatzgrenzen 238 8.4 Konstruktion 241 9 Zusammenfassung und Ausblick 243 9.1 Zusammenfassung 243 9.2 Ausblick 249 10 Literatur 253 11 Abbildungsverzeichnis 263 12 Tabellenverzeichnis 267 13 Bezeichnungen 268 Anhang A Materialkennwerte zur Klebstoffauswahl 271 B Klebverbindungen im Labormaßstab 287 C Bauteilähnliche Prüfkörper 373 / Wooden constructions are on the rise again – encouraged by a strong public and economic trend towards sustainable and resource efficient buildings. Spurred by this growing interest novel design principles and material assemblies in architecture and the building industry evolve. These developments require further research due to the absence of evaluation tools and insufficient knowledge about their design. Load-bearing timber-glass composite elements could contribute to a more efficient use of materials in façade constructions. In this case a linear adhesive bond connects the glass pane to the timber substructure. This enables an in-plane loading of the glass whose capacity is not used to its full potential in conventional façades as it is solely applied as an infill panel. The quality of the adhesive bond defines the characteristics and the performance of the whole structural component. Structural sealants such as silicones, which are typically used for the joint, provide a high flexibility and only a low load-bearing capacity. Considering such elements being part of a bracing system, the mentioned characteristics limit the application range to buildings with not more than two stories. This thesis widens the scope with an in-depth examination of high-modulus adhesives, which have not yet been evaluated for their use in building constructions. Timber-glass composite elements used as a bracing component in façades are the focus of this work. Neither the full structural component nor the adhesive have yet been included into German building standards. Hence it is essential to assess the general requirements of their application. The relevant aspects are clarified in the context of glass constructions. In addition to the scientific discussion of the results, this approach facilitates also a practical evaluation of the findings, which is a unique feature of this work. The deformability of the adhesive becomes a crucial criterion when selecting the individual materials and designing the timber-glass composite elements. A case study assesses the influence of the adhesive stiffness on the behavior of a single element and its interaction with other members of the structural system. Based on the results, three different stiffness classes are introduced to support the selection process of the adhesives to be examined in further investigations. The experimental part of this work is initiated by a comprehensive characterization of seven shortlisted adhesives. The results enable a further differentiation of suitable materials. Two adhesives qualified as suitable for the main experiments. A silicone adhesive complements the test series to serve as a reference material to the current practice. In the next phase attention is drawn to the ageing stability and on the time-dependent material behavior of the adhesives under long-term loading. Small-scale specimens made from adhesively joint timber and glass pieces are exposed to different ageing scenarios which relate to the impacts typically encountered in façades. Beyond that, creep tests are carried out on small and large shear specimen. The latter provide extra benefit as they comprise long linear adhesive joints resembling virtually the situation in a real-size element. A specific long-term test rig was developed for this purpose comprising a loading unit with gas pressurized springs. Based on the results it can be concluded that joints with adhesives of high and intermediate stiffness enable an increase of characteristic failure loads and a significant reduction of deformation. With the stiffer joint near-surface rupture of timber fibers becomes the prevailing failure mechanism. The timber strength limits further loading of the adhesive joint. However, ageing and creep testing reveal also shortcomings of the adhesives. Their application can only be recommended if redundant compensation measures are taken or the joint is protected against critical environmental impacts. Appropriate solutions are proposed with the final recommendations of this work. Methods and assessment tools that have been developed and tested for this work offer the possibility of a more straight-forward evaluation of further promising adhesives and their use in load-bearing timber-glass composites.:1 Einleitung 13 1.1 Motivation 13 1.2 Zielsetzung 18 1.3 Abgrenzung 20 1.4 Vorgehensweise 21 2 Die Holz-Glas-Verbundbauweise 25 2.1 Tragprinzip und Wirkungsweise 25 2.2 Forschungsschwerpunkte und Anwendungen 27 2.2.1 Geklebte Verglasungssysteme für Fenster 27 2.2.2 Träger 28 2.2.3 Wandscheiben und Schubfelder 32 2.2.4 Verbundplatten 36 2.3 Tragendes Glas im Verbund 37 2.3.1 Relevanz für Holz-Glas-Verbundlösungen 37 2.3.2 Historische Vorbilder 37 2.3.3 Verbundglas und Verbund-Sicherheitsglas 38 2.3.4 Verbundträger 40 2.3.5 Wandscheiben aus Glas 43 2.4 Konstruktionsprinzipien von tragenden Wand und Fassadenelementen aus Holz und Glas 46 2.4.1 Aufbau 46 2.4.2 Verglasung 46 2.4.3 Ausbildung der Klebfuge 48 2.4.4 Marktreife Systeme mit Koppelleiste 49 2.4.5 Identifizieren geeigneter Tragsysteme 52 2.4.6 Skelett-, Tafel- und Massivholzbauweise 53 2.5 Zusammenfassung wesentlicher Erkenntnisse 55 3 Klebverbindungen im Glasbau 57 3.1 Fügen von Glas 57 3.1.1 Besondere Merkmale des Fügewerkstoffs 57 3.1.2 Wirkprinzip und Fügeverfahren 60 3.1.3 Vor- und Nachteile von Klebverbindungen 61 3.1.4 Glasoberfläche 65 3.2 Typische Anwendungsbeispiele im Glasbau 67 3.2.1 Klassifizierung 67 3.2.2 Einordung der Holz-Glas-Verbundbauweise 69 3.2.3 Structural Sealant Glazing 71 3.2.4 Ganzglaskonstruktionen 74 3.3 Planungsstrategien 76 3.3.1 Sicheres Bauteilversagen 76 3.3.2 Redundanz und Versagensszenarien 78 3.3.3 Besonderheiten bei geklebten Verglasungen 80 3.4 Baurechtliche Rahmenbedingungen 82 3.4.1 Normung und Verfahrensweise in Deutschland 82 3.4.2 Harmonisierung auf europäischer Ebene 84 3.4.3 ETAG 002 – Leitlinie für Structural Glazing 86 3.4.4 Der Weg zur geklebten Glaskonstruktion 88 4 Einfluss der Klebstoffsteifigkeit auf aussteifende Holz-Glas-Verbundtragwerke 91 4.1 Aussteifung von Holzbauten 91 4.2 Berechnungsverfahren 92 4.2.1 Begründung der Auswahl der Verfahren 92 4.2.2 Verteilung von Horizontallasten auf die Wandscheiben eines Aussteifungssystems 93 4.2.3 Wandscheibe als Schubfeld 95 4.2.4 Federmodelle 97 4.3 Randbedingungen für die Analyse 101 4.3.1 Modellgebäude 101 4.3.2 Konstruktive Gestaltung 103 4.3.3 Lastannahmen 104 4.4 Parameterstudie 107 4.4.1 Nachgiebigkeit der Kernwände 107 4.4.2 Nachgiebigkeit eines Verbundelements 108 4.4.3 Auswirkung der Elementanordnung 112 4.4.4 Lastumlagerung bei Ausfall von Elementen 114 4.4.5 Horizontallastanteil auf Fassade und Kern 116 4.5 Rückschlüsse auf die Tragsystemgestaltung und die Klebstoffauswahl 120 5 Materialauswahl und -charakterisierung 123 5.1 Untersuchungsprogramm 123 5.2 Materialeigenschaften der Fügeteile 124 5.2.1 Glas 124 5.2.2 Holz und Holzwerkstoffe 126 5.3 Klebstoffe 128 5.3.1 Auswahlkriterien für Holz-Glas-Klebungen 128 5.3.2 Vorauswahl der Klebstoffsysteme 130 5.4 Experimentelle Methoden zur Charakterisierung der Klebstoffe 134 5.4.1 Dynamisch-mechanische Analyse 134 5.4.2 Einaxialer Zugversuch 135 5.4.3 Scherversuch 138 5.5 Versuchsergebnisse 141 5.5.1 Glasübergangstemperatur 141 5.5.2 Spannungs-Dehnungs-Beziehung 145 5.5.3 Einpunktkennwerte 150 5.5.4 Scherfestigkeit und Bruchbildanalyse 151 5.6 Klebstoffauswahl für die Hauptuntersuchungen 155 6 Experimentelle Untersuchungen an Klebverbindungen im Labormaßstab 157 6.1 Methodik 157 6.1.1 Untersuchungsgegenstand 157 6.1.2 Beurteilungsgrundlagen 158 6.1.3 Untersuchungsprogramm 159 6.1.4 Auswertungsmethoden 162 6.2 Geometrie und Herstellung der Prüfkörper 164 6.2.1 Prüfkörper zum Bestimmen der Haftfestigkeit vor und nach künstlicher Alterung 164 6.2.2 Scherprüfkörper für Kriechversuche 165 6.2.3 Vorbereiten und Konditionieren der Proben 166 6.3 Verfahren zur mechanischen Prüfung und zur künstlichen Alterung 168 6.3.1 Zug- und Scherversuche 168 6.3.2 Lagerung unter UV-Bestrahlung 170 6.3.3 Lagerung in Reinigungsmittellösung 171 6.3.4 Holzfeuchtewechsel bei +20 °C 172 6.3.5 Lagerung in schwefeldioxidhaltiger Atmosphäre 173 6.3.6 Kriechversuche 174 6.4 Auswertung der Versuchsergebnisse 176 6.4.1 Anfangsfestigkeit im Scherversuch 176 6.4.2 Anfangsfestigkeit im Zugversuch 181 6.4.3 Sichtbare Veränderungen der Klebschicht 183 6.4.4 Restfestigkeit nach Alterung 185 6.4.5 Analyse der Versagensmuster 189 6.4.6 Kriechverhalten 192 6.4.7 Restfestigkeit nach Vorbelastung 198 7 Experimentelle Untersuchungen an bauteilähnlichen Prüfkörpern 201 7.1 Untersuchungsprogramm und Methodik 201 7.1.1 Ziel der Untersuchungen 201 7.1.2 Materialien 202 7.1.3 Großer Scherprüfkörper 203 7.1.4 Herstellung der Prüfkörper 205 7.1.5 Versuchsprogramm – Bauteilversuche 207 7.2 Entwicklung eines Kriechprüfstands 210 7.2.1 Prüfrahmen 210 7.2.2 Lasteinleitung 211 7.2.3 Belastungsvorgang 212 7.2.4 Messtechnik und Monitoring 213 7.2.5 Modifikation für Kurzzeitversuche 214 7.3 Große Scherversuche unter Kurz- und Langzeiteinwirkung 215 7.3.1 Tragfähigkeit bei kurzzeitiger Lasteinwirkung 215 7.3.2 Spannungsverteilung im Glas 219 7.3.3 Kriechversuche mit 1000 Stunden Laufzeit 221 7.3.4 Verlängerte Kriechversuche am Klebstoff mit mittlerer Steifigkeit 226 7.3.5 Tragfähigkeit nach Vorbelastung 230 8 Bewertung und Handlungsempfehlung 231 8.1 Alterungsverhalten 231 8.2 Korrelation der Ergebnisse aus Fügeteil- und 233 Bauteilversuchen 8.2.1 Versuche bei kurzzeitiger Lasteinwirkung 233 8.2.2 Versuche bei langandauernder Lasteinwirkung 235 8.3 Der Vorzugsklebstoff und seine Einsatzgrenzen 238 8.4 Konstruktion 241 9 Zusammenfassung und Ausblick 243 9.1 Zusammenfassung 243 9.2 Ausblick 249 10 Literatur 253 11 Abbildungsverzeichnis 263 12 Tabellenverzeichnis 267 13 Bezeichnungen 268 Anhang A Materialkennwerte zur Klebstoffauswahl 271 B Klebverbindungen im Labormaßstab 287 C Bauteilähnliche Prüfkörper 373

O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). A AIDS é uma doença de distribuição mundial, e estima-se que existam atualmente pelo menos 36,9 milhões de pessoas infectadas com o vírus. Durante o seu ciclo replicativo, o HIV promove diversas alterações na fisiologia da célula hospedeira a fim de promover sua sobrevivência e potencializar a replicação. A rápida progressão da infecção pelo HIV-1 em humanos e em modelos animais está intimamente ligada à função da proteína acessória Nef. Dentre as diversas ações de Nef está a regulação negativa de proteínas importantes na resposta imunológica, como o receptor CD4. Sabe-se que esta ação resulta da indução da degradação de CD4 em lisossomos, mas os mecanismos moleculares envolvidos ainda são totalmente elucidados. Nef forma um complexo tripartite com a cauda citosólica de CD4 e a proteína adaptadora 2 (AP-2), em vesículas revestidas por clatrina nascentes, induzindo a internalização e degradação lisossomal de CD4. Pesquisas anteriores demonstraram que o direcionamento de CD4 aos lisossomos por Nef envolve a entrada do receptor na via dos corpos multivesiculares (MVBs), por um mecanismo atípico, pois, embora não necessite da ubiquitinação de carga, depende da ação de proteínas que compõem os ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) e da ação de Alix, uma proteína acessória da maquinaria ESCRT. Já foi reportado que Nef interage com subunidades dos complexos AP-1, AP-2, AP-3 e Nef não parece interagir com subunidades de AP-4 e AP-5. Entretanto, o papel da interação de Nef com AP-1 e AP-3 na regulação negativa de CD4 ainda não está totalmente elucidado. Ademais, AP-1, AP-2 e AP-3 são potencialmente heterogêneos devido à existência de isoformas múltiplas das subunidades codificadas por diferentes genes. Todavia, existem poucos estudos para demonstrar se as diferentes combinações de isoformas dos APs são formadas e se possuem propriedades funcionais distintas. O presente trabalho procurou identificar e caracterizar fatores celulares envolvidos na regulação do tráfego intracelular de proteínas no processo de regulação negativa de CD4 induzido por Nef. Mais especificamente, este estudo buscou caracterizar a participação do complexo AP-1 na modulação negativa de CD4 por Nef de HIV-1, através do estudo funcional das duas isoformas de ?-adaptina, subunidades de AP-1. Utilizando a técnica de Pull-down demonstramos que Nef é capaz de interagir com ?2. Além disso, nossos dados de Imunoblot indicaram que a proteína ?2-adaptina, e não ?1-adaptina, é necessária no processo de degradação lisossomal de CD4 por Nef e que esta participação é conservada para degradação de CD4 por Nef de diferentes cepas virais. Ademais, por citometria de fluxo, o silenciamento de ?2, e não de ?1, compromete a diminuição dos níveis de CD4 por Nef da membrana plasmática. A análise por imunofluorêsncia indireta também revelou que a diminuição dos níveis de ?2 impede a redistribuição de CD4 por Nef para regiões perinucleares, acarretando no acúmulo de CD4, retirados por Nef da membrana plasmática, em endossomos primários. A depleção de ?1A, outra subunidade de AP-1, acarretou na diminuição dos níveis celulares de ?2 e ?1, bem como, no comprometimento da eficiente degradação de CD4 por Nef. Além disso, foi possível observar que, ao perturbar a maquinaria ESCRT via super-expressão de HRS (uma subunidade do complexo ESCRT-0), ocorreu um acumulo de ?2 em endossomos dilatados contendo HRS-GFP, nos quais também detectou-se CD4 que foi internalizado por Nef. Em conjunto, os resultados indicam que ?2-adaptina é uma importante molécula para o direcionamento de CD4 por Nef para a via ESCRT/MVB, mostrando ser uma proteína relevante no sistema endo-lisossomal. Ademais, os resultados indicaram que as isoformas ?-adaptinas não só possuem funções distintas, mas também parecem compor complexos AP-1 com diferentes funções celulares, já que apenas a variante AP-1 contendo ?2, mas não ?1, participa da regulação negativa de CD4 por Nef. Estes estudos contribuem para o melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na atividade de Nef, que poderão também ajudar na melhor compreensão da patogênese do HIV e da síndrome relacionada. Em adição, este trabalho contribui para o entendimento de processos fundamentais da regulação do tráfego de proteínas transmembrana no sistema endo-lisossomal. / The Human Immunodeficiency Virus (HIV) is the etiologic agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). AIDS is a disease which has a global distribution, and it is estimated that there are currently at least 36.9 million people infected with the virus. During the replication cycle, HIV promotes several changes in the physiology of the host cell to promote their survival and enhance replication. The fast progression of HIV-1 in humans and animal models is closely linked to the function of an accessory protein Nef. Among several actions of Nef, one is the most important is the down-regulation of proteins from the immune response, such as the CD4 receptor. It is known that this action causes CD4 degradation in lysosome, but the molecular mechanisms are still incompletely understood. Nef forms a tripartite complex with the cytosolic tail of the CD4 and adapter protein 2 (AP-2) in clathrin-coated vesicles, inducing CD4 internalization and lysosome degradation. Previous research has demonstrated that CD4 target to lysosomes by Nef involves targeting of this receptor to multivesicular bodies (MVBs) pathway by an atypical mechanism because, although not need charging ubiquitination, depends on the proteins from ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) machinery and the action of Alix, an accessory protein ESCRT machinery. It has been reported that Nef interacts with subunits of AP- 1, AP-2, AP-3 complexes and Nef does not appear to interact with AP-4 and AP-5 subunits. However, the role of Nef interaction with AP-1 or AP-3 in CD4 down-regulation is poorly understood. Furthermore, AP-1, AP-2 and AP-3 are potentially heterogeneous due to the existence of multiple subunits isoforms encoded by different genes. However, there are few studies to demonstrate if the different combinations of APs isoforms are form and if they have distinct functional properties. This study aim to identify and characterize cellular factors involved on CD4 down-modulation induced by Nef from HIV-1. More specifically, this study aimed to characterize the involvement of AP-1 complex in the down-regulation of CD4 by Nef HIV-1 through the functional study of the two isoforms of ?-adaptins, AP-1 subunits. By pull-down technique, we showed that Nef is able to interact with ?2. In addition, our data from immunoblots indicated that ?2- adaptin, not ?1-adaptin, is required in Nef-mediated targeting of CD4 to lysosomes and the ?2 participation in this process is conserved by Nef from different viral strains. Furthermore, by flow cytometry assay, ?2 depletion, but not ?1 depletion, compromises the reduction of surface CD4 levels induced by Nef. Immunofluorescence microscopy analysis also revealed that ?2 depletion impairs the redistribution of CD4 by Nef to juxtanuclear region, resulting in CD4 accumulation in primary endosomes. Knockdown of ?1A, another subunit of AP-1, resulted in decreased cellular levels of ?1 and ?2 and, compromising the efficient CD4 degradation by Nef. Moreover, upon artificially stabilizing ESCRT-I in early endosomes, via overexpression of HRS, internalized CD4 accumulates in enlarged HRS-GFP positive endosomes, where co-localize with ?2. Together, the results indicate that ?2-adaptin is a molecule that is essential for CD4 targeting by Nef to ESCRT/MVB pathway, being an important protein in the endo-lysosomal system. Furthermore, the results indicate that ?-adaptins isoforms not only have different functions, but also seem to compose AP-1 complex with distinct cell functions, and only the AP-1 variant comprising ?2, but not ?1, acts in the CD4 down-regulation induced by Nef. These studies contribute to a better understanding on the molecular mechanisms involved in Nef activities, which may also help to improve the understanding of the HIV pathogenesis and the related syndrome. In addition, this work contributes with the understanding of primordial process regulation on intracellular trafficking of transmembrane proteins.

O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). A AIDS é uma doença de distribuição mundial, e estima-se que existam atualmente pelo menos 36,9 milhões de pessoas infectadas com o vírus. Durante o seu ciclo replicativo, o HIV promove diversas alterações na fisiologia da célula hospedeira a fim de promover sua sobrevivência e potencializar a replicação. A rápida progressão da infecção pelo HIV-1 em humanos e em modelos animais está intimamente ligada à função da proteína acessória Nef. Dentre as diversas ações de Nef está a regulação negativa de proteínas importantes na resposta imunológica, como o receptor CD4. Sabe-se que esta ação resulta da indução da degradação de CD4 em lisossomos, mas os mecanismos moleculares envolvidos ainda são totalmente elucidados. Nef forma um complexo tripartite com a cauda citosólica de CD4 e a proteína adaptadora 2 (AP-2), em vesículas revestidas por clatrina nascentes, induzindo a internalização e degradação lisossomal de CD4. Pesquisas anteriores demonstraram que o direcionamento de CD4 aos lisossomos por Nef envolve a entrada do receptor na via dos corpos multivesiculares (MVBs), por um mecanismo atípico, pois, embora não necessite da ubiquitinação de carga, depende da ação de proteínas que compõem os ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) e da ação de Alix, uma proteína acessória da maquinaria ESCRT. Já foi reportado que Nef interage com subunidades dos complexos AP-1, AP-2, AP-3 e Nef não parece interagir com subunidades de AP-4 e AP-5. Entretanto, o papel da interação de Nef com AP-1 e AP-3 na regulação negativa de CD4 ainda não está totalmente elucidado. Ademais, AP-1, AP-2 e AP-3 são potencialmente heterogêneos devido à existência de isoformas múltiplas das subunidades codificadas por diferentes genes. Todavia, existem poucos estudos para demonstrar se as diferentes combinações de isoformas dos APs são formadas e se possuem propriedades funcionais distintas. O presente trabalho procurou identificar e caracterizar fatores celulares envolvidos na regulação do tráfego intracelular de proteínas no processo de regulação negativa de CD4 induzido por Nef. Mais especificamente, este estudo buscou caracterizar a participação do complexo AP-1 na modulação negativa de CD4 por Nef de HIV-1, através do estudo funcional das duas isoformas de ?-adaptina, subunidades de AP-1. Utilizando a técnica de Pull-down demonstramos que Nef é capaz de interagir com ?2. Além disso, nossos dados de Imunoblot indicaram que a proteína ?2-adaptina, e não ?1-adaptina, é necessária no processo de degradação lisossomal de CD4 por Nef e que esta participação é conservada para degradação de CD4 por Nef de diferentes cepas virais. Ademais, por citometria de fluxo, o silenciamento de ?2, e não de ?1, compromete a diminuição dos níveis de CD4 por Nef da membrana plasmática. A análise por imunofluorêsncia indireta também revelou que a diminuição dos níveis de ?2 impede a redistribuição de CD4 por Nef para regiões perinucleares, acarretando no acúmulo de CD4, retirados por Nef da membrana plasmática, em endossomos primários. A depleção de ?1A, outra subunidade de AP-1, acarretou na diminuição dos níveis celulares de ?2 e ?1, bem como, no comprometimento da eficiente degradação de CD4 por Nef. Além disso, foi possível observar que, ao perturbar a maquinaria ESCRT via super-expressão de HRS (uma subunidade do complexo ESCRT-0), ocorreu um acumulo de ?2 em endossomos dilatados contendo HRS-GFP, nos quais também detectou-se CD4 que foi internalizado por Nef. Em conjunto, os resultados indicam que ?2-adaptina é uma importante molécula para o direcionamento de CD4 por Nef para a via ESCRT/MVB, mostrando ser uma proteína relevante no sistema endo-lisossomal. Ademais, os resultados indicaram que as isoformas ?-adaptinas não só possuem funções distintas, mas também parecem compor complexos AP-1 com diferentes funções celulares, já que apenas a variante AP-1 contendo ?2, mas não ?1, participa da regulação negativa de CD4 por Nef. Estes estudos contribuem para o melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na atividade de Nef, que poderão também ajudar na melhor compreensão da patogênese do HIV e da síndrome relacionada. Em adição, este trabalho contribui para o entendimento de processos fundamentais da regulação do tráfego de proteínas transmembrana no sistema endo-lisossomal. / The Human Immunodeficiency Virus (HIV) is the etiologic agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). AIDS is a disease which has a global distribution, and it is estimated that there are currently at least 36.9 million people infected with the virus. During the replication cycle, HIV promotes several changes in the physiology of the host cell to promote their survival and enhance replication. The fast progression of HIV-1 in humans and animal models is closely linked to the function of an accessory protein Nef. Among several actions of Nef, one is the most important is the down-regulation of proteins from the immune response, such as the CD4 receptor. It is known that this action causes CD4 degradation in lysosome, but the molecular mechanisms are still incompletely understood. Nef forms a tripartite complex with the cytosolic tail of the CD4 and adapter protein 2 (AP-2) in clathrin-coated vesicles, inducing CD4 internalization and lysosome degradation. Previous research has demonstrated that CD4 target to lysosomes by Nef involves targeting of this receptor to multivesicular bodies (MVBs) pathway by an atypical mechanism because, although not need charging ubiquitination, depends on the proteins from ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) machinery and the action of Alix, an accessory protein ESCRT machinery. It has been reported that Nef interacts with subunits of AP- 1, AP-2, AP-3 complexes and Nef does not appear to interact with AP-4 and AP-5 subunits. However, the role of Nef interaction with AP-1 or AP-3 in CD4 down-regulation is poorly understood. Furthermore, AP-1, AP-2 and AP-3 are potentially heterogeneous due to the existence of multiple subunits isoforms encoded by different genes. However, there are few studies to demonstrate if the different combinations of APs isoforms are form and if they have distinct functional properties. This study aim to identify and characterize cellular factors involved on CD4 down-modulation induced by Nef from HIV-1. More specifically, this study aimed to characterize the involvement of AP-1 complex in the down-regulation of CD4 by Nef HIV-1 through the functional study of the two isoforms of ?-adaptins, AP-1 subunits. By pull-down technique, we showed that Nef is able to interact with ?2. In addition, our data from immunoblots indicated that ?2- adaptin, not ?1-adaptin, is required in Nef-mediated targeting of CD4 to lysosomes and the ?2 participation in this process is conserved by Nef from different viral strains. Furthermore, by flow cytometry assay, ?2 depletion, but not ?1 depletion, compromises the reduction of surface CD4 levels induced by Nef. Immunofluorescence microscopy analysis also revealed that ?2 depletion impairs the redistribution of CD4 by Nef to juxtanuclear region, resulting in CD4 accumulation in primary endosomes. Knockdown of ?1A, another subunit of AP-1, resulted in decreased cellular levels of ?1 and ?2 and, compromising the efficient CD4 degradation by Nef. Moreover, upon artificially stabilizing ESCRT-I in early endosomes, via overexpression of HRS, internalized CD4 accumulates in enlarged HRS-GFP positive endosomes, where co-localize with ?2. Together, the results indicate that ?2-adaptin is a molecule that is essential for CD4 targeting by Nef to ESCRT/MVB pathway, being an important protein in the endo-lysosomal system. Furthermore, the results indicate that ?-adaptins isoforms not only have different functions, but also seem to compose AP-1 complex with distinct cell functions, and only the AP-1 variant comprising ?2, but not ?1, acts in the CD4 down-regulation induced by Nef. These studies contribute to a better understanding on the molecular mechanisms involved in Nef activities, which may also help to improve the understanding of the HIV pathogenesis and the related syndrome. In addition, this work contributes with the understanding of primordial process regulation on intracellular trafficking of transmembrane proteins.