Submitted by Andrea Hayashi (deachan@gmail.com) on 2016-07-19T18:43:58Z No. of bitstreams: 1 richard.pdf: 1735785 bytes, checksum: 2df8fed54dbb769385bd94c07d15eefc (MD5) / Approved for entry into archive by Andrea Hayashi (deachan@gmail.com) on 2016-07-19T18:44:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 richard.pdf: 1735785 bytes, checksum: 2df8fed54dbb769385bd94c07d15eefc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-19T18:44:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 richard.pdf: 1735785 bytes, checksum: 2df8fed54dbb769385bd94c07d15eefc (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / World Health Organization (WHO) / Howard Hughes Medical Institute (HHMI) / Os agentes antifúngicos de uso corrente na medicina apresentam alta toxicidade e efeitos colaterais, tem como alvo poucos constituintes celulares, e muitos mecanismos de resistência já foram descritos. Com o objetivo de identificar potenciais novos alvos para drogas antifúngicas, duas ORFs hipotéticas de Candida albicans, potencialmente essenciais e com perfis singulares de expressão foram caracterizados. A ORF CaYlr339c é conservada em outros fungos do gênero Candida e Saccharomyces, é transcrita nas fases de levedura e hifa e a presença de seu produto protéico de aproximadamente 18 kDa foi constatada em extratos celulares de leveduras e hifas de C. albicans a partir de experimentos de western blot. A ORF CaYdr187c é conservada em poucos representantes do gênero Saccharomyces, é transcrita apenas na fase de levedura e potencialmente codifica uma proteína de superfície. Esses dados indicam que as ORFs selecionadas são genes reais e podem ser bons candidatos para a descoberta de novas funções e para o desenvolvimento futuro de novos agentes antifúngicos. Numa tentativa de testar o possível papel da proteína putativa de superfície CaYdr187cp na adesão celular, constatamos que a incubação de discos de tecido gastrointestinal com a proteína recombinante enolase, utilizada inicialmente como controle em nossos experimentos, foi capaz de inibir a adesão de C. albicans de maneira dose dependente em até 70%. O papel da enolase de superfície na adesão celular foi confirmado a partir da inibição da adesão em até 50% observada com o bloqueio da superfície de C. albicans com anticorpos anti-enolase. A capacidade de ligação da enolase de C. albicans ao plasminogênio foi confirmada a partir de experimentos de coimunoprecipitação. A pré-incubação de C. albicans com esta proteína foi capaz de inibir parcialmente sua adesão reforçando a idéia de que a enolase realmente esteja mediando à adesão deste organismo ao tecido gastrointestinal. Em contrapartida, a enolase não foi coimunoprecipitada com a fibronectina e a pré-incubação de C. albicans com esta proteína falhou em inibir sua adesão indicando que a inibição observada com a enolase recombinante não é decorrente do bloqueio da fibronectina no tecido gastrointestinal. Este trabalho é o primeiro a demonstrar que a enolase presente na superfície de C. albicans está envolvida em mecanismos de adesão, podendo ser um importante fator de virulência neste organismo. Assim, esta proteína poderia ser utilizada no desenvolvimento de vacinas ou estratégias de controles a partir da inibição da adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal com o intuito de prevenir sua proliferação. / Current antifungal agents in medicine presents high toxicity and collateral effects, targets limited cell constituents and different resistance mechanisms have already been described. In order to identify novel potential antifungal drug targets, two hypothetical Candida albicans genes potentially essential and with singular expression profile have been characterized. The ORF CaYlr339c is conserved among fungal species from Candida and Saccharomyces genus, is transcribed in yeast and hyphae and an approximately 18-kDa protein was identified in hyphae and yeasts C. albicans cell extracts by western blotting. The ORF CaYdr187c is conserved in a few representatives of the Saccharomyces genus, is transcribed only in yeasts and potentially codifies a surface protein. These findings indicate that the selected ORFs are real genes and could be good candidates for the discovery of new functions and the development of new antifungal agents in the future. In an attempt to test the possible role of the putative surface protein CaYdr187cp on cell adhesion, we find out that incubation of the gastrointestinal Murine disks with the recombinant protein enolase, initially employed as a control in our experiments, was able to inhibit C. albicans adhesion in a dose-dependent manner in 70%. The role of surface enolase on cell adhesin was confirmed with the 50% of the adhesion inhibition observed after blocking C. albicans surface with antibodies anti-enolase. The binding capacity of enolase to plasminogen was confirmed by co-immunoprecipitation. Preincubation of C. albicans with this protein partially inhibited the adhesion supporting the idea that enolase is really mediating the adhesion of this organism to gastrointestinal tissues. On the other hand, enolase was not co-immunoprecipitated with fibronectin and pretreatment of C. albicans with this protein failed to inhibit the adhesion, indicating that the observed inhibition with recombinant enolase was not due to the blocking of fibronectin in the gastrointestinal disks. This was the first work to demonstrate that surface C. albicans enolase is involved in cell adhesion, being a potential virulence factor in this organism. Accordingly, this protein could be useful in vaccine development and is a promising candidate for the prevention of C. albicans proliferation by the inhibition of its adhesion. Esta tese é composta de uma Introdução geral e duas partes independentes compostas de: Introdução, objetivos, materiais e métodos, resultados, discussões e conclusões específicas. A primeira parte da tese trata da caracterização parcial de genes hipotéticos de C. albicans e a segunda parte trata do papel da enolase na adesão de C. albicans ao tecido gastrointestinal.