Les carcinomes de la cortico-surrénale (CCS) sont des tumeurs de mauvais pronostic et les thérapies sont encore limitées. La chirurgie reste à ce jour le seul traitement efficace. La compréhension des mécanismes de la tumorigenèse cortico-surrénalienne et l'identification des gènes et des voies de signalisation impliquées sont nécessaires pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ces dernières années, plusieurs études de génomique ont été réalisées sur des cohortes indépendantes de CCS et ont mis en évidence l'existence de deux groupes de CCS ayant des profils d’expression génique particuliers et associés à des pronostics de survie différents. Il a aussi été identifié de fréquentes mutations touchant les gènes TP53 et CTNNB1 (β-caténine). De plus, l'activation aberrante de la voie WNT/β-caténine est associée au groupe des CCS agressifs. Enfin, des analyses des altérations génomiques par puce SNP et le séquençage de l’exome de cohortes de CCS a permis de préciser les fréquences des mutations de TP53 (~18%) et CTNNB1 (~14%) mais a aussi mis en évidence des mutations et des délétions homozygotes au niveau du gène ZNRF3 (Zinc And Ring Finger 3) dans environs 20% des CCS. ZNRF3 a été montré comme jouant un rôle de régulateur négatif de la voie WNT/β-caténine. Par conséquent, la voie de signalisation WNT/β-caténine est la voie la plus fréquemment altérée dans les CCS (~40%). L’objectif de mon projet était d’étudier comment l’activation constitutive de la voie WNT/β-caténine pouvait participer à la tumorigenèse cortico-surrénalienne, puis d'essayer de comprendre plus spécifiquement le rôle des altérations de ZNRF3 dans le développement et/ou l'agressivité des CCS. En combinant des analyses de transcriptomes de modèles cellulaires et de cohortes de CCS, nous avons établi une signature robuste cortico-surrénalienne de l'activation de la voie WNT/β-caténine. Parmi les gènes de cette signature, nous avons montré que AFF3 était une cible transcriptionnelle de la β-caténine et qu'il était capable de transmettre en partie les effets oncogèniques de la voie WNT/β-caténine dans les cellules cortico-surrénaliennes. En effet, son invalidation entraîne l'apoptose et diminue la prolifération des cellules cortico-surrénaliennes à l'image de l'invalidation de la β-caténine. La surexpression d’AFF3 altère l’organisation des speckles nucléaires et la localisation de CDK9/CyclinT1 impliqués respectivement dans l'épissage des ARNm et la transcription des gènes. ZNRF3 est le gène le plus fréquemment altéré dans les CCS alors qu'il l'est très peu dans les autres types de cancers. ZNRF3 est une E3 ubiquitin ligase qui entraîne l'internalisation et la dégradation des récepteurs Frizzleds de la voie WNT. Nous avons montré que ZNRF3 agit bien comme un gène suppresseur de tumeur dans les cellules cortico-surénaliennes humaines H295R. En effet la surexpression de ZNRF3 diminue la prolifération et augmente l’apoptose cellulaire de ces cellules. Nous avons aussi montré qu'à l'image d'autres régulateurs négatifs de la voie WNT comme AXIN2, ZNRF3 est un gène cible de la voie WNT/β-caténine dans la corticosurrénale. De manière intéressante, les altérations du gène ZNRF3 ne sont pas retrouvées dans des tumeurs présentant une forte activation de la voie de signalisation WNT/β-caténine, suggérant l'implication d'autres voies de signalisation. Nous avons identifié des partenaires protéiques de ZNRF3 par des expériences d'immunoprécipitation / spectrométrie de masse. Nous avons montré que ZNRF3 interagit avec la sous unité catalytique de la pompe NA+/K+, ATP1A1. Cette interaction altère le fonctionnement de la pompe NA+/K+ conduisant à des modifications du flux de Ca2+ intracellulaire. L'ensemble de ces travaux a permis de mieux comprendre comment la voie WNT/β-caténine participe à l'agressivité des cancers de la corticosurrénale et de montrer qu'AFF3 est essentiel pour les effets oncogéniques de cette voie. (...) / Adrenocortical carcinomas are rare tumors with poor prognostic and limited therapy. Up to now, surgery remains the only curative therapy. A better understanding of tumor biology and molecular prognostic factors would help to select relevant therapeutic targets and to develop innovative therapeutic strategies. In the last years, different genomic studies on independent cohorts of ACC have identified two subgroups of cancers with two distinguished profiles of genes expression and two different survival rates. Frequents alterations of CTNNB1 and TP53 are identified in ACC. Moreover, aberrant activation of WNT/β-catenin pathway in ACC is associated with lower overall survival. Using a combination of genomic approaches, we and others have recently analyzed independent cohorts of ACC. These works confirmed recurrent alterations in CTNNB1 (~14%) and TP53 (~18%), but also revealed new loci not previously reported to be altered in ACC. Strikingly, ZNRF3 (zinc and ring finger 3) was the most frequently altered gene (~20%). ZNRF3 encodes a protein that acts as a negative regulator of Wnt/β-catenin pathway. The Wnt/β-catenin pathway represents the most frequently altered pathway in ACC (~40%). The aim of my project was to study how the aberrant activation of WNT/β-catenin pathway could participate to adrenal tumorigenesis and then to identify more specifically the role of ZNRF3 alterations in development/aggressiness of ACC. By a combination of transcriptomic analysis on two cohorts of ACC and on H295R adrenocortical cells, we identified a list of genes whose expression is correlated to the WNT/β-catenin activation. Among these genes, we show that AFF3 is essential to mediate the effect of activation the WNT/β-catenin pathway in adrenocortical cancer. Indeed, AFF3 is a direct target gene of β-catenin and its silencing in H295R adrenocortical cells induces a decreased cell proliferation and an increased apoptosis similar to that induced by β-catenin silencing. Moreover, AFF3 overexpression altered the structure of nuclear speckles and the localization of CDK9/CyclinT1, which are respectively involved in mRNA splicing and transcription. ZNRF3 (zinc and ring finger 3) was the most frequently altered gene (20%) in ACC. ZNRF3 had never been frequently associated with other tumour types. ZNRF3 encodes a protein that had been described as cell-surface transmembrane E3 ubiquitin ligases, acting as negative regulators of Wnt/β-catenin signaling, by promoting the degradation of Wnt ligand receptors (Frizzled receptors). We show that ZNRF3 act as a tumor suppressor gene in adrenocortical cell line H295R. Indeed the overexpression of ZNRF3 decreases cell proliferation and increases apoptosis. We demonstrate also that ZNRF3 is a target gene of WNT/β-catenin pathway. ZNRF3 alterations have less effect on expression of WNT/β-catenin target genes than CTNNB1 mutations in ACC. Moreover, our results with ZNRF3 overexpression in H295R adrenocortical cells suggest that ZNRF3 is also involved in βcatenin independant-pathway(s) to mediate its effects on apoptosis. Using mass spectrometry analysis, we identified that ZNRF3 interacts with ATP1A1 (ATPase Na+/K+ Transporting Subunit Alpha 1), affecting the activity of the Na+/K+ ATPase pump in adrenocortical cells. These results provide a better understanding of the biological process of WNT/βcatenin pathway activation in ACC with AFF3 as new target of this pathway. Moreover, our data provide insight into the tumor suppressor role of ZNRF3 in ACC and uncovers an additional role of ZNRF3 on Na+/K+ ATPase pump activity.

Les carcinomes de la corticosurrénale (CC) sont des tumeurs malignes rares dont le pronostic est globalement sombre et les thérapeutiques encore limitées, la chirurgie étant le seul traitement efficace. Il est donc important de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement et l'agressivité des CC. L’activation constitutive de la voie de signalisation Wnt/b-caténine est fréquente dans les CC (40%) et est associée à un caractère agressif. L’objectif de mon projet de thèse était d’étudier l’implication de la voie Wnt/β-caténine dans la tumorigenèse corticosurrénalienne. La lignée cellulaire humaine H295R, issue d’un CC présente une activation de la voie Wnt/β-caténine qui a pour origine une mutation activatrice de la β-caténine. Nous avons montré que l'invalidation de la β-caténine dans les cellules H295R inhibe l'activité transcriptionnelle de la voie Wnt/β-caténine, diminue la prolifération, augmente l'apoptose et bloque la progression du cycle cellulaire. De plus, nous avons montré que la voie Wnt/b-caténine est essentielle au développement tumoral de xénogreffes de ces cellules chez la souris. L’activation de la voie Wnt/b-caténine participe à la tumorigenèse de nombreux organes en régulant l’expression de gènes impliqués par exemple dans la prolifération, la survie cellulaire ou l'adhésion. Afin de mieux comprendre comment la voie Wnt/β-caténine participe à la tumorigenèse corticosurrénalienne, nous avons cherché à identifier les gènes cibles de cette voie dans les CC. L’analyse des transcriptomes de deux cohortes indépendantes de CC et des cellules H295R avec ou sans invalidation de la β-caténine a permis d’identifier des gènes dont l'expression est corrélée à l'activation de la voie Wnt/b-caténine. Nous avons montré que parmi ces gènes, AFF3 est essentiel pour transmettre les effets de l'activation de la voie Wnt/b-caténine dans les carcinomes de la corticosurrénale. En effet, AFF3 est un gène cible direct de la voie Wnt/b-caténine et son invalidation dans les cellules corticosurrénaliennes H295R diminue la prolifération cellulaire et déclenche l'apoptose à l'image de l'invalidation de la b-caténine. AFF3 est une protéine nucléaire, localisée au niveau des speckles qui sont impliqués dans l'épissage des ARNm. De plus, AFF3 interagit avec le P-TEFb (CDK9/CyclineT1/2) au sein du Super elongation complex (SEC) nécessaire à l’élongation de la transcription des ARNm par l'ARN polymérase II. Nous avons ainsi montré dans les cellules corticosurrénaliennes H295R, que la surexpression d'AFF3 altère l’organisation des speckles et la localisation de CDK9 et Cycline T1. En conclusion, ce travail a permis d'identifier une nouvelle cible transcriptionnelle de la voie de signalisation Wnt/b-caténine, AFF3, qui code pour un médiateur important des effets de l'activation de cette voie dans la tumorigenèse corticosurrénalienne. AFF3 agirait notamment en altérant la structure des speckles et en interagissant avec le P-TEFb qui sont importants respectivement pour l'épissage des ARNm et la transcription. Ces résultats conduisent à une meilleure compréhension de la tumorigenèse corticosurrénalienne et permettent d'envisager le P-TEFb et le SEC comme de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des CC. / Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare and highly aggressive endocrine neoplasm, with limited therapeutic option. Currently, surgical resection is considered the only effective treatment. It is therefore essential to understand the molecular mechanisms involved in ACC development in order to improve their clinical management. Activation of the Wnt/b-catenin signaling pathway is frequent (40%) in ACC and is associated with poor prognosis. The aim of my thesis was to study the involvement of the Wnt/b-catenin signaling pathway in adrenocortical tumorigenesis. The human cell line H295R, derived from an ACC, carries the S45P β-catenin mutation which leads to constitutive β-catenin/TCF transcriptional activity. In the ACC cell line H295R we show that β-catenin silencing resulted in a decreased transcriptional activity of the Wnt/b-catenin signaling, cell cycle alterations, a decreased cell proliferation and an increased apoptosis. Moreover we show that β-catenin silencing abolish xenograft development of H295R adrenocortical cells. Aberrant activation of the Wnt/b-catenin signaling promotes tumorigenesis of several organs by enhancing expression of genes involved in proliferation, cell survival or cell adhesion. To better understand the role of the Wnt/b-catenin signaling in adrenocortical tumorigenesis, we wanted to identify target genes of this pathway in ACC. Combined transcriptomic analysis on two independent cohorts of ACC and on H295R adrenocortical cells with or without β-catenin silencing allow us to identify alterations of gene expression due to aberrant Wnt/βcatenin pathway activation. Among these genes, we show that AFF3 is essential to mediate the effect of the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway in adrenocortical cancer. Indeed, AFF3 is a direct target gene of the Wnt/b-catenin and its silencing in H295R adrenocortical cells induces a decreased cell proliferation and an increased apoptosis similar to that induced by b-catenin silencing. AFF3 is a nuclear protein located in nuclear speckles, which serve as a reservoir of factors participating in mRNA splicing. Moreover, AFF3 interacts with P-TEFb (CDK9/CyclinT1/2) in the Super elongation complex (SEC) required for transcriptional elongation of mRNA by RNA polymerase II. In H295R adrenocortical cells, we show that strong overproduction of AFF3 altered the structural organization of nuclear speckles and the localization of CDK9 and Cycline T1. In conclusion, this study has identified a new transcriptional target of the Wnt/β-catenin signaling pathway, AFF3, which encodes an important mediator of this pathway in adrenocortical tumorigenesis. AFF3 might especially act by affecting the structural organization of speckles and interacting with the P-TEFb, which are respectively involved in mRNA splicing and transcription. These results provide a better understanding of the biological process involved in ACC development and suggest that P-TEFb and SEC could be new therapeutic targets for the treatment of ACC.

Les carcinomes de la corticosurrénale (CC) sont des tumeurs malignes rares dont le pronostic est globalement sombre et les thérapeutiques encore limitées, la chirurgie étant le seul traitement efficace. Il est donc important de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement et l'agressivité des CC. L’activation constitutive de la voie de signalisation Wnt/b-caténine est fréquente dans les CC (40%) et est associée à un caractère agressif. L’objectif de mon projet de thèse était d’étudier l’implication de la voie Wnt/β-caténine dans la tumorigenèse corticosurrénalienne. La lignée cellulaire humaine H295R, issue d’un CC présente une activation de la voie Wnt/β-caténine qui a pour origine une mutation activatrice de la β-caténine. Nous avons montré que l'invalidation de la β-caténine dans les cellules H295R inhibe l'activité transcriptionnelle de la voie Wnt/β-caténine, diminue la prolifération, augmente l'apoptose et bloque la progression du cycle cellulaire. De plus, nous avons montré que la voie Wnt/b-caténine est essentielle au développement tumoral de xénogreffes de ces cellules chez la souris. L’activation de la voie Wnt/b-caténine participe à la tumorigenèse de nombreux organes en régulant l’expression de gènes impliqués par exemple dans la prolifération, la survie cellulaire ou l'adhésion. Afin de mieux comprendre comment la voie Wnt/β-caténine participe à la tumorigenèse corticosurrénalienne, nous avons cherché à identifier les gènes cibles de cette voie dans les CC. L’analyse des transcriptomes de deux cohortes indépendantes de CC et des cellules H295R avec ou sans invalidation de la β-caténine a permis d’identifier des gènes dont l'expression est corrélée à l'activation de la voie Wnt/b-caténine. Nous avons montré que parmi ces gènes, AFF3 est essentiel pour transmettre les effets de l'activation de la voie Wnt/b-caténine dans les carcinomes de la corticosurrénale. En effet, AFF3 est un gène cible direct de la voie Wnt/b-caténine et son invalidation dans les cellules corticosurrénaliennes H295R diminue la prolifération cellulaire et déclenche l'apoptose à l'image de l'invalidation de la b-caténine. AFF3 est une protéine nucléaire, localisée au niveau des speckles qui sont impliqués dans l'épissage des ARNm. De plus, AFF3 interagit avec le P-TEFb (CDK9/CyclineT1/2) au sein du Super elongation complex (SEC) nécessaire à l’élongation de la transcription des ARNm par l'ARN polymérase II. Nous avons ainsi montré dans les cellules corticosurrénaliennes H295R, que la surexpression d'AFF3 altère l’organisation des speckles et la localisation de CDK9 et Cycline T1. En conclusion, ce travail a permis d'identifier une nouvelle cible transcriptionnelle de la voie de signalisation Wnt/b-caténine, AFF3, qui code pour un médiateur important des effets de l'activation de cette voie dans la tumorigenèse corticosurrénalienne. AFF3 agirait notamment en altérant la structure des speckles et en interagissant avec le P-TEFb qui sont importants respectivement pour l'épissage des ARNm et la transcription. Ces résultats conduisent à une meilleure compréhension de la tumorigenèse corticosurrénalienne et permettent d'envisager le P-TEFb et le SEC comme de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des CC. / Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare and highly aggressive endocrine neoplasm, with limited therapeutic option. Currently, surgical resection is considered the only effective treatment. It is therefore essential to understand the molecular mechanisms involved in ACC development in order to improve their clinical management. Activation of the Wnt/b-catenin signaling pathway is frequent (40%) in ACC and is associated with poor prognosis. The aim of my thesis was to study the involvement of the Wnt/b-catenin signaling pathway in adrenocortical tumorigenesis. The human cell line H295R, derived from an ACC, carries the S45P β-catenin mutation which leads to constitutive β-catenin/TCF transcriptional activity. In the ACC cell line H295R we show that β-catenin silencing resulted in a decreased transcriptional activity of the Wnt/b-catenin signaling, cell cycle alterations, a decreased cell proliferation and an increased apoptosis. Moreover we show that β-catenin silencing abolish xenograft development of H295R adrenocortical cells. Aberrant activation of the Wnt/b-catenin signaling promotes tumorigenesis of several organs by enhancing expression of genes involved in proliferation, cell survival or cell adhesion. To better understand the role of the Wnt/b-catenin signaling in adrenocortical tumorigenesis, we wanted to identify target genes of this pathway in ACC. Combined transcriptomic analysis on two independent cohorts of ACC and on H295R adrenocortical cells with or without β-catenin silencing allow us to identify alterations of gene expression due to aberrant Wnt/βcatenin pathway activation. Among these genes, we show that AFF3 is essential to mediate the effect of the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway in adrenocortical cancer. Indeed, AFF3 is a direct target gene of the Wnt/b-catenin and its silencing in H295R adrenocortical cells induces a decreased cell proliferation and an increased apoptosis similar to that induced by b-catenin silencing. AFF3 is a nuclear protein located in nuclear speckles, which serve as a reservoir of factors participating in mRNA splicing. Moreover, AFF3 interacts with P-TEFb (CDK9/CyclinT1/2) in the Super elongation complex (SEC) required for transcriptional elongation of mRNA by RNA polymerase II. In H295R adrenocortical cells, we show that strong overproduction of AFF3 altered the structural organization of nuclear speckles and the localization of CDK9 and Cycline T1. In conclusion, this study has identified a new transcriptional target of the Wnt/β-catenin signaling pathway, AFF3, which encodes an important mediator of this pathway in adrenocortical tumorigenesis. AFF3 might especially act by affecting the structural organization of speckles and interacting with the P-TEFb, which are respectively involved in mRNA splicing and transcription. These results provide a better understanding of the biological process involved in ACC development and suggest that P-TEFb and SEC could be new therapeutic targets for the treatment of ACC.

Les carcinomes de la corticosurrénale (CC) sont des tumeurs malignes rares dont le pronostic est globalement sombre et les thérapeutiques encore limitées, la chirurgie étant le seul traitement efficace. Il est donc important de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement et l'agressivité des CC. L’activation constitutive de la voie de signalisation Wnt/b-caténine est fréquente dans les CC (40%) et est associée à un caractère agressif. L’objectif de mon projet de thèse était d’étudier l’implication de la voie Wnt/β-caténine dans la tumorigenèse corticosurrénalienne. La lignée cellulaire humaine H295R, issue d’un CC présente une activation de la voie Wnt/β-caténine qui a pour origine une mutation activatrice de la β-caténine. Nous avons montré que l'invalidation de la β-caténine dans les cellules H295R inhibe l'activité transcriptionnelle de la voie Wnt/β-caténine, diminue la prolifération, augmente l'apoptose et bloque la progression du cycle cellulaire. De plus, nous avons montré que la voie Wnt/b-caténine est essentielle au développement tumoral de xénogreffes de ces cellules chez la souris. L’activation de la voie Wnt/b-caténine participe à la tumorigenèse de nombreux organes en régulant l’expression de gènes impliqués par exemple dans la prolifération, la survie cellulaire ou l'adhésion. Afin de mieux comprendre comment la voie Wnt/β-caténine participe à la tumorigenèse corticosurrénalienne, nous avons cherché à identifier les gènes cibles de cette voie dans les CC. L’analyse des transcriptomes de deux cohortes indépendantes de CC et des cellules H295R avec ou sans invalidation de la β-caténine a permis d’identifier des gènes dont l'expression est corrélée à l'activation de la voie Wnt/b-caténine. Nous avons montré que parmi ces gènes, AFF3 est essentiel pour transmettre les effets de l'activation de la voie Wnt/b-caténine dans les carcinomes de la corticosurrénale. En effet, AFF3 est un gène cible direct de la voie Wnt/b-caténine et son invalidation dans les cellules corticosurrénaliennes H295R diminue la prolifération cellulaire et déclenche l'apoptose à l'image de l'invalidation de la b-caténine. AFF3 est une protéine nucléaire, localisée au niveau des speckles qui sont impliqués dans l'épissage des ARNm. De plus, AFF3 interagit avec le P-TEFb (CDK9/CyclineT1/2) au sein du Super elongation complex (SEC) nécessaire à l’élongation de la transcription des ARNm par l'ARN polymérase II. Nous avons ainsi montré dans les cellules corticosurrénaliennes H295R, que la surexpression d'AFF3 altère l’organisation des speckles et la localisation de CDK9 et Cycline T1. En conclusion, ce travail a permis d'identifier une nouvelle cible transcriptionnelle de la voie de signalisation Wnt/b-caténine, AFF3, qui code pour un médiateur important des effets de l'activation de cette voie dans la tumorigenèse corticosurrénalienne. AFF3 agirait notamment en altérant la structure des speckles et en interagissant avec le P-TEFb qui sont importants respectivement pour l'épissage des ARNm et la transcription. Ces résultats conduisent à une meilleure compréhension de la tumorigenèse corticosurrénalienne et permettent d'envisager le P-TEFb et le SEC comme de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des CC. / Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare and highly aggressive endocrine neoplasm, with limited therapeutic option. Currently, surgical resection is considered the only effective treatment. It is therefore essential to understand the molecular mechanisms involved in ACC development in order to improve their clinical management. Activation of the Wnt/b-catenin signaling pathway is frequent (40%) in ACC and is associated with poor prognosis. The aim of my thesis was to study the involvement of the Wnt/b-catenin signaling pathway in adrenocortical tumorigenesis. The human cell line H295R, derived from an ACC, carries the S45P β-catenin mutation which leads to constitutive β-catenin/TCF transcriptional activity. In the ACC cell line H295R we show that β-catenin silencing resulted in a decreased transcriptional activity of the Wnt/b-catenin signaling, cell cycle alterations, a decreased cell proliferation and an increased apoptosis. Moreover we show that β-catenin silencing abolish xenograft development of H295R adrenocortical cells. Aberrant activation of the Wnt/b-catenin signaling promotes tumorigenesis of several organs by enhancing expression of genes involved in proliferation, cell survival or cell adhesion. To better understand the role of the Wnt/b-catenin signaling in adrenocortical tumorigenesis, we wanted to identify target genes of this pathway in ACC. Combined transcriptomic analysis on two independent cohorts of ACC and on H295R adrenocortical cells with or without β-catenin silencing allow us to identify alterations of gene expression due to aberrant Wnt/βcatenin pathway activation. Among these genes, we show that AFF3 is essential to mediate the effect of the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway in adrenocortical cancer. Indeed, AFF3 is a direct target gene of the Wnt/b-catenin and its silencing in H295R adrenocortical cells induces a decreased cell proliferation and an increased apoptosis similar to that induced by b-catenin silencing. AFF3 is a nuclear protein located in nuclear speckles, which serve as a reservoir of factors participating in mRNA splicing. Moreover, AFF3 interacts with P-TEFb (CDK9/CyclinT1/2) in the Super elongation complex (SEC) required for transcriptional elongation of mRNA by RNA polymerase II. In H295R adrenocortical cells, we show that strong overproduction of AFF3 altered the structural organization of nuclear speckles and the localization of CDK9 and Cycline T1. In conclusion, this study has identified a new transcriptional target of the Wnt/β-catenin signaling pathway, AFF3, which encodes an important mediator of this pathway in adrenocortical tumorigenesis. AFF3 might especially act by affecting the structural organization of speckles and interacting with the P-TEFb, which are respectively involved in mRNA splicing and transcription. These results provide a better understanding of the biological process involved in ACC development and suggest that P-TEFb and SEC could be new therapeutic targets for the treatment of ACC.