Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1953. / Typescript. Vita. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references (leaves [112]-113).

The genetic pathways influencing alcohol abuse and dependence are poorly characterized. Many critical discoveries about the interactions between ethanol-related behaviors and genetics have been made in the fruit fly Drosophila melanogaster. Coupling the statistical power of model organism studies to human association studies bolsters the analytical efficacy of these genomic approaches. A variety of behavioral assays are available for assessing behavioral responses to ethanol in Drosophila. However, we find our previously described eRING assay is influenced by the commonly used transgenic marker mini-white. We developed a Simple Sedation Assay (SSA) that is insensitive to the effects of white and mini-white. In SSAs, expression of endogenous wild-type white was not necessary for normal responses to ethanol. Neither expression nor RNAi-mediated knockdown of the transgenic mini-white influenced the effects of ethanol in flies. Critically, mini-white expression did not affect the phenotypes of flies with known alterations in ethanol sensitivity. Also, loss of function mutations in Clic show decreased sensitivity to ethanol in both eRING assays (as previously reported) and SSAs. Therefore, we explored the role of the known Clic interactors, TGF-β and ryanodine receptors. These studies were inconclusive but do not exclude the need for future work. Finally, using bioinformatic tools we constructed a mutli-species network of genes predicted to interact with Clic. Our RNAi screen against the Clic network serves as an important proof-of-concept and holds great potential for uncovering important therapeutic targets for alcohol use disorders.

A elevada incidência de acidentes de trânsito está fortemente relacionada ao consumo de bebidas alcoólicas. No Brasil a verificação do uso de álcool entre os condutores é realizada através dos etilômetros e da confirmação do etanol presente no sangue pela técnica de headspace (HS) associada à cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de chama (CG/DIC). Não foram encontrados na literatura métodos para determinação de etanol em fluido oral (FO), utilizando a cromatografia em fase gasosa com detector de massas (CG/EM). Objetivos: Realizar a otimização da extração do etanol do fluido oral pela técnica de HS através de desenho experimental e posterior validação de metodologia analítica para a determinação de etanol em FO através de CG/EM e CG/DIC, utilizando o Quantisal® como dispositivo de coleta. Métodos: O desenho experimental foi desenvolvido através do Box–Behnken Design (BBD), onde foram avaliados a temperatura, o tempo de agitação e o volume injetado. O método foi validado de acordo com as recomendações do FDA e ANVISA considerando os parâmetros de seletividade, efeito residual, efeito matriz, linearidade, precisão, exatidão, limite de detecção e quantificação, estabilidade e recuperação. Resultados: As melhores condições do HS obtidas pelo desenho foram: temperatura de 90ºC, volume de injeção de 1000 μL e tempo de extração de 7 min. O método mostrou-se linear na faixa de 0,05-2 g/L (0,5-20 dg/L). Os valores de exatidão situaram-se na faixa de 101,56 e 111,29% e os valores obtidos para a precisão intra e interdia foram inferiores a 12%. Os limites de quantificação e de detecção encontrados foram iguais a 0,0125 g/L e 0,005 g/L para a CG/EM e 0,05 g/L e 0,0129 g/L para a CG/DIC, respectivamente. Conclusões: O método desenvolvido mostrou-se eficaz na determinação inequívoca de etanol em fluido oral através da técnica de HS-CG/EM e utilizando o dispositivo de coleta Quantisal®, atingindo limites de detecção inferiores ao encontrados pelas análises em CG/DIC, sem a necessidade de confirmação por outros sistemas cromatográficos e podendo ser facilmente aplicado na rotina laboratorial. / The high incidence of traffic accidents is strongly related to alcohol consumption. In Brazil the verification of alcohol use among drivers is performed through the breath alcohol analyzers and confirmation of ethanol in blood by the headspace technique (HS) associated to gas chromatography with flame ionization detector (GC/FID). To the best of our knowledge there are no methods for the determination of ethanol in oral fluid (OF), using gas chromatography with mass detection (GC/MS) in the literature. Propose: Perform the optimization of the extraction of ethanol from OF by headspace technique (HS) through experimental design and subsequent validation of analytical method for the determination of ethanol in OF by GC/MS and GC/DIC, using Quantisal® as a collection device. Methods: The experimental design was performed using the Box-Behnken Design (BBD) and the evaluated parameters were temperature, stirring time and sample volume injected. The methods were validated according to FDA and ANVISA recommendations considering the parameters of selectivity, residual effect, matrix effect, linearity, precision, accuracy, limit of detection and quantification, stability and recovery. Results: The best conditions of HS obtained by design were: temperature 90°C, injection volume 1000 μL and extraction time of 7 min. The method was linear in the range of 0.05-2 g/L (or 0.5-20 dg/L). The values of accuracy stay in the range of 101.56 and 111.29% and values for intra and inter-day precision were less than 12%. The limits of detection and quantification were found equal to 0.0125 g/L and 0.005 g/L for GC/MS and 0.05 g/L and 0.0129 g/L for GC/FID, respectively. Conclusions: The method was effective in unequivocal determination of ethanol in oral fluid by HS-GC/MS and using the collection device Quantisal®, reaching detection limits lower than that found by analysis on HS-GC/FID, without the need confirmation by other chromatographic systems and can be easily applied for routine monitoring.

A elevada incidência de acidentes de trânsito está fortemente relacionada ao consumo de bebidas alcoólicas. No Brasil a verificação do uso de álcool entre os condutores é realizada através dos etilômetros e da confirmação do etanol presente no sangue pela técnica de headspace (HS) associada à cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de chama (CG/DIC). Não foram encontrados na literatura métodos para determinação de etanol em fluido oral (FO), utilizando a cromatografia em fase gasosa com detector de massas (CG/EM). Objetivos: Realizar a otimização da extração do etanol do fluido oral pela técnica de HS através de desenho experimental e posterior validação de metodologia analítica para a determinação de etanol em FO através de CG/EM e CG/DIC, utilizando o Quantisal® como dispositivo de coleta. Métodos: O desenho experimental foi desenvolvido através do Box–Behnken Design (BBD), onde foram avaliados a temperatura, o tempo de agitação e o volume injetado. O método foi validado de acordo com as recomendações do FDA e ANVISA considerando os parâmetros de seletividade, efeito residual, efeito matriz, linearidade, precisão, exatidão, limite de detecção e quantificação, estabilidade e recuperação. Resultados: As melhores condições do HS obtidas pelo desenho foram: temperatura de 90ºC, volume de injeção de 1000 μL e tempo de extração de 7 min. O método mostrou-se linear na faixa de 0,05-2 g/L (0,5-20 dg/L). Os valores de exatidão situaram-se na faixa de 101,56 e 111,29% e os valores obtidos para a precisão intra e interdia foram inferiores a 12%. Os limites de quantificação e de detecção encontrados foram iguais a 0,0125 g/L e 0,005 g/L para a CG/EM e 0,05 g/L e 0,0129 g/L para a CG/DIC, respectivamente. Conclusões: O método desenvolvido mostrou-se eficaz na determinação inequívoca de etanol em fluido oral através da técnica de HS-CG/EM e utilizando o dispositivo de coleta Quantisal®, atingindo limites de detecção inferiores ao encontrados pelas análises em CG/DIC, sem a necessidade de confirmação por outros sistemas cromatográficos e podendo ser facilmente aplicado na rotina laboratorial. / The high incidence of traffic accidents is strongly related to alcohol consumption. In Brazil the verification of alcohol use among drivers is performed through the breath alcohol analyzers and confirmation of ethanol in blood by the headspace technique (HS) associated to gas chromatography with flame ionization detector (GC/FID). To the best of our knowledge there are no methods for the determination of ethanol in oral fluid (OF), using gas chromatography with mass detection (GC/MS) in the literature. Propose: Perform the optimization of the extraction of ethanol from OF by headspace technique (HS) through experimental design and subsequent validation of analytical method for the determination of ethanol in OF by GC/MS and GC/DIC, using Quantisal® as a collection device. Methods: The experimental design was performed using the Box-Behnken Design (BBD) and the evaluated parameters were temperature, stirring time and sample volume injected. The methods were validated according to FDA and ANVISA recommendations considering the parameters of selectivity, residual effect, matrix effect, linearity, precision, accuracy, limit of detection and quantification, stability and recovery. Results: The best conditions of HS obtained by design were: temperature 90°C, injection volume 1000 μL and extraction time of 7 min. The method was linear in the range of 0.05-2 g/L (or 0.5-20 dg/L). The values of accuracy stay in the range of 101.56 and 111.29% and values for intra and inter-day precision were less than 12%. The limits of detection and quantification were found equal to 0.0125 g/L and 0.005 g/L for GC/MS and 0.05 g/L and 0.0129 g/L for GC/FID, respectively. Conclusions: The method was effective in unequivocal determination of ethanol in oral fluid by HS-GC/MS and using the collection device Quantisal®, reaching detection limits lower than that found by analysis on HS-GC/FID, without the need confirmation by other chromatographic systems and can be easily applied for routine monitoring.

A elevada incidência de acidentes de trânsito está fortemente relacionada ao consumo de bebidas alcoólicas. No Brasil a verificação do uso de álcool entre os condutores é realizada através dos etilômetros e da confirmação do etanol presente no sangue pela técnica de headspace (HS) associada à cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de chama (CG/DIC). Não foram encontrados na literatura métodos para determinação de etanol em fluido oral (FO), utilizando a cromatografia em fase gasosa com detector de massas (CG/EM). Objetivos: Realizar a otimização da extração do etanol do fluido oral pela técnica de HS através de desenho experimental e posterior validação de metodologia analítica para a determinação de etanol em FO através de CG/EM e CG/DIC, utilizando o Quantisal® como dispositivo de coleta. Métodos: O desenho experimental foi desenvolvido através do Box–Behnken Design (BBD), onde foram avaliados a temperatura, o tempo de agitação e o volume injetado. O método foi validado de acordo com as recomendações do FDA e ANVISA considerando os parâmetros de seletividade, efeito residual, efeito matriz, linearidade, precisão, exatidão, limite de detecção e quantificação, estabilidade e recuperação. Resultados: As melhores condições do HS obtidas pelo desenho foram: temperatura de 90ºC, volume de injeção de 1000 μL e tempo de extração de 7 min. O método mostrou-se linear na faixa de 0,05-2 g/L (0,5-20 dg/L). Os valores de exatidão situaram-se na faixa de 101,56 e 111,29% e os valores obtidos para a precisão intra e interdia foram inferiores a 12%. Os limites de quantificação e de detecção encontrados foram iguais a 0,0125 g/L e 0,005 g/L para a CG/EM e 0,05 g/L e 0,0129 g/L para a CG/DIC, respectivamente. Conclusões: O método desenvolvido mostrou-se eficaz na determinação inequívoca de etanol em fluido oral através da técnica de HS-CG/EM e utilizando o dispositivo de coleta Quantisal®, atingindo limites de detecção inferiores ao encontrados pelas análises em CG/DIC, sem a necessidade de confirmação por outros sistemas cromatográficos e podendo ser facilmente aplicado na rotina laboratorial. / The high incidence of traffic accidents is strongly related to alcohol consumption. In Brazil the verification of alcohol use among drivers is performed through the breath alcohol analyzers and confirmation of ethanol in blood by the headspace technique (HS) associated to gas chromatography with flame ionization detector (GC/FID). To the best of our knowledge there are no methods for the determination of ethanol in oral fluid (OF), using gas chromatography with mass detection (GC/MS) in the literature. Propose: Perform the optimization of the extraction of ethanol from OF by headspace technique (HS) through experimental design and subsequent validation of analytical method for the determination of ethanol in OF by GC/MS and GC/DIC, using Quantisal® as a collection device. Methods: The experimental design was performed using the Box-Behnken Design (BBD) and the evaluated parameters were temperature, stirring time and sample volume injected. The methods were validated according to FDA and ANVISA recommendations considering the parameters of selectivity, residual effect, matrix effect, linearity, precision, accuracy, limit of detection and quantification, stability and recovery. Results: The best conditions of HS obtained by design were: temperature 90°C, injection volume 1000 μL and extraction time of 7 min. The method was linear in the range of 0.05-2 g/L (or 0.5-20 dg/L). The values of accuracy stay in the range of 101.56 and 111.29% and values for intra and inter-day precision were less than 12%. The limits of detection and quantification were found equal to 0.0125 g/L and 0.005 g/L for GC/MS and 0.05 g/L and 0.0129 g/L for GC/FID, respectively. Conclusions: The method was effective in unequivocal determination of ethanol in oral fluid by HS-GC/MS and using the collection device Quantisal®, reaching detection limits lower than that found by analysis on HS-GC/FID, without the need confirmation by other chromatographic systems and can be easily applied for routine monitoring.