Memoria para optar al título profesional de Químico / Los compuestos orgánicos volátiles biogénicos (COVBs) son compuestos no-metílicos incluyendo alcanos, alquenos, carbonilos, alcoholes, ésteres, éteres y ácidos. El principal es el isopreno (C5H8) y la unión de dos o más estructuras de este compuesto da origen a los monoterpenos (CxHy). La emisión de COVBs produce diversos efectos en la atmósfera desencadenando diversas reacciones con •OH, •NO3 y O3 generando la formación de compuestos oxigenados y ozono troposférico. En este estudio se caracterizan las emisiones y se determinan los factores de emisión de los COVBs en distintas etapas de crecimiento de dos especies arbóreas de la Región Metropolitana: una nativa, Quillaja saponaria (Quillay) y otra exótica, Quercus suber (Alcornoque). A cada una de ellas se les estudia sus emisiones a distintas edades. El muestreo se realizó en una cámara de encierro estático por adsorción en tubos TENAX incorporando sensores de control de temperatura, humedad relativa y radiación fotosintéticamente activa. Las muestras son desorbidas y concentradas mediante un equipo de desorción térmica automático (DTA) y se cuantifican mediante GC-FID. Los COVBs emitidos son ordenados de acuerdo a su habilidad para la formación de ozono troposférico, según el índice potencial formador de ozono (IPFO); se identificaron 6 compuestos del total de COVBs estudiados. De estos compuestos seleccionados el Alcornoque adulto emite 8,2%, el joven 11,95% y el pequeño 7,45% del total estudiado. El Quillay adulto emite 5,7%, el joven 5,8% y el pequeño 8,1% del total estudiado. En relación a cada especie los individuos en crecimiento presentan mayores emisiones que los individuos adultos. Los mecanismos propuestos entre •OH, •NO3 y O3 y los compuestos de mayor IPFO generan como intermediario principal al biradical Criegee, el cual dependiendo de como se sintetice generará diferentes productos en la atmósfera. / Biogenic volatile organic compounds (BVOC) are non-methyl compounds including alkanes, alkenes, carbonyls, alcohols, esters, ethers and acids. The principal is isoprene (C5H8) and the union of two or more structures of this compound gives rise to monoterpenes (HxCy). The emission of BVOC produce different effects on the atmosphere triggering different reactions with •OH, •NO3 and O3 generating the formation of oxygenated compounds and tropospheric ozone. In this study we characterize emissions and emission factors of BVOC at different stages of growth of two tree species of the Metropolitan Region: one native, Quillaja saponaria (quillaja) and other exotic, Quercus suber (cork oak). Each of these emissions were studied at different ages. Sampling was conducted in a static confinement chamber by adsorption on Tenax tubes incorporating temperature control sensors, relative humidity and photosynthetically active radiation. The samples are desorbed and concentrated by a automatic thermal desorption equipment (ATD) and quantified by GC-FID. The COVBs emitted are ordered according to their ability to tropospheric ozone formation, as measured by the ozone forming potential (IPFO); 6 compounds of the total identified COVBs were selected. Of these compounds selected the adult Cork oak emits 8.2%, young 11.95 % and small 7.45% of total study. The adult Quillay emits 5.7%, young 5.8% and small 8.1% of total study. For each species growing individuals have higher emissions than adult individuals. Proposed mechanisms between • OH, • NO3 and O3 and the compounds with the higher IPFO includes as intermediary the Criegee biradical, which different products incorporate into the atmosphere.

La peridermis és una estructura complexa que protegeix els òrgans vegetals madurs (secundaris) i les zones que han sofert ferides de la pèrdua d'aigua i dels patògens. Aquesta funció barrera és deguda al fel·lema o súber, un teixit format per cèl·lules suberificades. Tant el fel·lema com la suberina són crucials per la vida de les plantes terrestres, però pràcticament no es coneix res dels processos moleculars que regulen la seva formació, probablement degut a la manca de models adequats. En aquesta tesi s'han identificat i caracteritzat gens induïts al fel·lema mitjançant la combinació de dues plantes models. L'escorça d'alzina surera (Quercus suber) s'ha utilitzat per aïllar gens candidats de la formació del fel·lema i per investigar el comportament d'alguns d'aquests gens durant l'estació de creixement, mentre que la pela de la patata (Solanum tuberosum) s'ha utilitzat en estudis de genètica reversa per demostrar la funció d'alguns gens reguladors al fel·lema. / The periderm is a complex structure that protects plant mature (secondary) organs and wounded tissues from water loss, injuries and pathogens. This barrier capacity is accomplished by the cork layer of the periderm, a tissue made of dead cells with suberin deposited into cell walls. Although cork and suberin are critical for the survival of land plants, very few is known about the molecular processes involved in their biosynthesis and differentiation, probably due to the lack of appropriate plant models. Here we developed a strategy to identify and characterize cork candidate genes using a combination of two model plants for periderm studies. The bark of cork oak (Quercus suber) was used to identify candidate genes and to analyze the seasonal behaviour of some of these genes. The potato (Solanum tuberosum) tuber was used to demonstrate the role of some selected candidates in the regulation of cork by reverse genetic analyses.

Els organismes responen a la temperatura i a molts altres estressos sintetitzant un grup de proteïnes anomenat proteïnes de xoc de calor (HSPs). En plantes les sHsps, d'entre 15 i 30 kDa formen el grup més abundant i divers, classificat en funció de la seva localització subcel.lular i homologia en: mitocondrials, cloroplàstiques, de reticle endoplasmàtic i citoplàsmiques de classe I i II. Les sHsps-CI s'ha descrit que s'indueixen per estrès tèrmic, hídric i oxidatiu (peròxid d'hidrògen, llum UV, ozó) i en resposta a algunes hormones. També s'expressen durant el desenvolupament, per exemple durant l'embriogènesi, on es creu que podrien tenir un paper protector de l'embrió enfront la dessecació. Tot i que hi ha abundants treballs que correlacionen la resistència a l'estrès i l'acumulació de sHsps-CI, els mecanismes moleculars d'aquesta activitat són poc conguts. Tot i això, per diverses sHsps-CI ha estat descrita una activitat xaperona in vitro i, més recentment, que la seva sobreexpressió augmenta la viabilitat de cèl.lules d'E.coli en condicions d'estrès tèrmic.L'estudi de l'acumulació de sHsps-CI en surera (Quercus suber) mitjançant immunodetecció en electroforesi bidimensional mostra uns patrons d'acumulació complexos i formats per dos grups d'espècies proteiques principals, a l'entorn dels 10 i 17 kDa respectivament, que mostren una inducció diferencial en funció del teixit i l'estrès. Mentre que les espècies proteiques de 17 kDa s'indueixen per temperatura però no per estrès oxidatiu, les de ca. 10 kDa ho fan per estrès oxidatiu i no per temperatura. Ambdós grups d'espècies proteiques s'acumulen conjuntament en fel.lema. Assajos de PCR i RT-PCR han permès clonar parcialment tres noves sHsps-CI en surera: Qshsp10-CI, QshspC-CI i QshspD-CI. Aquest fet confirma la multigeneïcitat de les sHsps-CI en surera que apuntava el patró bidimensional. Dels nous clons obtinguts destaca especialment Qshsp10-CI, un gen que presenta un codó stop enmig del domini -cristal.lí que fa que a la proteïna que se'n dedueix li manqui un 55% del domini -cristal.lí i tota l'extensió C-terminal. Es tractaria de la sHsp més petita i més truncada descrita fins al moment. L'anàlisi de l'expressió de Qshsp10-CI mitjançant RT-PCR mostra expressió en plantes tractades amb H2O2 però no en les que han estat sotmeses a un xoc de calor. Aprofitant l'oportunitat que oferia aquesta sHsp-CI de ser utilitzada com a model per l'estudi de la importància del domini -cristal.lí i l'extensió C-terminal en l'activitat protectora enfront l'estrès, es va voler determinar la capacitat que tenia d'augmentar la viabilitat de cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i oxidatiu. Els resultats mostren que la proteïna recombinant QsHsp10-CI, tot i la important truncació que té, és capaç de protegir cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i, remarcablement, en condicions d'estrès oxidatiu. Tots aquests resultats indiquen que les espècies proteiques de ca. 10 kDa podrien correspondre a Qshsp10-CI i tenir un paper en les cèl.lules del fel.lema en la protecció enfront l'estrès oxidatiu.L'estrès oxidatiu provoca lesions al DNA que poden produir errors en la replicació, transcripció o traducció i generar proteïnes aberrants. Donades les condicions d'estrès oxidatiu a les quals es troben sotmeses les cèl.lules del fel.lema, s'ha volgut estudiar la variabilitat dels seus àcids nucleics. La determinació de la taxa de mutació de la regió codificant del gen Qshsp17.4-CI en mRNA i DNA de fel.lema i àpex radicular, un teixit jove i en creixement actiu va mostrar unes taxes sorprenentment elevades en l'mRNA (1/1784 pb) i el DNA genòmic (1/1520 pb) del fel.lema. Aquestes taxes són les més altes descrites en un genoma nuclear eucariota i són similars a les dels virus d'RNA d'evolució ràpida com el virus de l'Hepatitis C. Amb aquestes taxes de mutació, un terç dels mRNAs del fel.lema de la surera contindrien missatges aberrants i la supervivència de les cel.lules es veuria compromesa. Això implica que el fel.lema hauria de ser considerat com un mosaic de cèl.lules genèticament heterogènies i, per tant, una sola seqüència no defineix en tota la seva amplitud un gen en aquest teixit. No es va detectar cap mutació en àpex de rel. Amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement de les mutacions que es donen en aquests dos teixits i per tal de poder fer una anàlisi qualitativa més completa que permetés especular sobre el seu origen, es va aplicar un mètode de selecció de seqüències mutants en base a la utilització d'enzims de restricció. Les mutacions detectades en fel.lema es corresponen amb les relacionades, en altres sistemes no nuclears (plasmidis, fags i DNA bacterià), amb l'estrès oxidatiu. En conseqüència, l'estrès oxidatiu al qual estan sotmeses les cèl.lules del fel.lema podria ser el causant de l'elevada taxa de mutació detectada. D'acord amb això, el tipus majoritari de productes d'oxidació de les bases del DNA que s'acumulen en brots de plàntules de surera en resposta al peròxid d'hidrògen produeixen el mateix tipus de mutacions detectades en l'mRNA del fel.lema de la surera. La major sensibilitat d'aquest nou mètode ha permès, a més, detectar mutacions en molècules d'mRNA de rel, un teixit en el qual no s'havia trobat cap mutació utilitzant el mètode de clonatge i seqüenciació directa. Tot i això, el tipus de mutacions predominants no estan relacionades amb l'estrès oxidatiu sinó amb erros en la reparació dels àcids nucleics. / Small heat shock proteins (sHsps,15-30 kDa) are the most abundant and diversified Hsps in plants. They have been classified according to its homology and cellular localisation in: mitochondrial, chloroplastic, endoplasmic reticulum and class I and II citoplasmic sHsps. Although sHsps-CI are involved in the stress response and accumulate at some stages of embryonic development and there is abundant work correlating stress resisitance and sHsps accumulation, the molecular mechanisms of their activity are not well known. However, in vivo and in vitro chaperone activity under temperature stress has been described. 2D immunodetection patterns of cork oak (Quercus suber) sHsps-CI (thermic, hydric and oxidative). At the 17 kDa region there is a set of protein species highly induced by temperature and, at least some of them correspond to QsHsp17.4-CI. On the other hand, protein species at the ca. 10 kDa region are highly induced under oxidative stress conditions and accumulate in the endogenous oxidatively stressed tissues xylem and phellem but not after a heat shock. PCR and RT-PCR assays allowed us to clone three new members of the sHsps-CI multigenic family in cork oak. Among them, Qshsp10-CI is specially interesting because codes for a truncated protein that lacks 55% of the -crystallin domain and all the C-terminal extension, being the more C-terminal truncated sHsp reported to date. Overexpression of recombinant QsHsp10-CI and a more truncated protein lacking the whole -crystallin domain in E. coli cells shows that most of the -crystallin domain and all the C-terminal extension are dispensable, but amino acids 1 to 41 of the -crystallin domain (including the consensus II region) are essential for sHsps-CI protective activity under temperature and oxidative stress conditions. The expression of Qshsp10-CI in response to oxidative but not temperature stress and its protective activity of E. coli cells under oxidative stress conditions points to a correspondence between Qshsp10-CI and the ca. 10 kDa protein species detected in 2D immunodetections and a protective activity of those in the oxidatively stressed phellem cells. Endogenous oxidative stress of phellem cells might generate mutations accumulation in nucleic acids. Variability analyses of DNA and mRNA of phellem cells in the coding region of Qshsp17.4-CI showed a surprisingly high rate of mutation in both mRNA (1/1784 bp) and genomic DNA (1/1520 bp). These are the highest rates described for a nuclear eukariotic genome and are similar to those detected in RNA viruses. With these mutation rates one third of mRNAs of phellem cells would contain mutations and code for abnormal proteins. No mutations were detected in root tip, a normally growing young tissue. With the aim of deeping into the nature of mutations that accumulate in phellem cells, we applied a method to in vitro select mutant sequences using restriction enzymes. The types of mutation predominant in phellem cells mRNA were those related with oxidative stress in other systems (plasmids, phages and bacterial DNA). In addition, the predominant DNA lesions that accumulate in H2O2 treated cork oak plantlets, as shown by GC-MS analyses, generate the same type of mutations detected in mRNA of phellem cells. Accordingly, the high accumulation of mutations detected in phellem cells might be due to its endogenous oxidative stress. Moreover, young and actively growing tissues are also subjected to a certain degree of base lesions and mRNA mutations. However, both mutational spectrum and accumulation levels are different compared to oxidatively stressed tissues.