Alzheimer’s Disease, also called AD, is a horrible, degenerative brain disease that more than 35 million people over the world have. Today, there is no cure for this disease, only treatments that are temporarily relieving the symptoms. The two proteins that is thought to be the main cause of AD is amyloid β (Aβ) and tau. Previously, people have tried studying Aβ in vivo using green fluorescent protein fusion together with Aβ. However, this is difficult since the aggregation of Aβ will lead to loss of fluorescence. This study aimed to crystallize the fusion protein mNG-A β1-42 and to investigate its properties as a molecular fluorescent Aβ-amyloid specific probe. Dynamic light scattering (DLS) was used to confirm that the majority of the protein was not in the form of soluble aggregates. The DLS experiments were followed by several rounds of crystallization trials. Initial screening and the subsequent narrowing down of potential conditions where mNG-Aβ1-42 could form crystals. Several staining experiments were conducted as well, including staining brain tissue from mouse with both Swedish and Arctic mutation, from human patients with sporadic AD and from human patients with AD with the Arctic mutation. The DLS experiments showed that the protein used in the crystallization experiments mostly consisted of molecular particles of the same radius. However, there was clear evidence of some larger species present that could have been a potential problem for crystallization. Crystallization experiments suggested that PEG 8000 was the most promising precipitant amongst other conditions identified for crystallization of mNG-Aβ1-42. However, the study was ultimately unsuccessful in developing crystals of sufficient high quality for diffraction studies to commence. The staining experiments demonstrated that mNG-Aβ1-42 could bind both by itself and with another amyloid probe, Congo red, and with antibodies in brain tissue from mouse with both Swedish and Arctic mutation, from human patients with sporadic AD and from human patients with AD with the Arctic mutation. In conclusion, several characteristics of mNG-Aβ1-42 were revealed in this study.

Les fonctions cognitives reposent sur la communication dynamique de régions cérébrales interconnectées. Dans la maladie d’Alzheimer (MA), les travaux antérieurs suggèrent que le processus neuropathologique cible de façon précoce un ou plusieurs systèmes anatomo-fonctionnels spécifiques. La dysfonction du réseau par défaut a été objectivée de façon consistante. Cependant, ses relations avec les symptômes cliniques et avec l’atteinte des régions du lobe temporal interne qui lui sont fonctionnellement connectées restent à clarifier. L’IRM fonctionnelle de repos est une technique pertinente pour caractériser in vivo chez l’Homme la connectivité cérébrale.Par une approche des systèmes neuraux, ce travail de thèse a pour objectif de caractériser la réorganisation fonctionnelle neuronale dans la MA, ses corrélats cliniques, ainsi que l’influence de l’âge de début des symptômes. Par le recueil et l’analyse des données neuropsychologiques, en IRMf de repos et en IRM structurale, acquises chez des sujets avec des troubles de la mémoire et avec une forme mnésique légère de MA, notre travail apporte des éclairages : i) sur l’implication du réseau temporal antérieur dans la mémoire déclarative décontextualisée et ses modifications dans le cours de la MA ; ii) sur les similitudes et spécificités des systèmes anatomo-fonctionnels ciblés dans les deux formes cliniques distinctes - à début précoce et tardif - de la MA ; iii) sur la réorganisation de l’organisation topologique cérébrale dans son ensemble de ces deux formes de la maladie. / Cognitive functions rely on the dynamic interplay of connected brain regions. Previous studies suggest that in Alzheimer disease (AD), early pathological changes target one or several specific anatomo-functional networks. Dysfunction of the default mode network is a consistent finding. However, its relationship with clinical symptoms and interconnected medial temporal regions remains to be clarified. Resting state functional MRI (fMRI) is an emerging method aimed at characterizing in vivo brain connectivity in the Human.Using a neural system approach, the aim of this thesis was to characterize neuronal functional reorganization in AD, its clinical correlates, and to determine the influence of age at onset. Neuropsychological data, structural and fMRI were obtained in subjects with early memory impairment and mild “amnestic” AD. This work provides new insights into : i) the functional role of the anterior temporal network in context-free declarative memory and its changes throughout the course of AD; ii) the common and specific features in targeted anatomo-functional networks between early and late onset AD ; iii) the reorganization of whole brain topological properties in the two forms of the disease.

Les mécanismes de type prion sont désormais reconnus comme sous-tendant la plupart des maladies neurodégénératives humaines, avec en premier lieu la maladie d’Alzheimer (MA) au niveau de ses 2 marqueurs spécifiques, l’amyloïde β (Aβ à l’origine de l’hypothèse étiopathogénique de la cascade amyloïde) et la protéine Tau phosphorylée. Par ailleurs la protéine du prion (PrPC) est décrite comme interagissant à de multiples niveaux avec le métabolisme de l’Aβ sans que les mécanismes physiopathologiques sous-jacents n’aient pu être expliqués. Pour sortir de l’impasse actuelle concernant le développement d’approches thérapeutiques efficaces pour la MA, l’industrie pharmaceutique a besoin de modèles expérimentaux innovants. En effet, à ce jour aucun modèle in vivo, en dépit des progrès réalisés avec les souris transgéniques, n’arrive à refléter la complexité cérébrale humaine ni à mimer une MA clinique. Les cultures in vitro en 2D sont quant à elles très éloignées des situations conduisant à l’accumulation d’agrégats protéiques pathologiques. Le but de notre thèse a été d’utiliser dans le domaine des neurosciences les nouvelles perspectives de recherche ouvertes par les technologies des cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) en développant un modèle de différentiation en 3D pour obtenir des organoïdes cérébraux humains (OC) (mini cerveaux). Leur capacité d’auto-organisation en 3D de tissu neuroectodermique nous a permis de recréer un système complexe mimant différentes structures cérébrales humaines dans lesquelles nous avons pu caractériser les marqueurs attendus. L’étude de l’expression des protéines d’intérêt APP et PrPC pendant la différentiation neurale a permis de caractériser la modulation des niveaux des deux protéines en fonction du temps de culture. Afin d’orienter le modèle vers des mécanismes d’accumulation protéique de type MA, nous avons testé différents inducteurs chimiques dont l’Aftin-5 qui est capable de moduler les voies post-traductionnelles de l’APP. Plusieurs stratégies de traitement ont été adoptées pour induire le clivage de l’APP et la génération d’Aβ. La production des fragments solubles Aβ38, Aβ40, Aβ42 a été mise en évidence par ELISA. Les niveaux générés sont reproductibles et l’augmentation du ratio Aβ42/Aβ40 est cohérente avec les données extrapolées des modèles murins et humains, ce qui a permis de valider notre modèle. Les niveaux d’expression génique et protéique de PrPC et de APP suite au traitement ont été analysés afin de mieux déterminer le rôle de l’interaction entre ces deux facteurs. L’objectif à long terme consiste à améliorer ce modèle, dont les limites actuelles sont notamment l’absence de vascularisation et le niveau de maturation du tissu neural. Le défi majeur dans le cadre de la culture des OC consiste donc à favoriser l’intégration du système vasculaire, et par ailleurs à accélérer le vieillissement in vitro pour l’étude de maladies neurodégénératives. La perspective de pouvoir automatiser le système de culture des OC permet d’envisager l’utilisation de ce modèle à plus grande échelle dans le cadre de test de cytotoxicité et/ou de criblage pharmacologique à haut débit pour identifier de nouvelles molécules thérapeutiques pour la MA. / Prion-like mechanisms are known to underlie most of human neurodegenerative diseases including Alzheimer’s disease (AD), which is characterized by two important pathological markers, β amyloid (or Aβ at the origin of the etiopathogenic amyloid cascade hypothesis) and phosphorylated tau protein. Furthermore, the prion protein (PrPC) interacts at multiple levels with the metabolism of Aβ, by mechanisms which are not well understood. To overcome the current limits in the development of efficient strategies to treat AD, the pharmaceutical industry requires innovative experimental models. However, even if a lot of progress has been achieved by using transgenic mouse models, to date no in vivo model can reflect the complexity of human brain or reproduce a clinical context. 2D in vitro cell culture models are unable to allow the aggregation and accumulation of pathological proteins as observed in vivo. The aim of this study consists in taking advantage of the research prospects offered by induced pluripotent stem cell (iPSCs) in the field of neurosciences. iPSCs can be used to generate 3D models of differentiation also called human cerebral organoids or mini-brains (MBs). Their ability to self-organise in 3D neuroectodermic tissue leds to a complex system that mimics different human cerebral structures in which we were able to characterize the expected markers. The study of the two proteins of interest (APP and PrPC) during neural differentiation has allowed us to follow the modulation of protein expression level occurring during the in vitro development of the human MBs. In order to use this model to reproduce the protein accumulation mechanisms seen in AD, we have tested chemical inductors such as Aftin-5 in order to modulate the APP post-transcriptional pathway towards a pathological outcome. Many strategies of treatment are adopted to lead APP cleavage and Aβ generation. The production of soluble fragments Aβ38, Aβ40, Aβ42 in the supernatant of organoids has been showed using ELISA technique. The levels generated are reproducible and the increase of Aβ42/Aβ40 ratio is consistent with extrapolated data from mouse and human models thus validating our model. Analysis at the gene and protein level has been assessed in order to understand the interaction between PrPC and APP after treatment. The long-term goal consists in improving this model which is notably hampered by the absence of vascularization and the low level of maturation of the neural tissue. The main challenge in MB culture thus consists in the integration of the vascular system, and also in increasing the speed of ageing process in vitro for the study of neurodegenerative diseases. In the long term, the prospect of automating the culture of MBs would allow the use of the system for cytotoxicity testing and/or high throughput screening for the discovery of new drugs for AD.

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