Orientador: Suzete Aparecida Lanza Destéfano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T14:37:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tonin_MarianaFerreira_D.pdf: 2371085 bytes, checksum: d7c915d664efeec24397b855164c65b9 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Espécies pertencentes ao gênero Xanthomonas são responsáveis por doenças que podem causar grandes perdas econômicas em diversas culturas. Esses fitopatógenos têm sido objeto de diversos estudos taxonômicos resultando em significativas alterações na classificação em nível inter e infraespecífico. O presente estudo teve por objetivo caracterizar taxonomicamente bactérias do gênero envolvendo: (1) diferenciação e análises filogenéticas de espécies do gênero Xanthomonas; (2) esclarecimento da posição taxonômica de linhagens classificadas como Xanthomonas sp.; (3) diferenciação de patovares da espécie X. campestris; (4) desenvolvimento de primers específicos para X. campestris, X. translucens, X. cucurbitae e X. melonis. O par de primers rpoB2F/rpoB3R, desenhado a partir de sequências do gene rpoB, foi empregado em experimentos de amplificas;ao utilizando-se DNAs de 26 espécies do gênero Xanthomonas e os produtos de amplificas;ao (800 pb) foram digeridos com diversas endonucleases. Os perfis de restrição obtidos com a utilização da enzima Hae III permitiram a diferenciação da maioria das espécies, incluindo os patógenos de mesmo hospedeiro como X. albilineans e X. sacchari (patogênicas à cana-de-açúcar); X. cucurbitae . e X. melonis (patogênicas ao melão); X. vesicatoria, X. gardneri e X. euvesicatoria/X. perforans (patogênicas ao tomateiro). Ainda, os produtos de amplificação do gene rpoB foram seqüenciados e a árvore filogenética construída a partir destas sequências também possibilitou a diferenciação das espécies do gênero, indicando que o gene rpoB pode ser considerado um marcador molecular eficiente para o estudo das relações filogenéticas de espécies do gênero Xanthomonas. Os DNAs de linhagens classificadas como Xanthomonas sp. também foram analisados por meio de experimentos de amplificação com primers específicos para a espécie X. axonopodis, de hibridizas;ao DNA-DNA, e analise de multilocus utilizando-se sequências dos genes rpoB, rpoA, atpA, recA e região espaçadora 16S-23S DNAr. Os resultados mostraram que as linhagens de X. sp. pv. viticola, X. sp. pv. betae e X. sp. pv. paulliniae pertencem a espécie X. axonopodis, entretanto, não foi possível definir a posição taxonômica das linhagens de X. sp. pv. arracaciae, X. sp. pv. esculenti e X. sp. pv. eucalypti, embora várias ferramentas tenham sido utilizadas. Assim, somente estudos complementares deverão ser conduzidos visando esclarecer a classificação dessas linhagens. Nesse estudo também foram analisadas as espécies X. campestris, X. translucens, X. cucurbitae e X. melonis. Visando a diferenciação dos patovares da espécie X. campestris, os DNAs destas linhagens foram submetidos a experimentos de PCR-RFLP do gene rpoB e as digestões duplas utilizando-se Cfo I/Mbo I. Os resultados permitiram a diferenciação dos patovares X.c. pv. raphani, X.c. pv. barbariae, X.c. pv. incanae, X.c. pv. armoraciae e X.c. pv. campestris/ X.c. pv. aberrans. Ainda, os dados obtidos nas amilises do gene rpoB permitiram o desenvolvimento de primers específicos para as espécies X. campestris, patogênicas as crucíferas (rpoB2F/xcamR) e X. translucens, patogênicas a gramíneas e cereais (trans1F/trans2R). Alem disso, amilises de sequências da região espaçadora 16S-23S DNAr possibilitaram o desenho do par de primers mecF/mecR, especifico para X. cucurbitae e X. melonis, espécies patogênicas ao melão. A especificidade destes primers foi confirmada em experimentos de amplificação utilizando-se DNAs de algumas bactérias de diferentes gêneros isoladas de mesma espécie de plantas hospedeiras. O nível de sensibilidade da técnica de PCR utilizando-se os primers desenvolvidos foi de 0,1 pg para rpoB/xcam, de 0,01 ng para trans1F/trans2R e de 1 pg para mecF/mecR / Abstract: Xanthomonas species are responsible for diseases causing economic losses in many crops. These phytopathogens have been subject of several taxonomic studies resulting in significant changes at interespecific or infraspecific level. This study aimed the taxonomic characterization of Xanthomonas species including: (1) differentiation and phylogenetic analysis of Xanthomonas species; (2) clarification of taxonomic position of strains classified as Xanthomonas sp.; (3) differentiation of the pathovars of X. campestris; ( 4) development of specific primers for X. campestris, X. translucens, X. cucurbitae and X. melonis. The rpoB2F/rpoB3R primers, designed from rpoB gene sequences, were employed in amplification experiments using DNAs from 26 species of Xanthomonas genus and the products (800 bp) were digested with different restriction enzymes. Profiles using Hae III allowed to differentiate the most species of the genus, including pathogens the affect the same plant host as X. albilineans e X. sacchari (pathogenic to sugarcane); X. cucurbitae e X. melonis (pathogenic to melon); X. vesicatoria, X. gardneri and X. euvesicatoria/X. perforans (pathogenic to tomato). Amplification products of the rpoB gene were sequenced and the phylpgenetic tree constructed from these sequences also allowed the differentiation of the Xanthomonas species, indicating that the rpoB gene can be used as an efficient molecular marker for phylogenetic relationships studies within the Xanthomonas genus. DNA of the strains classified as Xanthomonas sp. were also analysed by the amplification experiments using specific primers for X. axonopodis species, DNA-DNA hybridization and multilocus sequence analysis of the genes rpoB, rpoA, atpA, recA and intergenic spacer region 16S-23S rDNA. Results showed that the strains of X. sp. pv. viticola, X. sp. pv. betae and X. sp. pv. paulliniae belong to X. axonopodis species, however, it was not possible to define the taxonomic position of X. sp. pv. arracaciae, X. sp. pv. esculenti and X. sp. pv. eucalypti, although different approaches have been used. Thus, further studies should be conducted in order to clarify their classification. In this study X. campestris, X. translucens, X. cucurbitae and X. melonis were also analyzed. In order to differentiate the pathovars of the X. campestris specie, the DNAs of these strains were submitted to PCR-RFLP analysis of the rpoB gene and the double digestions using Cfo I/Mbo I allowed the differentiation of the pathovars X. c. pv. raphani, X.c. pv. barbariae, X.c. pv. incanae, X.c. pv. armoraciae and X.c. pv. campestris/ X.c. pv. aberrans. Also, the data obtained in the rpoB gene analysis allowed the development of specific primers for the species X. campestris, pathogenic to crucifers (rpoB2F/xcamR) and X. translucens, pathogenic to grasses and cereals (trans1F/trans2R). Furthermore, intergenic spacer 16S-23S rDNA sequences analysis enabled the development of the mecF/mecR primers, specific for X cucurbitae and X melonis, both pathogenic to melon. The specificity of these primers was confirmed by amplification experiments using DNAs from bacteria belonging to different genera pathogenic to the same plant hosts. Sensitivity level of the PCR technique using the primers developed was 0,1 pg for rpoB/xcam, 0,01 ng for trans1F/trans2R and 1 pg for mecF/mecR / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

B. diazoefficiens CPAC 7 e B. japonicum CPAC 15 são estirpes brasileiras de Bradyrhizobium que apresentam grande relevância para o cultivo da soja, pois são capazes de fornecer nitrogênio para a produção desta leguminosa através do processo de fixação biológica de nitrogênio (FBN), uma técnica sustentável e de baixo custo. Por esse motivo, tais bactérias são de grande interesse, e seu estudo contribui na compreensão do processo complexo e orquestrado por um conjunto de genes específicos que culmina no estabelecimento da simbiose. A estirpe CPAC 7 possui maior eficiência em fixar N2 , e a CPAC 15 destaca-se pela sua competitividade. Recentemente, o genoma de cada uma foi sequenciado na tentativa de conhecer seu conteúdo gênico e identificar os fatores genéticos responsáveis pelas diferenças no desempenho simbiótico. Apesar de ter sido encontrado alguns rearranjos, os genoma mostraram-se sintênicos na sua maioria. Entretanto, o fato de haver muitas transposases ao redor dos genes, principalmente na ilha simbiótica, e devido a presença de muitos genes hipotéticos, representando uma limitação no conhecimento, nos motivou a realizar o presente estudo, onde exploramos estes dois genomas. Portanto, os objetivos deste estudo foram de definir a população de elementos de transposição (TEs) que compõe estes genomas, avaliar se os elementos completos podem estar impactando os genes de alguma forma; explorar as proteínas hipotéticas, tentando identificar novas funções que possam estar associadas com a interação soja-Bradyrhizobium e apontá-las para estudos experimentais futuros; e ainda explorar os genes exclusivos das regiões atípicas dos genomas, sendo que para isso, nós também desenvolvemos uma nova metodologia, baseada na máxima entropia (ME), que pode ser utilizada em novos estudos genômicos a partir da simples sequência nucleotídica. Todas as análises deste estudo foram realizadas in silico. Estudando os TEs, identificamos 33 novas sequências de inserção, sendo que algumas destacaram-se por terem potencial impacto nos genes associados com a simbiose destas bactérias, como nopAN, nopAG, rhcU, modC e hypB. Explorar as proteínas hipotéticas nos permitiu reduzir a porcentagem de hipotéticas dos genomas. Adicionamos novas informações à 1.204 proteínas, das quais muitas apresentaram similaridade com proteínas comprovadamente associadas com a interação planta-bactéria, em condições de simbiose e/ou patogenicidade, como proteínas envolvidas na motilidade e adesão celular, fatores de virulência, proteínas secretoras e efetoras, entre outras. Além disso, a metodologia ME, desenvolvida neste estudo com o intuito de direcionar análises genômicas para regiões atípicas, quando comparada com outras ferramentas existentes, mostrou-se superior em termos de eficiência e tempo de execução computacional. Nas regiões genômicas apontadas pela ME nos dois genomas de interesse, identificamos 269 genes exclusivos de CPAC 7 e 368 de CPAC 15, sendo que destacamos aqueles com potencial relação com as diferenças simbióticas das estirpes, como o gene fixW, noeE, rtxA e nex18. Assim, os resultados obtidos neste trabalho vêm expandir nosso conhecimento sobre os genomas destas estirpes. Destacando ainda, importantes diferenças que podem estar associadas com a habilidade simbiótica de cada bactéria. / B. diazoefficiens CPAC 7 and B. japonicum CPAC 15 are Brazilian Bradyrhizobium strains of great importance for soybean cultivation, since when in a symbiotic state they provide nitrogen for the crop through the biological nitrogen fixation process (BNF), a sustainable technique and low cost. For this reason, such bacteria represent great interest and have been widely studied, once the symbiotic establishment is a complex process and orchestrated by a specific set of genes. The CPAC 7 strain has a higher efficiency to fix N2 , while CPAC 15 stands out for its competitiveness. Recently, their genomes were sequenced in an attempt to gain knowledge about their gene content and to identify the genetic factors responsible for differences in their symbiotic performance. Despite having identified some rearrangements, the majority of genomes showed syntenic. However, the fact that there are many transposases around the genes, especially in symbiotic island, and due to the presence of many hypothetical genes, representing a limitation on knowledge, motivated us to conduct this study, which explored these two important genomes. Therefore, the objectives of this study were to define the population of transposable elements (TEs) present in these genomes and to verify whether such TEs could be impacting the genes somehow; to study the hypothetical proteins, trying to identify new features that may be associated with the soybean-Bradyrhizobium interaction and point them for future experimental studies; and to explore the exclusive genes from atypical regions of both genomes, and for that, we have also developed a new methodology, based on maximum entropy (ME), which can be used in new genomic studies. All analyzes in this study were performed in silico. Studying the TEs, we identified 33 new insertion sequences, and some stood out for having potential impact on genes associated with the symbiosis of these bacteria, such as nopAN, nopAG, rhcU, modC and hypB. As a consequence of improving the annotation of hypothetical proteins we were able to reduce the hypothetical percentage. Among these, we add new information to 1,204 proteins, many of which had similarity to proteins with involvement in the plant-bacteria interaction, in symbiosis and/or pathogenicity conditions, such as proteins involved in cell motility and adhesion, virulence factors, secretion proteins, effectors, among others. Moreover, the ME methodology developed in this study to direct genomic analysis to atypical regions, compared with other existing tools, it was superior in efficiency and execution time. In the genomic regions identified by the ME in both Bradyrhizobium genomes, we identified 269 exclusive genes of CPAC 7 and 368 of CPAC 15, we highlighted those with potential involvement with symbiotic differences of strains, as fixW, noeE, rtxA and nex18. Thus, the results obtained in this study come to expand our knowledge about the genomes of these important bacteria. Finally, differences were identified as potential targets to be associated with the symbiotic ability of each strain to be futher studied.

Vibrio cholerae é uma bactéria autóctone em ecossistemas aquáticos, os fatores responsáveis pela virulência podem contribuir com a patogenicidade, influenciados por fatores genéticos e ambientais. Considerando a importância de conhecer e monitorar o V. cholerae, o estudo pretende caracterizar isolados da especie e padronizar uma metodologia para detecção em amostras de água. Os isolados foram avaliados por metodologias clássicas e moleculares, para confirmar espécie. Também, foi avaliada a presença de genes de virulência, susceptibilidade aos antibióticos e resposta em modelo invertebrado. Tres marcadores moleculares foram avaliados por PCR quantitativa. Observou-se que setenta dos isolados pertenciam a espécie V. cholerae e mostraram variação na prevalência dos genes de virulência e ao perfil de suscetibilidade ao antibióticos. Mostrou uma influencia da temperatura e concentração do inoculo no modelo invertebrado. Os marcadores moleculares selecionados mostraram a viabilidade da metodologia proposta neste estudo pela alta especificidade e sensibilidade. / Vibrio cholerae is an autochthonous bacterium in aquatic ecosystems, factors responsible for virulence may contribute to pathogenicity, influenced by genetic and environmental factors. Considering the importance of knowing and monitoring V. cholerae, the study pretend to characterize selected isolates and to standardize a methodology for detection in water samples. The isolates were evaluated by classical and molecular methodologies to confirm species. Also, the presence of factors associated with virulence, antibiotics susceptibility and response in invertebrate model were evaluated. Three molecular markers were evaluated by quantitative PCR. It was observed that seventy of the isolates belonged to the V. cholerae species and showed a variation in the prevalence of the virulence genes and the antibiotic susceptibility profile. Also, showed an influence of the inoculum temperature and concentration on the invertebrate model. The selected molecular markers showed the viability of the methodology proposed in this study for the high specificity and sensitivity.

Vibrio cholerae é uma bactéria autóctone em ecossistemas aquáticos, os fatores responsáveis pela virulência podem contribuir com a patogenicidade, influenciados por fatores genéticos e ambientais. Considerando a importância de conhecer e monitorar o V. cholerae, o estudo pretende caracterizar isolados da especie e padronizar uma metodologia para detecção em amostras de água. Os isolados foram avaliados por metodologias clássicas e moleculares, para confirmar espécie. Também, foi avaliada a presença de genes de virulência, susceptibilidade aos antibióticos e resposta em modelo invertebrado. Tres marcadores moleculares foram avaliados por PCR quantitativa. Observou-se que setenta dos isolados pertenciam a espécie V. cholerae e mostraram variação na prevalência dos genes de virulência e ao perfil de suscetibilidade ao antibióticos. Mostrou uma influencia da temperatura e concentração do inoculo no modelo invertebrado. Os marcadores moleculares selecionados mostraram a viabilidade da metodologia proposta neste estudo pela alta especificidade e sensibilidade. / Vibrio cholerae is an autochthonous bacterium in aquatic ecosystems, factors responsible for virulence may contribute to pathogenicity, influenced by genetic and environmental factors. Considering the importance of knowing and monitoring V. cholerae, the study pretend to characterize selected isolates and to standardize a methodology for detection in water samples. The isolates were evaluated by classical and molecular methodologies to confirm species. Also, the presence of factors associated with virulence, antibiotics susceptibility and response in invertebrate model were evaluated. Three molecular markers were evaluated by quantitative PCR. It was observed that seventy of the isolates belonged to the V. cholerae species and showed a variation in the prevalence of the virulence genes and the antibiotic susceptibility profile. Also, showed an influence of the inoculum temperature and concentration on the invertebrate model. The selected molecular markers showed the viability of the methodology proposed in this study for the high specificity and sensitivity.

Orientador: Suzete Aparecida Lanza Destéfano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T18:58:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Correa_DanieleBussioliAlves_M.pdf: 2704976 bytes, checksum: 40df9160618a30b2959f8df5ff93e585 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A batata ocupa o quarto lugar em volume de produção mundial de alimentos após o arroz, trigo e milho. O Brasil é o maior produtor dentre os países da América Latina, porém ainda apresenta baixa produtividade devida às doenças que afetam a cultura. Dentre as doenças bacterianas, a sarna da batata é uma das mais importantes economicamente e sua ocorrência é generalizada no mundo. Diferentes espécies do gênero Streptomyces estão associadas à essa doença e os principais sintomas se caracterizam por lesões irregulares que podem tomar toda a superfície do tubérculo, acarretando diminuição do seu valor comercial ou, até mesmo, impedindo a sua comercialização. Atualmente, a incidência da sarna está aumentando consideravelmente, tornando-se um fator limitante do cultivo de batata no Brasil. O presente trabalho teve por objetivo a identificação de linhagens de Streptomyces sp. associadas à sarna da batata, provenientes de diferentes regiões produtoras do Brasil, por meio de taxonomia polifásica. Cento e noventa linhagens de Streptomyces foram analisadas, sendo 165 nacionais obtidas dos estados da Bahia, Goiás, Minas Gerais, Paraná, São Paulo, Rio Grande do Sul e Santa Catarina; 13 de material vegetal importado do Chile, França e Holanda; e 12 linhagens Tipo de Streptomyces representantes de espécies associadas à sarna. Na caracterização morfológica as linhagens apresentaram heterogeneidade com relação à micromorfologia de hifas e coloração dos esporos. A patogenicidade das linhagens foi avaliada pela presença dos genes nec1, tomA (tomatinase) e txtAB (taxtomina A) e os resultados indicaram que 94 linhagens (52,8%) apresentaram amplificação dos três genes de patogenicidade avaliados, 14 (7,9%) não apresentaram nenhum dos genes e 70 (39,3%) mostraram sinal positivo de amplificação para um ou mais genes. Para algumas linhagens a confirmação da patogenicidade foi efetuada por meio de testes em minitubérculos de batata. Nos testes moleculares, incluindo amplificação com primers específicos para S. scabiei e S. turgidiscabies, PCR-RFLP do gene atpD e análises das seqüências dos genes atpD, gyrB, recA, rpoB e trpB, foi possível a separação das linhagens analisadas em diferentes perfis genéticos. As análises das características morfológicas, patogênicas e moleculares permitiram a identificação de 57 linhagens pertencentes à S. scabiei, 28 à espécie S. ipomoeae, 13 à S. caviscabies/S. setonii, 12 à S. europaeiscabiei e duas à S. sampsonii. As 66 linhagens restantes apresentaram características distintas das espécies Tipo testadas, podendo representar possíveis novas espécies de Streptomyces associadas à sarna no Brasil / Abstract: Potato is the world's fourth most important food crop after rice, wheat and maize. Brazil is the biggest producer among the countries of Latin America, but it still has low productivity due to diseases that affect the crop. Among the bacterial diseases, the potato scab is one of the most economically important, and its occurrence is widespread in the world. Different species of the genus Streptomyces are associated with this disease and the main symptoms are characterized by irregular lesions that can affect all the tuber surface causing decrease of its commercial value or preventing its commercialization. Currently, the incidence of potato scab is increasing considerably, becoming a limiting factor in potato production in Brazil. This study aimed to identify Streptomyces strains associated with potato scab, from different potato growing areas in Brazil, through polyphasic taxonomy. One hundred and ninety strains of Streptomyces were analyzed, including 165 Brazilian strains obtained from potatoes coming from the states of Bahia, Goias, Minas Gerais, Parana, Sao Paulo, Rio Grande do Sul and Santa Catarina; 13 of plant material from Chile, France and Netherlands; and 12 type strains of Streptomyces species associated with potato scab. In the morphological characterization, the strains showed heterogeneity in the hyphal micromorphology and color of spores. The pathogenicity of strains was investigated by presence of the nec1 and tomA genes, and txtAB operon (thaxtomin A). The results indicated that 94 strains (52.8%) showed amplification of the three pathogenicity genes, 14 (7.9%) showed no amplification of the genes and 70 (39.3%) showed positive signal for only one or more genes. The pathogenicity of some strains was confirmed with artificial inoculation onto potato minitubers. In the molecular tests, including PCR amplification with specific primers for S.scabiei and S. turgidiscabies, analysis of PCR-RFLP of atpD gene and sequences analysis of the atpD, gyrB, recA, rpoB and trpB genes, the strains could be separated into different genetic profiles. The morphological, pathogenic and molecular data allowed identifying of 57 strains belonging to S. scabiei, 28 to S. ipomoeae, 13 to S. caviscabies/S. setonii, 12 to S. europaeiscabiei and two to S. sampsonii. The 66 remaining strains showed different genetic profiles in comparison with the type strains of Streptomyces, and may represent new species of Streptomyces associated with potato scab in Brazil / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular