Les maladies amyloïdes sont des affections sévères caractérisées par la présence de dépôts extracellulaires fibreux susceptibles de toucher un ou plusieurs tissus du corps humain. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée au peptide β amyloïde (Aβ), impliqué dans la maladie d’Alzheimer, ainsi que l’amyline ou Islet Amyloid PolyPeptide (IAPP), impliqué dans le diabète de type 2. Le mécanisme de formation des fibres a été décrit comme un processus en deux étapes : la nucléation, conduisant à la formation d’oligomères et la phase d’élongation conduisant à la formation des fibres. La première partie de ma thèse est consacrée à l’étude des premières étapes d’oligomérisation d’IAPP. Ce projet, qui a fait appel à différentes techniques biophysiques, a permis de montrer que le mécanisme d’oligomérisation d’IAPP était coopératif et caractérisé par l’absence d’espèces de faible poids moléculaire en solution. Ensuite, je me suis intéressée au rôle de l’histidine 18 d’IAPP et l’effet de la charge globale du peptide sur ses propriétés d’oligomérisation. Pour cela, une étude mutationnelle a été réalisée et l’analyse biophysique des mutants en présence de modèles lipidiques a été effectuée à pH 5,5 et à pH 7,4. Les résultats de cette étude ont montré que la substitution du résidu 18 ralentissait la formation des fibres et que le pH acide était globalement défavorable à l’oligomérisation. Enfin, j’ai étudié les interactions entre les peptides amyloïdes et des inhibiteurs potentiels d’origine synthétique ou naturelle. Différents modes d’action de ces inhibiteurs ont ainsi pu être caractérisés, selon leur interaction avec les monomères ou les oligomères des peptides étudiés. / Amyloid diseases, including Alzheimer's (AD), Parkinson's, Prion diseases and type 2 diabetes mellitus (T2DM), are characterized by the accumulation of insoluble fibrillar aggregates in tissues. These diseases are the result of the aberrant folding of proteins that constitute the main component of the fibrils. My thesis project focused on two amyloid peptides: β-amyloid peptide, a 40/42 residue peptide involved in AD, and Islet Amyloid PolyPeptide (IAPP), a 37 residue peptide linked with T2DM. Although the mechanism of oligomerization is still unclear, it is known to be a stepwise process that includes a nucleation phase, where the peptides are mainly monomeric and slowly form aggregates, followed by an elongation phase, characterized by the formation of large prefibrillar oligomers leading to mature fibrils. A first part of my project focused on the early stages of fibrillation of IAPP, using a set of complementary biophysical techniques. This study showed that the oligomerization pathway of IAPP involved no or short time lived oligomers favoring the formation of large aggregates. In a second step, I investigated the effect of residue 18 and global charge of IAPP by a mutational analysis of residue His18 and biophysical analysis at pH 5.5 and 7.4. The results showed that (1) the substitution of His18 slowed down the kinetics of fibrillation of IAPP by affecting the interactions between monomers, (2) acidic pH was unfavorable for the process. Finally, we examined the interaction of amyloid peptides with potential inhibitors of synthetic (sugar or fluor-based peptides) or natural origin (epigallocatechingallate). Different mechanisms of action could be characterized.

L’acétylation des résidus de glucosamine terminaux par la N-acétyltransférase lysosomale (HGSNAT) est une étape essentielle de la dégradation catabolique de l’héparan sulfate. Des défauts dans cette réaction causent une maladie de surcharge lysosomale autosomale récessive rare : le désordre de Sanfilippo type C (SFC). À ce jour, 54 mutations ont été rapportées chez des patients SFC, incluant 13 mutations des sites d’épissage, 11 insertions et délétions, 8 mutations non-sens, 18 mutations faux-sens et 4 polymorphismes, avec différentes manifestations phénotypiques. Nous avons identifié 10 d’entre elles et effectué une étude exhaustive portant sur l’éventail des mutations SFC, leur distribution dans la population de patients, ainsi que leur impact potentiel sur la structure de la HGSNAT. Les erreurs d’épissage, les mutations non-sens, les insertions et les délétions devraient toutes entraîner un ARN non fonctionnel qui est rapidement dégradé par des mécanismes de contrôle qualité cellulaire. Les 4 polymorphismes identifiés sont des changements d'acides aminés qui ne modifient pas l'activité enzymatique, la glycosylation ou la localisation et n'ont donc pas de signification au niveau clinique. Au niveau des enzymes, les polymorphismes sont des changements d’acides aminés qui n’affectent pas la fonction, mais dans un contexte d’acides nucléiques ils peuvent être considérés comme des mutations faux-sens. Les dix-huit mutations faux-sens qui ont été exprimées ont produit des protéines inactives, en raison d'erreurs dans leur repliement. Ceci expliquerait donc la progression sévère de la maladie chez les personnes porteuses de ces mutations. Les protéines mutantes mal repliées sont anormalement glycosylées et conservées dans le réticulum endoplasmique. La thérapie par amélioration de l’activité enzymatique par des chaperonnes est une option thérapeutique potentielle, spécifiquement conçue pour exploiter l'activité enzymatique résiduelle de mutants mal repliés, afin d’éliminer les substrats stockés. Nous avons démontré que le traitement de plusieurs lignées de fibroblastes de patients SFC avec le chlorhydrate de glucosamine, un inhibiteur spécifique de la HGSNAT, a partiellement restauré l’activité de l'enzyme mutante, fournissant une preuve de l’utilité future de la thérapie par des chaperonnes dans le traitement de la maladie de SFC. / The acetylation of terminal glucosamine residues by lysosomal N-acetyltransferase (HGSNAT) is an essential part of the catabolic breakdown of heparan sulfate. Defects in this reaction result in the rare autosomal recessive lysosomal storage disorder Sanfilippo syndrome type C (SFC). To date 54 mutations in SFC patients have been reported including 13 splice-site mutations, 11 insertions and deletions, 8 nonsense, 18 missense and 4 polymorphisms, with different phenotypic manifestations. We have identified 10 of them and conducted a comprehensive review discussing the spectrum of Sanfilippo C mutations, their distribution within the patient population as well as how the mutations could potentially affect the structure of HGSNAT. Splicing errors, nonsense mutations, insertions and deletions were all predicted to result in non-functional RNA which is rapidly degraded by cellular quality control mechanisms. The 4 identified polymorphisms resulted in amino acid changes which did not affect the enzyme activity, glycosylation or targeting and were therefore not clinically significant. Polymorphisms, in the context of enzymes are amino acid changes not affecting function, but in the context of nucleic acids can still be considered as missense mutations. Eighteen missense mutations were expressed and shown be inactive due to errors in protein folding providing an explanation for the severe disease progression seen in individuals with these mutations. Misfolded mutants were abnormally glycosylated and retained in the endoplasmic reticulum. Enzyme enhancement/chaperone therapy is a potential treatment option specifically designed to exploit the residual enzyme activity of misfolded mutants in order to clear stored substrates. We demonstrated that treatment of several fibroblast lines of SFC patients with a specific inhibitor of HGSNAT; glucosamine-hydrochloride partially rescued mutant enzyme activity providing a proof of principle for the future use of chaperone therapeutics in the treatment of SFC.

L’acétylation des résidus de glucosamine terminaux par la N-acétyltransférase lysosomale (HGSNAT) est une étape essentielle de la dégradation catabolique de l’héparan sulfate. Des défauts dans cette réaction causent une maladie de surcharge lysosomale autosomale récessive rare : le désordre de Sanfilippo type C (SFC). À ce jour, 54 mutations ont été rapportées chez des patients SFC, incluant 13 mutations des sites d’épissage, 11 insertions et délétions, 8 mutations non-sens, 18 mutations faux-sens et 4 polymorphismes, avec différentes manifestations phénotypiques. Nous avons identifié 10 d’entre elles et effectué une étude exhaustive portant sur l’éventail des mutations SFC, leur distribution dans la population de patients, ainsi que leur impact potentiel sur la structure de la HGSNAT. Les erreurs d’épissage, les mutations non-sens, les insertions et les délétions devraient toutes entraîner un ARN non fonctionnel qui est rapidement dégradé par des mécanismes de contrôle qualité cellulaire. Les 4 polymorphismes identifiés sont des changements d'acides aminés qui ne modifient pas l'activité enzymatique, la glycosylation ou la localisation et n'ont donc pas de signification au niveau clinique. Au niveau des enzymes, les polymorphismes sont des changements d’acides aminés qui n’affectent pas la fonction, mais dans un contexte d’acides nucléiques ils peuvent être considérés comme des mutations faux-sens. Les dix-huit mutations faux-sens qui ont été exprimées ont produit des protéines inactives, en raison d'erreurs dans leur repliement. Ceci expliquerait donc la progression sévère de la maladie chez les personnes porteuses de ces mutations. Les protéines mutantes mal repliées sont anormalement glycosylées et conservées dans le réticulum endoplasmique. La thérapie par amélioration de l’activité enzymatique par des chaperonnes est une option thérapeutique potentielle, spécifiquement conçue pour exploiter l'activité enzymatique résiduelle de mutants mal repliés, afin d’éliminer les substrats stockés. Nous avons démontré que le traitement de plusieurs lignées de fibroblastes de patients SFC avec le chlorhydrate de glucosamine, un inhibiteur spécifique de la HGSNAT, a partiellement restauré l’activité de l'enzyme mutante, fournissant une preuve de l’utilité future de la thérapie par des chaperonnes dans le traitement de la maladie de SFC. / The acetylation of terminal glucosamine residues by lysosomal N-acetyltransferase (HGSNAT) is an essential part of the catabolic breakdown of heparan sulfate. Defects in this reaction result in the rare autosomal recessive lysosomal storage disorder Sanfilippo syndrome type C (SFC). To date 54 mutations in SFC patients have been reported including 13 splice-site mutations, 11 insertions and deletions, 8 nonsense, 18 missense and 4 polymorphisms, with different phenotypic manifestations. We have identified 10 of them and conducted a comprehensive review discussing the spectrum of Sanfilippo C mutations, their distribution within the patient population as well as how the mutations could potentially affect the structure of HGSNAT. Splicing errors, nonsense mutations, insertions and deletions were all predicted to result in non-functional RNA which is rapidly degraded by cellular quality control mechanisms. The 4 identified polymorphisms resulted in amino acid changes which did not affect the enzyme activity, glycosylation or targeting and were therefore not clinically significant. Polymorphisms, in the context of enzymes are amino acid changes not affecting function, but in the context of nucleic acids can still be considered as missense mutations. Eighteen missense mutations were expressed and shown be inactive due to errors in protein folding providing an explanation for the severe disease progression seen in individuals with these mutations. Misfolded mutants were abnormally glycosylated and retained in the endoplasmic reticulum. Enzyme enhancement/chaperone therapy is a potential treatment option specifically designed to exploit the residual enzyme activity of misfolded mutants in order to clear stored substrates. We demonstrated that treatment of several fibroblast lines of SFC patients with a specific inhibitor of HGSNAT; glucosamine-hydrochloride partially rescued mutant enzyme activity providing a proof of principle for the future use of chaperone therapeutics in the treatment of SFC.